脐带血在治疗早产并发症中的用途的制作方法

1.技术领域

本发明涉及用于治疗婴儿包括早产儿的一种或多种病症或疾病的组合物和方法，其通过向此类婴儿施用脐带血和任选的胎盘干细胞和/或血液添加剂来实现。

2.

背景技术：

足月婴儿在子宫中度过37到42周。早于37周出生的婴儿被认为是早产儿。早产是生命第一个月内死亡的主要原因，同时也是公众最为担心的问题。根据美国出生缺陷基金会统计，在2002年美国有480,812例早产(占所有活产的12.1％)，早产儿的医疗护理费用为155亿美元。

提前生产和分娩的风险因素包括母亲的年龄(低于18岁或高于35岁)、感染、糖尿病、高血压、吸烟、多胎妊娠和物质滥用。

目前，约23到约25周妊娠出生婴儿的存活率在约20％(23周妊娠婴儿)到约65％(25周妊娠婴儿)之间变化。该年龄组存活婴儿约三分之一发育正常；约三分之一患有轻微或中度缺陷；约三分之一患有严重缺陷。

约26到约29周妊娠出生的早产儿的存活率为26周妊娠出生的婴儿约75％和29周妊娠出生的婴儿约85％。此类存活的早产儿约40％发育正常，而约40％患有轻微或中度缺陷，约20％患有一种或多种严重缺陷。

约30到约33周妊娠出生的早产儿中90-95％存活。这些早产儿约65％发育正常，而约20％患有轻微或中度缺陷，这些早产儿约15％患有一种或多种严重缺陷。

虽然约34到约37周妊娠出生的早产儿不如足月婴儿成熟，但其存活率(约95％)几乎与足月婴儿的存活率相同，并且其长期前景与任何足月婴儿相同。

早产儿的身体特征包括例如身材小；出生体重低；呼吸不规则；以及器官或系统发育不全，例如肺、免疫系统和脑。与早产儿有关的普遍问题包括但不限于贫血症、低血压症、高胆红素血症、感染、视网膜病、呼吸窘迫、以及某些器官发育不全，例如肺、眼睛、免疫系统、脑、心脏、肝和肾发育不全。

具有不同成功率的多种治疗方法可用于治疗与早产儿有关的病症或疾病。例如，患有贫血症的早产儿可使用输血和/或铁补充治疗，可施用表面活性剂来治疗与早产有关的呼吸窘迫综合征。但是，没有用于器官发育不全的治疗方法。尽管取得了进展，还是需要开发与早产儿有关的病症或疾病的治疗。

3.

技术实现要素：

本发明提供了治疗由早产引起或与早产有关的早产儿病症和疾病的方法。

在一个方面，本发明提供了一种治疗早产儿病症或疾病的方法，其中所述病症或疾病由早产引起或与早产有关，所述方法包括向早产儿施用包含脐带血例如异源脐带血的组合物。在具体的实施方案中，所述方法还包括向早产儿施用胎盘干细胞和/或血液添加剂。在施用胎盘干细胞和/或血液添加剂的实施方案中，脐带血可为自体的或异源性的。在一更具体的实施方案中，所述血液添加剂为红细胞生成素、铁补充剂、维生素、或取自非脐带血的异源红细胞。在一更具体的实施方案中，所述添加剂为异源红细胞，所述细胞被照射到足以减少或防止移植物抗宿主病的程度。在具体实施方案中，所述照射使用至少2,500cGy射线。在另一更具体的实施方案中，所述添加剂为异源红细胞，所述细胞已经去除了白细胞。

早产儿是早于37周妊娠出生的婴儿。在某些实施方案中，所述早产儿出生时已经历约23到约25周妊娠。在某些实施方案中，所述早产儿出生时已经历约26到约29周妊娠。在某些实施方案中，所述早产儿出生时已经历约30到约33周妊娠。在某些实施方案中，所述早产儿出生时已经历约34到约37周妊娠。

在某些实施方案中，所述早产儿出生时体重大于等于约800克。在某些实施方案中，所述早产儿出生时体重约500克到约800克。在某些实施方案中，所述早产儿出生时体重低于约500克。

根据本发明所治疗的病症或疾病可为本领域已知由早产引起或与早产有关的任何病症或疾病。在某些实施方案中，所述病症或疾病为呼吸窘迫综合征(RDS)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在某些实施方案中，所述病症或疾病为贫血症。在某些实施方案中，所述病症或疾病为脑室内出血、坏死性小肠结肠炎、早产儿视网膜病、慢性肺病(支气管肺发育异常)、感染、动脉导管未闭、呼吸暂停、低血压症、或高胆红素血症。在某些实施方案中，所述病症或疾病由器官例如肺、眼睛、免疫系统、脑、心脏、肝或肾发育不全引起。

本发明使用的脐带血可使用本领域已知的任何技术采集。在某些实施方案中，脐带血取自脐带血库。在某些实施方案中，脐带血从产后哺乳动物胎盘采集。在某些实施方案中，脐带血取自足月出生的产后哺乳动物胎盘。在其它实施方案中，脐带血取自早产的产后哺乳动物胎盘。所述脐带血如果单独施用，可与所治疗的早产儿异源，或者如果与胎盘干细胞或血液添加剂共同施用，可为异源性的或自体的，或两者的组合。

本发明使用的胎盘干细胞可使用本领域已知的任何方法分离和处理。在某些实施方案中，胎盘干细胞取自足月出生的胎盘。在某些实施方案中，胎盘干细胞取自早产的胎盘。本发明的方法使用的胎盘干细胞可以是所治疗的早产儿异源性的或自体的，或两者的组合。

在具体实施方案中，胎盘干细胞获自己放血并灌洗去除了残留血细胞的胎盘。该放血的胎盘然后可在适于允许源于该胎盘的内源干细胞产生的条件下培养约2到约24小时或更长时间。

一旦从培养的胎盘获取，所述胎盘干细胞可使用多种方法，包括但不限于免疫化学来表征，以鉴定特定的细胞表面标记。本发明所使用的优选干细胞可通过下列细胞表面标记的存在来鉴定：CD34^-、OCT-4⁺、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺和/或HLA-G⁺。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34⁺细胞。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34^-细胞。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含OCT-4⁺细胞。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺的细胞。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD200⁺或OCT-4⁺的细胞。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD200⁺和OCT-4⁺的细胞。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD73⁺和CD105⁺的细胞，且当包含该细胞的胎盘细胞群在允许类胚体形成的条件下培养时，该细胞有利于在该细胞群中形成一个或多个类胚体。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺的细胞。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含OCT-4⁺的细胞，且当包含该细胞的胎盘细胞群在允许类胚体形成的条件下培养时，该细胞有利于在该细胞群中形成一个或多个类胚体。

向所述早产儿施用脐带血、或脐带血与胎盘干细胞组合的步骤可根据本领域技术人员的判断进行，可以例如通过静脉内进行。可在所述早产儿出生后的多个时间点进行施用，但是通常优选在不超过出生后约2周时施用。在多个实施方案中，在所述早产儿出生后1、2、5、10、12、或24小时、或1周内施用。在所述早产儿出生后可进行一次或多次施用。

4.附图说明

图1为用于灌洗胎盘并采集灌洗液的胎盘静脉和动脉的套管的横截面图。

图2A-2E为显示采集、夹紧、灌洗、采集和储存被排空并灌洗的胎盘的示意图。

图3为灌洗胎盘在用作生物反应器的装置中的横截面示意图。

5.详细说明

5.1早产儿治疗

本发明提供了治疗由早产引起或与早产有关的早产儿病症和疾病的方法。所述方法包含向早产儿施用脐带血和任选的胎盘干细胞的步骤。在脐带血单独施用或与血液添加剂共同施用的实施方案中，所述脐带血与所治疗的早产儿异源。在脐带血与胎盘干细胞和/或血液添加剂共同施用的实施方案中，所述脐带血可以是受体早产儿自体的或异源性的。

如果婴儿出生体重低于1kg(约2.31b)，则认为该婴儿为极低出生体重(ELBW)婴儿。在某些实施方案中，所述早产儿出生时体重大于等于约800克。在某些实施方案中，所述早产儿出生时体重约500克到约800克。在某些实施方案中，所述早产儿出生时体重低于约500克。

当用于本文时，术语“治疗”系指治愈、矫正病症或疾病，或者减轻或改善病症或疾病或者病症或疾病的任何参数或症状的进展、严重性和/或持续时间，所述病症或疾病在本案中为由早产引起的或与早产有关的病症或疾病。

如果早产儿存活，或者如果由早产引起或与早产有关的病症或疾病由于治疗而以任何方式可检测地改善，则可认为使用脐带血和任选的胎盘干细胞治疗早产儿是有效的。这种改善可表现为例如一种或多种可检测的指标，包括例如与特定病症或疾病有关的生理状态或生理状态组(包括但不限于血压，心率，呼吸频率，多种血细胞计数，血液中某些蛋白、糖类、脂类、或细胞因子的水平，或者与所述病症或疾病有关的遗传标记的表达调节)的可检测改变。

