本发明属于医药
技术领域：
，尤其涉及黑龙贝母碱在制备预防和/或治疗手足口病的药物中的应用。
背景技术：
：手足口病是由病毒引起的儿童传染病，为我国法定丙类传染病。该病主要感染0-6岁的婴幼儿，以2-3岁儿童感染最为常见，手足口病发病初期在患儿四肢末端以及口腔等出引起疱疹或溃疡，患儿多在1-2周内痊愈。然而，少数病例病情进展迅速，可在发病1-5天左右出现脑膜炎、无菌性脑炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、肺水肿以及循环障碍等，极少数病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遗症。根据世界卫生组织报告，能够引起手足口病症状的病毒大约有20多种，其中以肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirusA16，CoxA16)最为常见，由这两种病毒感染引起的病例数约占总病例数80％以上。其他能够引起手足口病的病毒主要包括：柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型(CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯萨奇病毒B组2和5型(CoxB2和CoxB5)以及埃可病毒(ECHO)等。目前，尽管针对EV71病毒的疫苗已经获批上市，但仍没有直接靶向病毒的药物，临床主要采取对症治疗的策略。临床常见的抗手足口病药物有利巴韦林、阿昔洛韦、伐昔洛韦等，但是这些药副作用较强。近年来，中药抗手足口病的研究逐渐引起人们的关注，而且由于很多中药组分属于天然提取药物，具有副作用小等优点。黑龙贝母碱(Heilonine)，是从平贝母(Fritillariaussuriensis)、浙贝母(Fritillariathunbergii)、彭泽贝母(Fritillariamonantha)中提取的生物碱类成分。药理学研究表明黑龙贝母碱具有镇咳、祛痰、镇痛抗炎、松弛气管平滑肌、抗菌等多种作用。目前未见黑龙贝母碱在制备预防和/或治疗手足口病药物中应用的报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供黑龙贝母碱在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。本发明研究表明，黑龙贝母碱对肠道病毒、柯萨奇病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率，抗病毒活性明显。因此本发明提供了黑龙贝母碱在制备预防和/或治疗手足口病的药物中的应用。优选的，所述的引起手足口病的病毒为肠道病毒。优选的，所述肠道病毒为柯萨奇病毒。进一步，优选的，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。优选的，所述肠道病毒为肠道病毒EV71型。优选的，所述黑龙贝母碱的活性剂量为50-200mg/kg/d。优选的，所述药物包括黑龙贝母碱和药学上可接受的载体。优选的，所述药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。优选的，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。优选的，所述口服给药剂型的药物中，黑龙贝母碱的质量分数为17.5-88％。优选的，所述口服给药剂型的每天的口服剂量为0.5-2.5mg黑龙贝母碱/kg人体体重。本发明提供黑龙贝母碱在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用，本发明实验结果表明，黑龙贝母碱对肠道病毒、柯萨奇病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率；同时在体内可以抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，从而具有治疗手足口病的作用；并可预防病毒在体内的增殖和扩散，保护正常组织免受损伤，起到预防病毒感染性疾病发生的作用。本发明具有下述有益效果之一：1、黑龙贝母碱是一种天然小分子化合物，其对柯萨奇病毒A16、肠道病毒EV71，EC50分别为116.87μmol/L、152.14μmol/L，SI分别为7.40、5.68。2、黑龙贝母碱能够剂量依赖地抑制柯萨奇病毒A16、肠道病毒EV71病毒感染，呈剂量依赖关系。3、黑龙贝母碱缓解病毒引起的症状、减轻病毒感染导致的死亡；延长病毒感染小鼠生存时间，提高小鼠存活率。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种黑龙贝母碱在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。在本发明中，所述黑龙贝母碱具有式Ⅰ所示结构，属于生物碱类，药理研究表明，黑龙贝母碱具有镇咳、祛痰、镇痛抗炎、松弛气管平滑肌、抗菌等多种作用。所述黑龙贝母碱优选为黑龙贝母碱单体和/或黑龙贝母碱提取物，所述黑龙贝母碱提取物中，单体黑龙贝母碱的含量优选在90％以上，本发明可按照常规方法从含有黑龙贝母碱的中药材或者中药饮片中提取得到，如平贝母，也可购买黑龙贝母碱的市售商品。具体的，在本发明的实施例中，可采用中国药品生物制品检定所提供的黑龙贝母碱。本发明提供了一种黑龙贝母碱在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。其中，所述的引起手足口病的病毒包括肠道病毒。优选的，所述肠道病毒为柯萨奇病毒。进一步，优选的，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。优选的，所述肠道病毒为肠道病毒EV71型。在本发明中，所述预防和/或治疗手足口病药物包括黑龙贝母碱和药学上可接受的载体。在本发明中，所述药学上可接受的载体。优选为淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油中的一种或几种。