如果任一此类指标响应所述治疗，数值改变为在例如足月婴儿的正常值范围之内，或者比不施用脐带血和/或胎盘干细胞时的此类指标预期值更接近正常值，则可认为使用脐带血和任选的胎盘干细胞的早产儿治疗是有效的。所述正常值可为本领域已知的指标的正常值或正常值范围。例如，将早产儿表现的一种或多种代谢或生化指标与该指标的正常范围比较，其中如果治疗导致一种或多种代谢或生化指标更接近正常足月婴儿的参考范围或在该范围之内，则可认为该治疗是有效的。此类指标包括但不限于下列水平或数值：17羟孕酮、25-羟基维生素D(25(OH)D)、乙酰乙酸、酸度(pH)、白蛋白、氨、淀粉酶、抗坏血酸、重碳酸盐、胆红素、血容量、钙、碳、二氧化碳分压、一氧化碳、CD4细胞计数、血浆铜蓝蛋白、氯化物、铜、肌酸激酶(CK或CPK)、肌酸激酶同工酶、肌酐、红细胞沉降率(ESR或Sed-Rate)、球蛋白、葡萄糖、血细胞比容、血红蛋白、铁、铁结合力、乳酸盐(乳酸)(动脉)、乳酸脱氢酶、脂肪酶、镁、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞平均容量(MCV)、渗透度、氧分压、血氧饱和度(动脉)、磷酸酶、磷、血小板计数、钾、蛋白质(总量)、凝血素(PTT)、丙酮酸、红细胞计数(RBC)、钠、促甲状腺素(TSH)、转氨酶(丙氨酸或天门冬氨酸)、尿素氮(BUN)和BUN/肌酐比、尿酸、维生素A、WBC(白细胞计数)、锌等等。

施用脐带血或者脐带血和胎盘干细胞的有效性可通过行为测试评估。例如，可使用Neonatal Neurobehavioral Examination，Alberta Infant Motor Scale、或Bayley Scale of infant Development(第3版)所述的一种或多种此类测试，通过比较早产儿此类测试的分数与正常和不同妊娠龄的早产儿的分数或分数范围，评估例如在出生之后前2-3年内评估早产儿的神经发育改善，并且如果所述分数高于所述早产儿妊娠龄的预期分数，则确定存在改善。在具体实施方案中，如果所述分数高于仅使用常规治疗的相同妊娠龄的早产儿分数或平均分数，则可认为接收脐带血或者脐带血与胎盘干细胞组合的早产儿已经得到改善。

在一实施方案中，早产儿在出生后不久(例如在第一周之内)使用Neonatal Neurobehavioral Examination(NNE)评估并给出表示行为特性、原始反射、和肌肉张力与动作模式的分数，其中最高分为81。所述婴儿在出生后2年内，优选地在约18到约22个月时重新评估1次或多次。NNE分数在此期间的显著提高表示有效。在多种实施方案中，如果与未经脐带血或者脐带血与胎盘干细胞的联合治疗的早产儿比较，所述分数比平均分数提高，例如如果早产儿在37-42周妊娠龄出生，37-42周妊娠龄早产儿(66.5)的平均分数；如果早产儿在34-36周妊娠龄出生，34-36周妊娠龄早产儿(60.7)的平均分数；或者如果早产儿在34周或以下妊娠龄出生，34周或以下妊娠龄早产儿(51.1)的平均分数，则施用脐带血和任选的胎盘干细胞有效。参见Morgan，″Neonatal Neurobehavioral Examination.A New Instrument For Quantitative Analysis of Neonatal Neurological Status，″Phys.Ther.68(9)：1352-1358(1988)。

5.1.1由早产引起或与早产有关的病症或疾病

本发明治疗的病症或疾病可为本领域已知由早产引起或与早产有关的任何病症或疾病。在某些实施方案中，所述病症或疾病为呼吸窘迫综合征(RDS)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在某些实施方案中，所述病症或疾病为贫血症。在某些实施方案中，所述病症或疾病为脑室内出血、坏死性小肠结肠炎、早产儿视网膜病、慢性肺病(支气管肺发育异常)、感染、动脉导管未闭、呼吸暂停、低血压症、或高胆红素血症。在某些实施方案中，所述病症或疾病由器官，包括但不限于肺、眼睛、免疫系统、脑、心脏、肝或肾发育不全引起。

(急性)呼吸窘迫综合征(ARDS/RDS)或婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)(正式地称为透明膜病)是一种呼吸病症，其中由于表面活性剂产生不足导致高表面张力，从而使婴儿肺部的肺泡(气泡)不能保持打开。呼吸窘迫综合征影响所有早产儿的10％，而很少影响足月出生的婴儿。该疾病由缺少肺表面活性剂，一种通常出现在成熟肺部的化学物所引起。表面活性剂防止肺泡萎陷并使其更容易充气。在呼吸窘迫综合征中，肺泡萎陷并阻止儿童正常呼吸。综合征通常在出生后不久出现并日益恶化。患有RDS/ARDS的婴儿通常需要氧气和呼吸机支持或使用表面活性剂药物治疗。

贫血症是特征为血液中红细胞或血红蛋白数量不足以向身体输送足够氧气的病症。早产儿可因多种原因患贫血症，包括分娩中失血、缺少铁含量以及血红细胞半衰期比成人短。现有的治疗方法包括输血(从血库或从家庭成员获得的直接供血)、补充铁和防止失血。虽然无意受限于任何特定理论，相信脐带血是输血的良好血源。脐带血自体输血比来自血库或相关供体的血液具有多种优势：1)脐带血是具有合适携氧能力的红细胞的良好来源；2)脐带血容易获得并仅需要极少测试；以及3)脐带血是能够支持未成熟器官或因早产损坏的器官进一步发育的干细胞和祖细胞的丰富来源。

呼吸暂停是早产儿暂时停止呼吸的病症，通常定义为呼吸中断15到20秒。呼吸暂停可发生在34周妊娠之前出生的婴儿，在最早产婴儿中频率增加。人们认为其是由控制呼吸的脑部分未成熟引起。患有呼吸暂停的婴儿使用药物(例如氨茶碱、咖啡因或多沙普仑)治疗，和/或使用持续正压通气或呼吸机支持。

慢性肺病(支气管肺发育异常)是早产儿患有的由于长时间依靠机械换气和/或高氧气水平所引起的疾病。慢性肺病使用氧气、药物和使婴儿逐步脱离呼吸机治疗。

高胆红素血症，新生儿最常遇到的问题之一，是血液中胆红素的水平异常增高。其定义为总血清胆红素水平高于5mg/dL。高于此水平的胆红素具有神经毒性/细胞毒性。其产生于皮肤和粘膜中非结合胆红素色素的沉积。轻微高胆红素血症不需治疗。更高的胆红素水平可通过光疗治疗，其中将婴儿放置在胆红素光线下。

早产儿比足月婴儿患感染的风险更高，因为其免疫系统未成熟。早产儿中观察到的严重感染包括脓毒症、肺炎和脑膜炎(包围脑的薄膜的感染)。目前，感染使用抗生素或抗病毒药物治疗。

脑室内出血为脑内出血。其在脑室周边小血管破裂时发生。脑室内出血最常影响早产新生儿。严重出血可引起脑损伤，并可导致例如学习障碍和/或行为问题。

坏死性小肠结肠炎是肠内表面损伤并发炎的病症；如果严重，一部分肠可能坏死，从而导致肠穿孔和腹膜炎。坏死性小肠结肠炎主要发生于早产儿。该病症的原因不明，但认为流向肠的血液减少阻止了肠产生正常的保护性粘膜。肠内细菌可能也是一个原因。坏死性小肠结肠炎可导致喂养问题、婴儿腹部肿胀和其它并发症。坏死性小肠结肠炎使用药物和有时手术治疗。

动脉导管未闭(PDA)是动脉导管(一种出生之前允许血液绕过婴儿肺部的血管)在出生后未能关闭的病症。动脉导管未闭目前使用药物和必要时手术治疗。

早产儿视网膜病是早产儿眼睛(视网膜)背面血管发育异常的病症；这些血管可能出血，并且在大多数严重情况下，视网膜可能剥离，从而导致视力丧失。其主要发生于32周妊娠之前出生的婴儿。患早产儿视网膜病的主要风险因素为极度早产，呼吸问题治疗中的血液高氧水平可增加该风险。使用高浓度氧治疗的早产儿通常发生两侧视网膜病，其特征为血管扩张、增生、扭曲、水肿、以及视网膜脱离，最终视网膜转化为纤维质，表现为眼晶状体后面可见的厚膜。通常，眼睛发育被阻止并可能导致小眼畸形，并且可能失明。轻微早产儿视网膜病通常自愈；患有严重视网膜病的婴儿目前使用激光或冷冻疗法治疗，在所述冷冻疗法中视网膜的周边部分被冷冻。

另外，本发明还包括由某些器官包括但不限于肺、眼睛、免疫系统、脑、心脏、肝和肾发育不全引起的病症或疾病的治疗。目前没有用于器官发育不全的治疗方法。

5.1.2向早产儿施用脐带血和胎盘干细胞

脐带血和任选的胎盘干细胞可以以任何药学上或医学上可接受的方式，包括通过注射或输血，向早产儿施用，尤其是患有或显示与早产有关或由早产引起的任何病症或疾病的早产儿。在某些实施方案中，脐带血和胎盘干细胞通过非肠道向早产儿施用。术语“非肠道”用于本文时包括皮下注射、静脉内、肌肉内、动脉内注射、或输血技术。在优选实施方案中，脐带血和任选的胎盘干细胞通过静脉内向早产儿施用。

脐带血或胎盘干细胞可包含于任何药学上可接受的载体中。所述脐带血或胎盘干细胞可以在任何药学上或医学上可接受的容器例如血袋、转移袋、塑料管、注射器、药瓶等中携带、储存或运输。

向所述早产儿施用脐带血和任选的胎盘干细胞的步骤可以以任何医学上可接受的方式进行。可在所述早产儿出生后的多个时间点进行施用。在多种实施方案中，例如，可在出生后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、21、或24小时之内，或者出生后2、3、4、5、或6天之内、或者出生后1或2周之内进行施用。

可在所述早产儿出生后施用一次或多次脐带血和任选的胎盘干细胞。在某些实施方案中，在早产儿出生后施用一次。在某些实施方案中，在早产儿出生后施用多次。

向所述早产儿施用的脐带血和胎盘干细胞的数量或数目取决于所使用的脐带血和胎盘干细胞的来源，所治疗病症或疾病的严重性或性质，以及所述早产儿的年龄、体重和身体状况等等。在某些实施方案中，施用每千克早产儿体重约0.01到约0.1、约0.1到约1、约1到约10、约10到约10²、约10²到约10³、约10³到约10⁴、约10⁴到约10⁵、约10⁵到约10⁶、约10⁶到约10⁷、约10⁷到约10⁸、或约10⁸到约10⁹个脐带血细胞、胎盘干细胞、或脐带血细胞与胎盘干细胞。在具体实施方案中，所述脐带血细胞为CD34⁺细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞为CD34⁺细胞。优选地，施用至少每千克体重约10⁵到约10⁷个CD34⁺细胞。此类CD34⁺细胞可仅来源于脐带血，或可来源于脐带血和胎盘。在多种实施方案中，施用最多每千克早产儿体重约10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或约10⁹个脐带血细胞、胎盘干细胞、或脐带血细胞与胎盘干细胞。在上述实施方案的具体实施方案中，所述脐带血和/或胎盘干细胞为CD34⁺细胞。

所述脐带血和任选的胎盘干细胞优选地以适于所述早产儿大小的体积输送。早产儿的典型血液容量为约85-100mL/kg体重。因此，早产儿的血液容量在约40mL到约300mL范围内。因此，在多种实施方案中，脐带血和任选的胎盘干细胞以总体积约0.5mL、1.0mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、或约20mL、或更多施用。所述体积的施用可为单次施用或多次施用。当所述婴儿为极低出生体重(例如低于1kg)时，脐带血的所需体积或脐带血细胞的所需数量，和任选的胎盘干细胞的数量可以以多次施用的方式提供给所述婴儿。脐带血或脐带血与胎盘干细胞的组合的所述体积的施用时间可在例如0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、或更长之间变化。

通常，低于20mL的小量输血不需要泵，并考虑到所述婴儿的容量-耐受性，可以使用注射器通过例如间歇小推注输入。更大体积的输血优选地通过输血设备在2到4小时时间之内施用。如果所述输血间隔超过4小时，则应将血液成分分离，且将其次要部分储存在例如血库中直至需要。

5.1.3血液添加剂

在某些实施方案中，向所述早产儿施用的脐带血包含一种或多种添加剂。例如，此类添加剂可包括例如红细胞生成素、铁补充剂、维生素、或异源血红细胞。

在具体的实施方案中，所述血液添加剂为红细胞生成素。红细胞生成素可以以任何医学上可接受的方式施用。所述红细胞生成素可为从生物来源纯化的天然红细胞生成素，或工程化的红细胞生成素例如或所述红细胞生成素可具有天然人红细胞生成素的序列，或可为经工程化以增加血清半衰期的红细胞生成素。红细胞生成素的典型剂量在500-1500U/kg/周范围内。

在另一具体实施方案中，所述血液添加剂为铁或铁补充剂。所述铁或铁补充剂可为任何代谢可利用并且为医学上可接受的形式，但是优选地为元素铁。用于早产儿的典型剂量为：如果所述早产儿重小于等于约1500克，约4.0mg/kg/天到约4.5mg/kg/天，以及如果所述婴儿重约1500克到约2500克，约2mg/kg/天。

在另一具体实施方案中，所述血液添加剂是或包含一种或多种维生素。在优选实施方案中，所述一种或多种维生素为血液发生所必需的维生素，包括但不限于核黄素(维生素B2)、吡哆醇(维生素B6)、叶酸、维生素B12、和/或维生素E。在一实施方案中，向所述早产儿施用约25IU维生素E。此类维生素可以以与成人大致相同的每千克剂量向所述早产儿施用。在多种实施方案中，单次施用脐带血和任选的胎盘干细胞包含约150μg核黄素、约100μg吡哆醇、约25μg叶酸、0.4μg维生素B 12、和/或约3.6IU维生素E。所述血液添加剂还可为一种或多种其它维生素，例如维生素A(例如每次施用约460IU)、维生素D(例如每次施用约70IU)、维生素K(例如每次施用约11μg)、硫胺(维生素B1，例如每次施用约220μg)、烟酸(例如每次施用约1950μg)、泛酸(例如每次施用约800μg)、生物素(例如每次施用约9μg)、维生素C(抗坏血酸，例如每次施用约15mg)、肌醇(例如每次施用约6mg)、和/或亚油酸(例如每次施用约750mg)。所述血液添加剂可以是或可包含上述维生素的任何组合。

在另一具体实施方案中，所述血液添加剂为非脐带血来源的异源血红细胞，例如来自外周血的血红细胞。在优选实施方案中，如果供体为第一或第二级亲属，则将所述血红细胞照射到足以减轻或防止移植物抗宿主病的程度。例如，在一实施方案中，血红细胞在施用之前使用至少2,500cGy照射。此类经过照射的血红细胞优选地在照射后24小时之内施用。在其它实施方案中，与脐带血共同向所述早产儿施用的血红细胞来自非亲属供体。优选地，此类血红细胞来自单个非亲属供体。在优选实施方案中，所述血红细胞使用多包血液采集系统从所述非亲属供体采集，该系统可从相同供体向所述早产儿多次施用，以减少免疫并发症。在另一更具体的实施方案中，其中所述添加剂为异源血红细胞，所述细胞已去除白细胞，例如使用白细胞过滤器去除。参见例如美国专利号5,728,306。在血红细胞用作血液添加剂的所有实施方案中，优选地所述血红细胞在施用之前储存不超过5天。在优选实施方案中，所述血红细胞包含腺嘌呤-盐(AS-3)抗凝剂。

在另一优选实施方案中，所述血红细胞来自供血单位，其已被测试不含至少下列病原体或不含下列病原体的抗体：人类免疫缺陷病毒(HIV)-I、HIV-II、丙肝病毒、嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV)-I和HTLV-II、乙肝病毒(HBV，例如通过不含乙肝病毒表面抗原(HBsAg)证实)、巨细胞病毒、和梅毒。

5.1.4联合疗法

在本文提供的方法的某些实施方案中，脐带血和任选的胎盘干细胞在早产儿病症或疾病治疗中作为第一疗法与一种或多种第二疗法联合使用。此类第二疗法包括但不限于手术、激素疗法、免疫疗法、光疗或使用某些药物治疗。

使用的术语“联合疗法”并不限制在所提供方法中向早产儿施用治疗的顺序。例如，所述联合疗法中的药剂可同时、以任何顺序依次、或循环向早产儿施用。在某些实施方案中，联合疗法中的两种成分同时向早产儿施用。

联合疗法中的成分可在同一药物组合物中向早产儿施用。或者，联合疗法中的成分可在不同药物组合物中向早产儿施用，并且所述不同组合物可通过相同或不同施用路径施用，包括例如口服、非肠道(例如眼、鼻、皮肤、肌肉或腹膜路径等等)、或表面等等。

具体的第二疗法根据该疗法的各自标准或公认剂量和给药方案进行。

在某些实施方案中，第二治疗剂和/或任选的第三治疗剂根据其在早产儿病症或疾病治疗中与脐带血和胎盘干细胞的加成作用来选择。

在某些实施方案中，第二治疗剂和/或任选的第三治疗剂根据其在早产儿病症或疾病治疗中与脐带血和胎盘干细胞的协同作用来选择。

可与脐带血和任选的胎盘干细胞联合施用的示范性疗法包括控制环境温度；使用氧气支持；呼吸机或通气机；外周血输血；铁补充；静脉营养法；光疗；手术；呼吸暂停治疗剂(例如氨茶碱、咖啡因或多沙普仑等等)；ARDS或RDS治疗剂(例如表面活性剂药物，例如CURO(猪肺表面活性物质；Douglas Pharmaceuticals))；抗生素或抗病毒药物、抗炎剂(例如类固醇抗炎化合物、非类固醇抗炎(NSAID)化合物)、一氧化氮；抗组胺药、免疫抑制剂、免疫调节化合物(例如TNF-α抑制剂)；激光治疗(用于治疗例如早产儿视网膜病)等等。早产儿治疗是本领域熟知的，本领域技术人员能够在个案基础上选择适于与脐带血施用联合使用的特定疗法。