所述预防和/或治疗手足口病可以为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。优选的，所述预防和/或治疗手足口病药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。其中，所述口服给药剂型的抗手足口病药物中，黑龙贝母碱的质量分数为22.5-88％，更优选为20-80％，最优选为25-75％。本发明中，所述黑龙贝母碱的活性剂量优选为50-200mg/kg/d；更优选为100-200mg/kg/d。在本发明中，所述预防和/或治疗手足口病药物每天的口服剂量为0.5-2.5mg黑龙贝母碱/kg人体体重，更优选为0.625-2.0mg黑龙贝母碱/kg体重。本发明对所述包含黑龙贝母碱的预防和/或治疗手足口病的药物的制备方法没有特殊的限制，按照本领域技术人员常用的制药方法即可。本发明提供了一种黑龙贝母碱在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用，本发明采用了结晶紫法测定了黑龙贝母碱对柯萨奇病毒A16型和肠道病毒EV71型的抑制活性，结果表明，黑龙贝母碱在体外对柯萨奇病毒A16、肠道病毒EV71，EC50分别为116.87μmol/L、152.14μmol/L，SI分别为7.40、5.68。本发明以灌胃(口服)的方式进行了黑龙贝母碱对肠道病毒EV71型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，黑龙贝母碱在剂量50/100/200mg/kg/day时灌胃给药5天，小鼠的存活率分别为30％、40％和70％，死亡保护率分别为70％、40％和30％，阳性对照药利巴韦林的小鼠存活率为60％，死亡保护率60％；本发明以灌胃(口服)的方式进行了黑龙贝母碱对柯萨奇病毒A16型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，黑龙贝母碱在剂量50/100/200mg/kg/day时灌胃给药5天，小鼠的存活率分别为30％、50％和80％，死亡保护率分别为30％、50％和80％，阳性对照药利巴韦林的小鼠存活率为60％，死亡保护率60％，可见，黑龙贝母碱与阳性对照药利巴韦林对甲型流感病毒的抑制效果相似，黑龙贝母碱可以抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，从而具有预防和/或治疗手足口病的作用。为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的黑龙贝母碱在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。如无特殊说明，以下实施例中所用的试剂均为市售。实施例1黑龙贝母碱体外抗手足口病毒活性实验1、实验材料：柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，购于美国ATCC细胞库，由江苏康缘现代中药研究院保存。DMEM培养基，购自南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20141024，细胞生长液中含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素。细胞维持液中除含2％胎牛血清外，其它同细胞生长液。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml:0.1g，批号：140312。M2e型酶标仪，MolecularDevices；移液器，eppendorf公司；生物安全柜，购自HealForce公司，型号：HFsafe-1200；二氧化碳培养箱，购自ThermoScientific公司，型号：FormaSteri-Cycle371。2、实验方法：Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)用含2％胎牛血清的DMEM培养基按5×104个/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl，置37℃5％CO2培养箱中培养过夜形成细胞单层。弃上清后，用PBS将细胞洗涤1次，以洗去残留的胎牛血清，加入用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释至100TCID50各株病毒，每孔100μl，35℃孵育2h后，弃去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培养基将黑龙贝母碱配制成不同浓度，分别加入单层Vero细胞中，设3个复孔，Vero细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，每日观察细胞病变现象。48h后，弃上清后，加入100μl10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)结晶紫染色15min，酶标仪570nm测定吸光度。实验共重复3次。计算黑龙贝母碱对两种肠道病毒细胞的CC50(半数毒性浓度)、EC50(半数有效浓度)、SI(选择指数)。表1黑龙贝母碱体外抗病毒试验(μM)表1结果显示：黑龙贝母碱对肠道病毒型EV71、CoxA16病毒具有一定的抑制作用，EC50分别为152.14μM和116.87，SI分别为5.68和7.40，实验结果表明黑龙贝母碱对以上毒株体外复制具有抑制作用，提高了病毒感染细胞的存活率，具备应用于柯萨奇病毒A16、肠道病毒71型感染治疗的体外药效学基础。实施例2黑龙贝母碱对肠道病毒EV71感染的治疗作用1、实验材料：肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。SPF级怀孕15～16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18～28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml：0.1g，批号：140312。