5.2脐带血

脐带血可以以任何医学上或药学上可接受的方式采集。已描述了多种用于采集脐带血的方法。参见，例如美国专利号6,102,871、美国专利号6,179,819B1和美国专利号7,147,626，每个专利的全部内容通过引用结合到本文中。用于采集脐带血的常规技术基于使用针或套管，其使用重力帮助从胎盘中排出脐带血。参见，例如美国专利号5,192,553、5,004,681、5,372,581和5,415,665。通常将所述针或套管置于脐静脉并轻轻按摩胎盘以帮助从胎盘排出脐带血。脐带血可采集到例如血袋、转移袋、或无菌塑料管中。

在某些实施方案中，脐带血获自商业脐带血库(例如LifeBankUSA等)。在其它实施方案中，脐带血获自产后哺乳动物胎盘并立即使用(例如在采集后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时内使用)。在其它实施方案中，用于治疗早产儿的脐带血为已经低温保存的脐带血。脐带血可获自单个胎盘或多个胎盘。

向早产儿施用的脐带血可为自体的或异源性的。在具体实施方案中，脐带血获自待治疗的早产儿的胎盘。在某些实施方案中，脐带血获自足月出生的产后哺乳动物胎盘。在其它实施方案中，脐带血获自早产的产后哺乳动物胎盘，例如早产儿的胎盘。在一些实施方案中，所述胎盘为约23到约25周妊娠出生的早产儿胎盘。在一些实施方案中，所述胎盘为约26到约29周妊娠出生的早产儿胎盘。在一些实施方案中，所述胎盘为约30到约33周妊娠出生的早产儿胎盘。在一些实施方案中，所述胎盘为约34到约37周妊娠出生的早产儿胎盘。

脐带血或源于其中的干细胞可从单个个体采集并储存(即作为单一单位)以用于施用，或可与其它单位合并。如果多个胎盘的脐带血合并，则所合并的脐带血可包含仅来自足月出生的脐带血、来自足月出生组合的脐带血、或仅来自早产的脐带血。例如，来自所述早产儿胎盘的脐带血可与例如来自其它早产儿的脐带血、仅来自足月出生的脐带血、或来自早产和足月胎盘的脐带血组合相混合。脐带血，包括自体或异源性脐带血，也可与外周血混合。来自早产的脐带血是优选的，因为此类脐带血与来自足月出生的脐带血相比，每单位体积包含相对高数量的CD34⁺干细胞。

在某些实施方案中，所述脐带血中存在的总有核细胞包含至少5％、10％、15％、20％、或更多CD38⁺CD45⁺细胞。在其它实施方案中，所述脐带血中存在的总有核细胞包含至少25％、30％、40％、50％、或更多CD38^-CD45^-细胞。在一些实施方案中，所述脐带血从早产胎盘制备。在其它实施方案中，所述脐带血从足月胎盘制备。

5.3胎盘干细胞

当用于本文时，术语“胎盘干细胞”系指获自或源于哺乳动物胎盘或其部分(例如羊膜、绒毛膜等等)的组织培养塑料贴壁干细胞(例如多能细胞)，不考虑形态、细胞表面标记等。该短语包含直接获自胎盘的干细胞，例如作为胎盘灌洗液或消化的胎盘组织(消化物)中胎盘细胞群的一部分，或者作为已扩增和/或传代一次或多次的胎盘细胞群的一部分的干细胞。但是，该术语并不包含仅源于另一组织例如胎盘血或脐带血的干细胞。所述胎盘包含具有例如独特的标记组并可以此相互区别的干细胞群。胎盘干细胞及其获取方法在美国专利号7,045,148、7,255,879以及2006年12月26日提交的美国专利申请公布号2007/0275362中有详细描述，其全部公开内容通过引用结合到本文中。

胎盘干细胞可在成功出生且胎盘娩出后回收，由此回收多达10亿有核细胞，产生5千万到1亿多能和多潜能细胞。

可在本发明的方法和组合物中使用的胎盘干细胞包括例如源于胎盘的多潜能细胞、多能细胞、定向祖细胞、造血祖细胞、以及间充样细胞。在一实施方案中，所述胎盘干细胞包含在胎盘灌洗液中或源于胎盘灌洗液。在其它实施方案中，胎盘干细胞包含在已使用一种或多种组织消化酶(例如胶原酶、透明质酸酶等等)消化的胎盘组织中或源于该胎盘组织。

本发明的方法中使用的源于胎盘的干细胞可源于单个胎盘，或源于多个胎盘。

在某些实施方案中，胎盘干细胞获自足月出生的胎盘。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞获自早产的胎盘。在一些实施方案中，所述胎盘为约23到约25周妊娠出生的婴儿胎盘。在一些实施方案中，所述胎盘为约26到约29周妊娠出生的婴儿胎盘。在一些实施方案中，所述胎盘为约30到约33周妊娠出生的婴儿胎盘。在一些实施方案中，所述胎盘为约34到约37周妊娠出生的婴儿胎盘。

胎盘干细胞可以是所治疗的特定早产儿自体的或异源性的。在具体实施方案中，胎盘干细胞获自待治疗的早产儿。

本发明的方法中使用的胎盘干细胞可通过任何方法获取。胎盘干细胞可通过例如灌洗获取，如美国专利号7,045,148所公开，其内容通过引用结合到本文中。这种灌洗可通过盘法灌洗，其中灌洗液体被加压而通过所述胎盘的脉管系统，且在包含所述胎盘的盘中收集从该胎盘，通常是母体一侧流出的灌洗液。灌洗也可为闭路灌洗，其中灌洗液仅流过所述胎盘的胎儿脉管系统病从该脉管系统收集。在一特定实施方案中，所述灌洗可为连续的，即已流过所述胎盘并包含很多胎盘细胞的灌洗液在分离胎盘细胞之前再次或多次流过所述胎盘。

源于胎盘的干细胞也可通过物理裂解或酶裂解所述胎盘来获取，其使用例如蛋白酶和/或其它组织裂解酶裂解所述胎盘的多细胞结构。所述蛋白酶可包括中性蛋白酶或金属蛋白酶，例如胶原酶、分散酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶等。胎盘干细胞还可通过物理裂解所述胎盘来获取，其使用例如粘多糖酶，例如透明质酸酶。

本发明的分离的灌洗胎盘提供了大量干细胞的来源，其富含CD34⁺干细胞，例如CD34⁺CD38^-干细胞，以及CD34^-干细胞，例如CD34^-CD38⁺干细胞。从所述胎盘第一次采集的血液称为脐带血，其主要包含CD34⁺CD38⁺造血组细胞。在产后灌洗第一个24小时内，CD34⁺CD38^-造血组细胞可与CD34^-CD38⁺细胞一起从所述胎盘中分离。灌洗约24小时之后，CD34^-CD38^-细胞可与上述细胞一起从所述胎盘中分离。已灌洗24小时或更久的分离胎盘提供了富含CD34^-CD38^-干细胞的大量干细胞的来源。

至少一类人胎盘干细胞具有胚胎干细胞或生殖细胞的特性。例如，此类干细胞为SSEA3^-(阶段特异性胚胎抗原3)、SSEA4^-、OCT-4⁺(一种干细胞转录因子)和/或ABC-p⁺(ATP结合盒(ABC)转运蛋白)，一种尚未进行分化的多潜能干细胞显示的标记性质。因此，在一实施方案中，本发明的方法中使用的胎盘干细胞为SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺和/或ABC-p⁺。在另一实施方案中，本发明的类胚干细胞为OCT-4⁺和ABC-p⁺。在另一实施方案中，所述人类胎盘干细胞并不表达MHC 2类抗原。

在本发明的方法中可使用的优选胎盘干细胞为CD10⁺、CD38^-、CD29⁺、CD34^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺和/或ABC-p。

本发明使用的优选干细胞为CD34^-、OCT-4⁺、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺和HLA-G⁺。在某些实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34^-细胞。在其它实施方案中，所述胎盘干细胞包含OCT-4⁺细胞。在其它实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺细胞。在其它实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD200⁺或HLA-G⁺细胞。在其它实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD200⁺和OCT-4⁺细胞。在其它实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD73⁺和CD105⁺细胞，且当包含所述细胞的胎盘细胞群在允许类胚体形成的条件下培养时，该细胞有利于在该细胞群中形成一个或多个类胚体。在其它实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺细胞。在其它实施方案中，所述胎盘干细胞包含OCT-4⁺细胞，且当包含所述干细胞的胎盘细胞群在允许类胚体形成的条件下培养时，该细胞有利于在该胎盘细胞群中形成一个或多个类胚体。

因此，在一实施方案中，本发明提供了治疗早产儿的方法，所述方法包含向所述早产儿施用脐带血和胎盘干细胞。在具体实施方案中，所述干细胞为CD200⁺或HLA-G⁺。在具体实施方案中，所述干细胞为CD200⁺或HLA-G⁺。在更具体的实施方案中，所述干细胞也为CD73⁺和CD105⁺。在另一更具体的实施方案中，所述干细胞也为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一更具体的实施方案中，所述干细胞也为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一更具体的实施方案中，所述干细胞也为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述CD200⁺或HLA-G⁺干细胞在允许类胚体形成的条件下有利于在包含该干细胞的胎盘来源的细胞群中形成类胚体。

在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞为CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺。在一更具体的实施方案中，所述干细胞也为HLA-G⁺。在另一更具体的实施方案中，所述干细胞也为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一更具体的实施方案中，所述干细胞也为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在一更具体的实施方案中，所述干细胞也为CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述CD73⁺、CD105⁺、和CD200⁺干细胞在包含所述干细胞的胎盘来源的细胞群在允许类胚体形成的条件下培养时有利于在该细胞群中形成一个或多个类胚体。

在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞为CD200⁺和OCT-4⁺。在一更具体的实施方案中，所述干细胞也为CD73⁺和CD105⁺。在另一更具体的实施方案中，所述干细胞也为HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在一更具体的实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞在包含所述干细胞的胎盘来源的细胞群在允许类胚体形成的条件下培养时有利于该细胞群形成一个或多个类胚体。

在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞为CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在一更具体的实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在一更具体的实施方案中，所述干细胞也为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一更具体的实施方案中，所述CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺干细胞为OCT-4⁺。在另一更具体的实施方案中，所述干细胞为CD200⁺。在一更具体的实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一更具体的实施方案中，所述胎盘干细胞在包含所述干细胞的胎盘细胞群在允许类胚体形成的条件下培养时有利于在该细胞群中形成一个或多个类胚体。

在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞可为SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺和ABC-p⁺中的一种或多种。在另一实施方案中，所述胎盘干细胞为OCT-4⁺和ABC-p⁺。在一实施方案中，所述人类胎盘干细胞并不表达MHC II类抗原。在其它实施方案中，所述胎盘干细胞为CD10⁺、CD38^-、CD29⁺、CD34^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺、和/或ABC-p⁺中的一种或多种。

在另一实施方案中，所述胎盘干细胞为同质的并且无菌。在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞存在于适于向人类施用的药物级溶液中。

标记，例如细胞表面标记，可根据本领域熟知的方法，例如通过流式细胞术或荧光活性细胞分选(FACS)分析，通过洗涤和使用合适荧光团标记的抗细胞表面标记抗体染色进行常规测定。例如，为测定CD34或CD38的存在，细胞可在PBS中洗涤，然后使用抗CD34藻红蛋白和抗CD38异硫氰酸荧光素(Becton Dickinson，Mountain View，CA)双染色。然后所述细胞使用标准流式细胞仪分析。或者，细胞内标记也可通过标准方法分析。

5.4胎盘干细胞的采集与鉴定

可使用本领域技术人员已知的任何技术采集与分离胎盘干细胞。在优选实施方案中，如美国专利号7,045,148或2006年12月26日提交的美国专利申请公布号2007/0275362所述分离与采集胎盘干细胞，其全部公开内容通过引用结合到本文中。采集胎盘干细胞的方法如下所述。

5.4.1通过灌洗分离胎盘干细胞

5.4.1.1胎盘预处理

采集胎盘干细胞开始于采集胎盘，例如人胎盘。在某些实施方案中，人胎盘在出生娩出后立即回收，并且在某些实施方案中，回收胎盘的脐带血。在具体的实施方案中，对所述胎盘进行常规的脐带血回收过程，以作为治疗所述早产儿的辅助，例如根据特定早产儿的需要回收脐带血。脐带血还可获自商业脐带血库服务，例如LifeBankUSA，Cedar Knolls，NJ。

通常，脐带血采集过程如下。产后(剖腹产分娩或自然分娩之后)，将所述胎盘放血，例如排出脐带血。在脐带血采集之前，可将所述胎盘储存在无菌条件下且温度为例如约5℃到约25℃，或约室温。在某些实施方案中，在脐带血回收之前夹紧近端脐带，优选地夹在距离脐带插入胎盘处的4-5cm(厘米)之内。在其它实施方案中，在脐带血回收之后但在进一步处理所述胎盘之前夹紧近端脐带。可使用采集脐带血的常规技术。通常使用针或套管在重力的帮助下从所述胎盘中排出脐带血(即放血)(参见例如Boyse等的美国专利号5,192,553；Boyse等的美国专利号5,004,681；Anderson等的美国专利号5,372,581；Hessel等的美国专利号5,415,665)。所述针或套管通常置于脐静脉中并轻轻按摩胎盘以帮助从该胎盘排出脐带血。

在灌洗所述胎盘以去除任何残留脐带血之前，所述胎盘可储存约1小时到约72小时，优选地约4到约24小时。

脐带血采集之后，所述胎盘优选地储存在抗凝血溶液中，温度约5℃到约25℃，例如室温。本领域熟知合适的抗凝血溶液。例如，可使用肝素或苄丙酮香豆素钠溶液。在优选实施方案中，所述抗凝血溶液包含肝素溶液(在1：1000溶液中1％w/w)。排空的胎盘优选地在如下所述采集胎盘干细胞之前储存不超过36小时。

通常将胎盘从分娩或生产室运送到另一个场所，例如实验室，以通过例如灌洗或胎盘组织酶消化进行脐带血回收和/或引流和干细胞采集。所述胎盘优选地在无菌、保温运输装置(保持所述胎盘温度在例如约20℃到约28℃之间)中运送，例如，将夹紧近端脐带的胎盘置于无菌拉链塑料袋中，然后置于保温容器中，如图2a-e所示。

在优选实施方案中，所述胎盘从知情同意的病人回收，且提取所述病人妊娠之前、期间和之后的完整病历并与该胎盘关联。所述病历可用于协调该胎盘或从其中获取的干细胞的后续使用。例如，所述人胎盘干细胞可容易地用于个人化药物以待治疗的早产儿。

5.4.1.2胎盘放血与去除残留细胞

脐带血回收之后，通过例如灌洗从所述胎盘回收胎盘干细胞。在一个方面，用合适的水性灌洗液灌洗放血的胎盘以去除残留的脐带血。所述灌洗溶液可为任何水性等渗液体，优选地其中溶解有抗凝剂(例如肝素、苄丙酮香豆素钠)。本领域熟知此类用于灌洗的水性等渗液体，包括例如培养基、盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液、或优选地0.9N氯化钠溶液。所述灌洗液优选地包含浓度足以防止任何残留脐带血形成血块的抗凝剂。在具体实施方案中，使用1到100单位浓度的肝素，优选地使用每ml 1到10单位浓度的肝素。在一实施方案中，细胞凋亡抑制剂，例如自由基清除剂，尤其是氧自由基清除剂，可在放血期间或之后立即使用，然后将这些试剂从所述胎盘洗除。根据本发明的本实施方案，分离的胎盘可在低温条件下储存以防止或抑制细胞凋亡。

优选地，在胎盘干细胞采集之前，用例如10-100mL灌洗液冲洗所述胎盘以去除基本上所有剩余的脐带血。通常地，该种冲洗通过使所述灌洗液利用重力流过脐动脉和脐静脉之一或两者流入所述胎盘来进行。所述胎盘优选地以使脐动脉和脐静脉位于所述胎盘的最高点的方式放置(例如悬挂)。在优选实施方案中，脐动脉和脐静脉如图1所示同时与吸液管连接，该吸液管通过弹性接头与所述灌洗液池连接。所述灌洗液流入脐静脉和动脉并在妊娠期间与母体子宫相连的胎盘表面的合适开放血管中采集。所述灌洗液也可引导通过脐带开口，并允许从与母体子宫壁相连的胎盘壁上的开口流出或渗出。

在优选实施方案中，在灌洗期间夹紧近端脐带，更优选地，在距离脐带插入所述胎盘处的4-5cm(厘米)之内夹紧脐带。

在一实施方案中，使用足量的灌洗液可去除所有残留的脐带血，并随后采集或回收胎盘细胞，包括但不限于，去除脐带血后留在所述胎盘内的类胚干细胞和祖细胞。

已观察到冲洗期间当第一次从胎盘采集灌洗液时，所述液体被脐带血的残留血红细胞染色。所述灌洗液随灌洗的进行而变得更澄清，且残留的脐带血细胞被洗出所述胎盘。通常30到100ml(毫升)灌洗液足以将所述胎盘放血并从所述胎盘回收首批类胚细胞，但是根据观察的结果可使用更多或更少的灌洗液。