2、实验方法：3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林组100mg/kg/d、黑龙贝母碱低剂量组50mg/kg/d，中剂量组100mg/kg/d，高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射肠道病毒EV71液(107TCID50)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度，0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。表2黑龙贝母碱治疗给药对肠道病毒EV71感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)组别剂量(mg/kg)0分1分2分3分4分5分P正常组-1000000-模型组-0000010-利巴韦林组100000235<0.01高剂量组200033213<0.01中剂量组100002116<0.01低剂量组50000127<0.05注：P与模型组比较表3黑龙贝母碱对肠道病毒EV71感染Babl/c乳鼠的死亡保护作用注：**P<0.01，*P<0.05与模型组比较表2结果显示，黑龙贝母碱各剂量组进行治疗性给药后，可以显著减缓肠道病毒EV71感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异。黑龙贝母碱高、中、低剂量的死亡保护率分别为70％、40％、30％，生命延长率分别为77.51％、48.53％、33.66％，表明黑龙贝母碱各剂量组感染程度均明显减少肠道病毒EV71感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示黑龙贝母碱对肠道病毒EV71感染具有治疗作用。实施例3黑龙贝母碱对柯萨奇病毒CoxA16感染的治疗作用1、实验材料：柯萨奇病毒A16型(CoxA16)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。SPF级怀孕15～16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18～28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml：0.1g，批号：140312。2、实验方法：3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林组100mg/kg/d、黑龙贝母碱低剂量组50mg/kg/d，中剂量组100mg/kg/d，高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射柯萨奇病毒CoxA16液(107TCID50)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度，0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。表4黑龙贝母碱治疗给药对柯萨奇病毒CoxA16感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)组别剂量(mg/kg)0分1分2分3分4分5分P正常组-1000000-模型组-0000010-利巴韦林组100000244<0.01高剂量组200033212<0.01中剂量组100002116<0.01低剂量组50000217<0.05注：P与模型组比较表5黑龙贝母碱对柯萨奇病毒CoxA16感染Babl/c乳鼠的死亡保护作用注：**P<0.01，*P<0.05与模型组比较表4结果显示，黑龙贝母碱各剂量组进行治疗性给药后，可以显著减缓柯萨奇病毒CoxA16感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异。黑龙贝母碱高、中、低剂量的死亡保护率分别为80％、50％和30％，生命延长率分别为89.85％、52.82％和34.42％，表明黑龙贝母碱各剂量组感染程度均明显减少柯萨奇病毒CoxA16感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示黑龙贝母碱对柯萨奇病毒CoxA16感染具有治疗作用。实施例4黑龙贝母碱在制备胶囊剂药物中的应用将350g黑龙贝母碱和32g淀粉、6g低取代羟丙基纤维素、4.5g微粉硅胶、1.5g硬脂酸镁、及适量10％淀粉浆混合，装入胶囊，得到黑龙贝母碱的胶囊制剂1000粒。每日3次，每次1粒。实施例5黑龙贝母碱在制备颗粒剂药物中的应用将350g黑龙贝母碱和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常规方法制成1000包黑龙贝母碱颗粒剂。每日3次，每次1粒。实施例6黑龙贝母碱在制备片剂药物中的应用将350g黑龙贝母碱和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉钠、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸镁及适量10％淀粉浆适混合，按照常规方法制成黑龙贝母碱片剂1000片。每日3次，每次1片。实施例7黑龙贝母碱在制备丸剂药物中的应用将350g黑龙贝母碱和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、适量液状石蜡混合，按照常规方法制成黑龙贝母碱丸剂1000粒。每日3次，每次1粒。实施例8黑龙贝母碱在制备注射剂药物中的应用将200g黑龙贝母碱和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常规方法制成黑龙贝母碱注射剂1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL5％葡萄糖注射液稀释后静脉滴注。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3