5.4.1.3培养所述胎盘

在优选实施方案中，将所述胎盘在无菌条件下在容器中或其它合适的容器中培养或培育，并使用灌洗溶液(例如生理盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液(“PBS”)，或者，优选地，0.9N盐溶液)灌洗，所述灌洗溶液含有或不含有抗凝剂(例如肝素、苄丙酮香豆素钠、香豆素、双香豆素)，和/或含有或不含有抗菌剂(例如β-巯基乙醇(0.1mM)；抗生素，例如链霉素(例如40-100μg/ml)、青霉素(例如40U/ml)、两性霉素B(例如0.5μg/ml)等等。多种培养基可用作培养或培育所述胎盘的灌洗液，例如补充有小牛血清(FBS)、人全血清(WHS)或所述胎盘娩出时采集的人脐带血清的DMEM、Ham′s F-12、M199、RPMI、Fisher′s、Iscove′s、McCoy′s、以及上述各项的组合。用于排出所述胎盘内残留脐带血的相同灌洗液可用于培养或培育所述胎盘，无需添加抗凝剂。

流出灌洗液包含循环灌洗液，其已流过所述胎盘的循环，以及渗出灌洗液，其从血管壁渗出或流入所述胎盘的周围组织。将流出灌洗液或循环灌洗液或者优选地循环和渗出灌洗液采集到，优选地，无菌容器中。可改变所述胎盘的保存条件和所述灌洗液的性质以调节流出灌洗液的体积和组成。

然后使用本领域技术人员已知的技术从采集的灌洗液中分离细胞类型，所述技术例如但不限于密度梯度离心、磁性细胞分离、FACS细胞分选、亲和细胞分离或差速贴壁技术。

在一实施方案中，将胎盘置于无菌盆中并用500ml磷酸缓冲生理盐水洗涤。弃去洗涤液。然后将导管例如或塑料导管插入脐静脉，该导管与无菌连接装置，例如无菌输液管连接。该无菌连接装置如图3所示与灌洗集合管连接。然后盖上包含所述胎盘的该容器，并将所述胎盘在室温(20-25℃)保存所需时间，优选地2到24小时，且优选地不超过48小时。所述胎盘可使用等体积的引入灌洗液和去除或采集的流出灌洗液连续灌洗。或者，所述胎盘用一定体积灌洗液，例如100ml灌洗液(无菌生理盐水，补充或不补充1000u/1肝素和/或EDTA和/或CPDA(磷酸肌酸葡萄糖))周期性地灌洗，例如每2小时灌洗；在4、8、12、和24小时灌洗；或在培养期间以其它间隔灌洗。在周期性灌洗的情况下，优选地向所述胎盘的培养环境引入和去除等体积的灌洗液，以使所有时间内所述胎盘浸没在稳定体积的灌洗液中。

采集并处理从所述胎盘流出的灌洗液，例如在所述胎盘的相对表面流出的灌洗液，以分离需要的类胚干细胞、祖细胞或其它细胞。

通过使用标准细胞检测技术例如流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学(例如使用组织特异性或细胞标记特异性抗体染色)、荧光活性细胞分选(FACS)、磁性活性细胞分选(MACS)检测形态学和细胞表面标记的变化，通过使用光学或共聚焦显微术检查细胞的形态学，或者通过使用本领域熟知的技术例如PCR和基因表达谱检测基因表达的变化，可容易地监测增殖细胞的数量和种类。

在一实施方案中，胎盘干细胞可使用荧光活性细胞分选仪(FACS)分选。荧光活性细胞分选(FACS)是熟知的基于颗粒的荧光性质分离颗粒包括细胞的方法(Kamarch，1987，Methods Enzymol，151：150-165)。激光激发单个颗粒中的荧光部分产生小电荷，该电荷允许电磁分离混合物中的正负颗粒。在一实施方案中，使用独特的荧光标记对细胞表面标记特异性的抗体或配体进行标记。细胞通过所述细胞分选仪处理，以允许细胞基于其结合所使用的抗体的能力进行分离。FACS分选的颗粒可直接置于96孔或384孔板的各个孔中以利于分离和克隆。

在另一实施方案中，可使用磁珠分离细胞。可使用磁性活性细胞分选

(MACS)技术，一种基于结合磁珠(直径0.5-100μm)的能力来分离颗粒的方法对所述细胞进行分选。可在所述磁性微球上进行多种有用的修饰，包括共价添加特异性识别细胞-固相表面分子或半抗原的抗体。然后施加磁场以物理操作所选择的珠子。然后将所述珠子与所述细胞混合以允许结合。然后使细胞通过磁场以分离具有细胞表面标记的细胞。然后分离出这些细胞并与结合有抗其它细胞表面标记的抗体的磁珠再次混合。将所述细胞再次通过磁场，分离与所述两种抗体结合的细胞。然后将此类细胞稀释到分离盘中，例如用于克隆分离的微量滴定盘。

在本发明的某些实施方案中，所述排空放血的胎盘作为生物反应器培养，即用于增殖胎盘干细胞的体外系统。通过周期性地或连续地去除一部分引入所述胎盘生物反应器的培养基或灌洗液，所述胎盘生物反应器中增殖细胞的数量可保持在平衡生长的连续状态，并可从其中回收增殖的细胞。以相同速率或相同数量引入新鲜的培养基或灌洗液。为了将所述胎盘用作生物反应器，将该胎盘如本文所述用灌洗溶液灌洗并在无菌条件下培养不同时间段。在具体的实施方案中，所述胎盘培养至少约12、24、36、或48小时，或者3-5天、6-10天，或者1到2周。在优选实施方案中，所述胎盘培养约48小时。该培养的胎盘优选通过去除用过的培养基和该培养基中的悬浮细胞并加入新鲜培养基来周期性地“饲养”。该培养的胎盘优选地在无菌条件下储存以减少污染的可能性，并且在间歇性地或周期性地加压的条件下维持以创造对所述胎盘细胞保持足够营养供应的条件。所述胎盘的灌洗和培养均可自动化和计算机化以提高效率和增加产能。

在某些实施方案中，通过向所述灌洗溶液中加入营养物、激素、维生素、生长因子或上述各项的任何组合，将胎盘干细胞在所述胎盘生物反应器中诱导增殖。可向所述增殖灌洗溶液或培养基中加入血清和其它生长因子。生长因子通常为蛋白，包括但不限于细胞因子、淋巴因子、干扰素、集落刺激因子(CSF)、干扰素、趋化因子和白细胞介素。其它可使用的生长因子包括重组人造血生长因子包括配体、干细胞因子、血小板生成素(Tpo)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子、基本成纤维细胞生长因子、源于胎盘的生长因子和表皮生长因子。

5.4.1.4从所述胎盘采集细胞

如上所述，在将所述胎盘放血和灌洗后，类胚干细胞迁移到排空的空微循环中，并根据本发明的方法在该排空的空微循环中采集，优选地通过在采集脉管中采集流出的灌洗液来采集。

在优选实施方案中，在所述胎盘中培养的细胞使用本领域技术人员已知的技术，例如密度梯度离心、磁性细胞分离、FACS分选、或者本领域熟知的其它细胞分离或分选方法从流出的灌洗液中分离，并分选，例如根据图4所示的示意图分选。

在具体实施方案中，从所述胎盘采集的细胞可通过离心从流出的灌洗液中回收，例如在室温下约5000×g离心约15分钟，该离心将细胞与污染的碎片和血小板分离。将细胞沉淀重悬在例如包含2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)中。全部单核细胞部分可使用单采血液成分法分离，优选地使用商业采集试剂盒例如LYMPHOPREP^TM(NycomedPharma，Oslo，Norway)分离。然后使用例如血细胞计数器对细胞进行计数。通常通过台盼蓝排斥评估活力。细胞分离优选地使用例如含有0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液(Sigma，St.Louis Mo.)通过“差别胰酶消化”完成。差别胰酶消化是可能的，因为以此方式胰酶消化的成纤维细胞在约5分钟之内从塑料细胞培养表面脱离，而其它贴壁群体需要使用胰蛋白酶保温超过约20-30分钟。脱离的成纤维细胞在胰酶消化和使用TrypsinNeutralizing Solution(TNS，BioWhittaker)中和胰蛋白酶之后采集。然后将所述细胞在培养基例如H.DMEM中洗涤，并重悬于例如MSCGM中。

在另一实施方案中，将分离的胎盘灌洗一段时间而不采集灌洗液，从而使所述胎盘可在采集灌洗液之前被灌洗2、4、6、8、10、12、20或24小时或者甚至几天。在此类实施方案中，例如，将灌洗液导入到所述胎盘中并允许其在采集之前占据该胎盘的脉管系统一段时间，或者在循环灌洗情况下，将所述灌洗液再循环所述时间。

在另一实施方案中，在所述胎盘生物反应器中培养的细胞通过将该细胞从所述胎盘物理切除而从所述胎盘分离。

在另一实施方案中，在所述胎盘生物反应器中培养的细胞通过切除所述胎盘的组织或其一部分，并通过本领域已知的细胞分离或分选方法例如密度梯度离心、磁性细胞分离、FACS分选等回收所培养的细胞而从所述胎盘分离。

在优选实施方案中，所述胎盘的灌洗和流出的灌洗液的采集在所述胎盘培养期间重复一次或两次，直至回收的有核细胞数量降至100细胞/ml以下。将所述灌洗液集中并轻微离心以去除血小板、碎片和去核细胞膜。然后通过聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心分离所述有核细胞，洗涤后重悬于HDMEM。为分离贴壁细胞，将等份的5-10×10⁶细胞置于几个T-75烧瓶中，用来自BioWhittaker的商用Mesenchymal Stem Cell Growth Medium(MSCGM)培养，并置于组织培养保温箱(37℃、5％CO₂)中。10到15天之后，非贴壁细胞通过PBS洗涤从所述烧瓶去除。然后用MSCGM替换PBS。优选地每天检查烧瓶中各种贴壁细胞类型的存在，尤其要检查成纤维细胞簇的存在和扩增。

在其它实施方案中，从所述胎盘采集的细胞被低温保存以备后用。本领域熟知细胞例如干细胞的低温保存方法，例如，使用Boyse等(美国专利号5,192,553，1993年3月9日授权)或Hu等(WO 00/73421，2000年12月7日公布)的方法低温保存。

5.4.2通过物理破碎分离胎盘干细胞

可通过物理裂解例如酶消化器官从哺乳动物胎盘采集胎盘干细胞。例如，所述胎盘或其一部分可被例如压碎、剪碎、切碎、切成块、剁碎、浸软等，同时与本发明的干细胞采集组合物接触，并随后用一种或多种酶消化该组织。所述胎盘或其一部分也可物理裂解并使用一种或多种酶消化，然后将所得到的材料浸入或混合入本发明的干细胞采集组合物中。可使用任何物理裂解方法，只要所述裂解方法使该器官中多数、更优选地大多数、更优选地至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、或99％的细胞通过例如台盼蓝排除法测定有活力。

所述胎盘在物理裂解和/或酶消化和干细胞回收之前可分割成几部分。例如，源于胎盘的干细胞可获自羊膜、绒毛膜、脐带、胎盘绒毛叶、或上述各项的任何组合。优选地，源于胎盘的干细胞获自包含羊膜和绒毛膜胎盘组织。通常，源于胎盘的干细胞可通过裂解一小块胎盘组织来获取，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米体积的一块胎盘组织。

优选的干细胞采集组合物包含一种或多种组织裂解酶。酶消化优选地使用酶组合，例如基质金属蛋白酶与中性蛋白酶的组合，例如胶原酶和分散酶的组合。在一实施方案中，胎盘组织的酶消化使用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和用于消化透明质酸的粘多糖酶的组合，例如胶原酶、分散酶、和透明质酸酶的组合，或者(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，Ind.)和透明质酸酶的组合。可用于裂解胎盘组织的其它酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、或弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可被血清中的α2微球蛋白抑制，因此用于消化的培养基通常不含血清。EDTA和DNase通常用于酶消化步骤以增加细胞回收效率。所述消化物优选地稀释以避免在粘性消化中滞留干细胞。

可使用任何组织消化酶的组合。组织消化酶的通常浓度包括例如胶原酶I和胶原酶IV 50-200U/mL、分散酶1-10U/mL、以及弹性蛋白酶10-100U/mL。蛋白酶可组合使用，即在同一消化反应中使用两种或多种蛋白酶，或可依次使用，以释放胎盘干细胞。例如，在一实施方案中，胎盘或其部分首先使用合适剂量的2mg/ml胶原酶I消化30分钟，然后使用0.25％胰蛋白酶在37℃消化10分钟。丝氨酸蛋白酶优选地在其它酶使用之后再使用。

在另一实施方案中，可通过在使用所述干细胞采集组合物分离所述干细胞之前，向包含所述干细胞的所述干细胞采集组合物中或所述组织裂解和/或消化的溶液中加入螯合剂，例如乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)，来进一步裂解所述组织。

应了解当整个胎盘或部分胎盘包含婴儿和母体细胞时(例如，当所述部分胎盘包含绒毛膜或绒毛叶时)，采集的源于胎盘的干细胞将包含源于婴儿和母体来源的源于胎盘的干细胞的混合物。当所述胎盘的一部分不包含或包含极少数量的母体细胞(例如羊膜)时，采集的源于胎盘的干细胞将几乎仅仅包含婴儿的源于胎盘的干细胞。

消化的胎盘组织中的胎盘干细胞可通过例如在消化的组织中培养此类细胞和其它细胞，并通过本文别处所述的差别胰酶消化分离来分离。或者，使用胎盘干细胞标记的一种或多种抗体来纯化，然后例如磁珠分离此类细胞。参见5.4.1.4节。

5.5脐带血与胎盘干细胞的组合

本发明提供了通过组合使用脐带血与胎盘干细胞治疗由早产引起或与早产有关的病症或疾病的方法。所述胎盘干细胞可为胎盘灌洗液中包含的干细胞；最初从胎盘灌洗液中采集的胎盘干细胞；从胎盘组织消化物中采集的胎盘干细胞；来自胎盘灌洗液或胎盘组织消化物的胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞已在细胞培养物中培养足够所述胎盘干细胞增殖例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次群倍增的时间；或上述各项的任何组合。在早产儿治疗中与脐带血组合的胎盘干细胞可来自单个胎盘或多个胎盘。

脐带血与胎盘干细胞的比例可根据本领域技术人员的判断确定。在某些实施方案中，与每个群中的全部有核细胞的数量相比，或与每个群中的干细胞总数相比，脐带血与胎盘干细胞的比例约为100,000,000∶1、50,000,000∶1、20,000,000∶1、10,000,000∶1、5,000,000∶1、2,000,000∶1、1,000,000∶1、500,000∶1、200,000∶1、100,000∶1、50,000∶1、20,000∶1、10,000∶1、5,000∶1、2,000∶1、1,000∶1、500∶1、200∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1,000、1∶2,000、1∶5,000、1∶10,000、1∶20,000、1∶50,000、1∶100,000、1∶500,000、1∶1,000,000、1∶2,000,000、1∶5,000,000、1∶10,000,000、1∶20,000,000、1∶50,000,000、或约1∶100,000,000。在优选实施方案中，脐带血与胎盘干细胞的比例在约20∶1到约1∶20之间，或者约1∶10、约1∶5、约1∶1、约5∶1或约10∶1。

胎盘干细胞与脐带血可在向早产儿施用之前组合，或者可分别施用。

5.5.1药物组合物

本发明还包括包含脐带血和胎盘干细胞、以及药学上可接受的载体的药物组合物。

根据本实施方案，本发明的脐带血与胎盘干细胞的组合可配制为可注射组合物(例如WO 96/39101，其全部内容通过引用结合到本文中)。在另一实施方案中，本发明的脐带血与胎盘干细胞的组合可使用例如美国专利号5,709,854、5,516,532、5,654,381所述的可聚合或交联水凝胶配制。

在另一实施方案中，本发明提供向个体施用之前将所述组合的脐带血与胎盘干细胞的每个干细胞群包持为分开的药物组合物，以依次或共同施用，从而在体内形成组合的干细胞群体。每种成分可在包含单一类型的细胞或细胞群的分开的容器，例如单个袋子(例如来自Baxter、Becton-Dickinson、Medcep、National Hospital Products、Terumo等的血液储存袋)或分开的注射器中储存和/或使用。在具体实施方案中，脐带血或源于脐带血的有核或干细胞包含在一个袋子中，胎盘灌洗液或来自胎盘灌洗液的胎盘干细胞包含在另一个袋子中。

可富集胎盘干细胞群。在具体实施方案中，通过根据标准方法去除血红细胞和/或粒细胞来富集包含胎盘干细胞的细胞群，从而使剩余的有核细胞群体相对于胎盘灌洗液中的其它细胞类型富集胎盘干细胞。此类富集的胎盘干细胞群可不经冷冻使用，或可冷冻以备后用。如果将所述细胞群冷冻，在在冷冻之前向该富集群中加入标准低温保存剂(例如DMSO、甘油、Epilife^TM CellFreezing Medium(Cascade Biologies))。

本发明的药物组合物可包含一种或多种诱导细胞分化的制剂。在某些实施方案中，诱导分化的制剂包括但不限于Ca²⁺、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角质形成细胞生长因子(KGF)、TGF-β、细胞因子(例如IL-1α、IL-1β、IFN-γ、TFN)、视黄酸、转铁蛋白、激素(例如雄激素、雌激素、胰岛素、催乳素、三碘甲状腺素、氢化可的松、地塞米松)、丁酸钠、TPA、DMSO、NMF、DMF、基质成分(例如胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素、MatrigelTM)、或上述各项的组合。

在另一实施方案中，本发明的药物组合物可包含一种或多种抑制细胞分化的制剂。在某些实施方案中，抑制分化的制剂包括但不限于人Delta-1和人Serrate-1多肽(参见Sakano等的美国专利号6,337,387)、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子，或上述各项的组合。

本发明的药物组合物可在向个体施用之前用调节TNF-α活性的化合物处理。优选的此类化合物在例如美国专利申请公布号2003/0235909中有详细描述，该专利申请全部内容结合到本文中。优选的化合物涉及ImiDs(免疫调节化合物)和(选择性细胞因子抑制药)，特别优选的化合物可获自商标名ACTIMID^TM、REVIMID^TM和REVLIMID^TM。

6.实施例

6.1实施例1：脐带血与胎盘干细胞的采集

本实施例描述了脐带血与胎盘干细胞的采集。

6.1.1脐带血的采集

使用脐带血采集试剂盒采集脐带血，例如描述于题为“脐带血采集试剂盒及其使用方法”的美国专利申请公布号2006/0060494的脐带血采集试剂盒，该专利申请的全部内容通过引用结合到本文中。

使用包含标准夹头、无菌纱布垫、碘伏棉签、无菌乙醇垫、塑料脐带血夹、玻片夹或止血夹、以及防漏可重复密封袋或罐的采集试剂盒。

采集可在胎盘娩出之前(子宫内采集)、胎盘娩出之后(子宫外采集)、或胎盘娩出之前的剖腹产期间进行。

简要地说，对脐带远端部位的静脉穿刺位点进行消毒。夹紧大采集袋引出的采集管，移除针头上的盖帽，并使针头斜面向下朝向脐静脉插入脐静脉。移除夹子以允许血液流动，并使采集袋降低到插入位点以下以允许血液通过重力填充采集袋。

当血流停止时，夹紧静脉穿刺位点，并从脐静脉中拔出针头。标记采集袋并放入保温运输容器。

将脐带血被夹紧的胎盘置于防漏可重复密封袋，然后正确密封并标记该袋。

采集之后，通过在台盼蓝染色之后的血细胞计数器确定脐带血细胞的活力。

6.1.2胎盘干细胞的分离

脐带与胎盘放血后，将所述胎盘置于室温无菌保温容器中并在出生4小时内运送到实验室。如果经检查胎盘有物理损伤迹象，例如器官破碎或脐血管撕脱，则将该胎盘丢弃。将胎盘在无菌容器中室温(23±2℃)或冷藏(4℃)保持2到20小时。将胎盘周期性地在25±3℃在无菌盐水中浸泡并洗涤以去除任何可见的表面血液或碎片。将所述脐带在距离其插入到胎盘处约5cm处横切，并使用与无菌液体路径连接的聚合物或聚丙烯导管插入所述脐血管以允许所述胎盘双向灌洗和回收流出液。本发明使用的系统可使调节、灌洗和流出液采集的所有方面在受控的环境空气条件下进行，并实时监测血管内的压力和流速、核心和灌洗液温度、和回收的流出液体积。一系列调节规程在产后的24小时内评估，所述流出液的细胞组成通过流式细胞术、光学显微术、和集落生成单位测定分析。

胎盘调节：所述胎盘在各种条件下保持，以模拟并维持适于残留细胞增殖和补充的生理相容性环境。使用包含2U/ml肝素(EJkins-Sinn，NJ)的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)冲洗所述导管。所述胎盘灌洗以每分钟50mL的速率持续，直至采集约150mL灌洗液。将该体积的灌洗液标记为“早期部分”。将所述胎盘以相同速率继续灌洗，结果采集约150mL的第二个部分，并标记为“晚期部分”。在所述过程期间，轻柔按摩所述胎盘以利于灌洗过程并帮助回收细胞材料。通过重力引流和动脉导管吸出从所述灌洗循环采集流出液。

获得父母书面同意后，从产房获得胎盘与脐带血，并在分娩后12到24小时之内在室温下处理。处理之前，去除薄膜并洗净母体侧的残留血液。使用用于血样采集的20号蝴蝶针制作的导管插入脐血管。然后使用肝素化(2U/mL)的Dulbecco′s modified Eagle Medium(H.DMEM)以15mL/分钟的速率灌洗胎盘10分钟，在1小时之内从母体侧采集灌洗液并计数有核细胞。所述灌洗和采集过程重复一次或两次直至回收的有核细胞数量降至100/mL以下。将所述灌洗液集中并轻微离心以去除血小板、碎片和去核细胞膜。然后通过聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心分离有核细胞，洗涤之后重悬于H.DMEM。为分离贴壁细胞，将等份的5-10×10⁶细胞置于几个T-75烧瓶中，用来自BioWhittaker的商用Mesenchymal Stem Cell Growth Medium(MSCGM)培养，并置于组织培养保温箱(37℃、5％CO₂)中。10到15天之后，非贴壁细胞通过PBS洗涤从所述烧瓶去除，然后用MSCGM替换PBS。每天检查烧瓶中各种贴壁细胞类型的存在，尤其要检查成纤维细胞簇的存在和扩增。

细胞回收与分离：通过在室温下以100×g离心15分钟从所述灌洗液中回收细胞。这个步骤用于将细胞与污染的碎片和血小板分离。将细胞沉淀重悬在包含2U/ml肝素和2mM EDTA(GibcoBRL，NY)的IMDM无血清培养基中。使用LYMPHOPREP^TM(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)根据生产商推荐的规程分离全部单核细胞部分，并重悬该单核细胞部分。用血细胞计数器对细胞计数。通过台盼蓝排斥评估活力。间质细胞的分离使用含有0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液(Sigma)通过差别胰酶消化完成。差别胰酶消化是可能的，因为成纤维细胞包括胎盘干细胞在约5分钟之内从塑料表面脱离，而其它贴壁群体需要保温超过约20-30分钟。脱离的成纤维细胞在胰酶消化和使用Trypsin Neutralizing Solution(TNS，BioWhittaker)中和胰蛋白酶之后采集。将所述细胞在H.DMEM中洗涤并重悬于MSCGM。使用Becton-Dickinson FACSCalibur仪器进行流式细胞术。FITC和PE标记的单克隆抗体，包括CD10、CD 34、CD44、CD45、CD54、CD90、SSEA3和SSEA4的抗体购自Becton-Dickinson and Caltag laboratories(S.San Francisco，CA.)或其它供应商，产生SH2、SH3和SH4抗体的杂交瘤来自美国典型培养物保藏中心，通过FITC或PE标记的F(ab)′2山羊抗小鼠抗体检测单克隆抗体在其培养上清液中的反应。使用商用诱导和保持培养基(BioWhittaker)根据生产商的说明进行谱系分化。

胎盘干细胞分离：培养烧瓶中贴壁细胞的镜检观察到不同形态的细胞类型，包括梭形细胞、具有大核和很多核周小液泡的圆形细胞、以及具有多个突起的星形细胞，通过该突起之一所述星形细胞附着在烧瓶上。类似的非干细胞见于骨髓、脐带和外周血的培养物中，因此认为这些细胞实际上是非干细胞。最终显现成簇的成纤维细胞是间质样干细胞的候选，通过差别胰酶消化分离并在二级烧瓶中次进行代培养。所述圆形细胞的胰蛋白酶消化后阶段显微术发现所述细胞高度颗粒化，类似于实验室产生的或购自商业来源的骨髓来源的MSC。当次代培养时，所述胎盘干细胞与其早期阶段相反，在数小时内贴壁，呈现典型的成纤维形状，并形成与参考骨髓来源的MSC相同的生长图谱。另外，在次代培养和重新饲养期间，松散结合的单核细胞被洗去，且培养物保持均质，没有任何可见的非成纤维细胞污染物。

流式细胞术：通过流式细胞术测定胎盘干细胞表面标记的表达，该表面标记包括CD10、CD29、CD34、CD38、CD44、CD45、CD54、CD90、SSEA3和SSEA4。OCT-4和ABC-p的表达使用这些标记的已知引物通过RT-PCR测定。

6.2实施例2：使用脐带血和胎盘干细胞治疗早产儿

使用脐带血和胎盘干细胞治疗了6个妊娠龄23周到36周出生并显示下列病症的早产儿：呼吸窘迫综合征(RDS)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，贫血症，脑室内出血，坏死性小肠结肠炎，早产儿视网膜病，慢性肺病(支气管肺发育异常)，感染，动脉导管未闭，呼吸暂停，低血压症，高胆红素血症，肺、眼睛、免疫系统、脑、心脏、肝或肾发育不全。

脐带血如实施例1所述采集，胎盘干细胞如2006年12月26日提交的美国专利申请公布号2007/0275362所述通过灌洗或通过酶消化获取，该专利申请通过引用结合到本文中。脐带血和胎盘干细胞以1∶1比例组合。脐带血和胎盘干细胞通过FACS分析鉴定。在分娩后一周和分娩后两周以约每千克所述早产儿体重1×10⁵到1×10⁶个CD34⁺细胞的剂量向所述早产儿静脉内注射脐带细胞和胎盘干细胞。

在脐带血和胎盘干细胞施用之前和之后测量所述早产儿的血压、心率、呼吸频率、以及多种血细胞类型的计数。

6.3实施例3：来自脐带血和胎盘灌洗液的细胞鉴定

进行以下实验以证实从早产胎盘产生组合的HPP与UCB的可行性，并确定所述组合物相对于从足月胎盘分离的细胞的细胞组成。

总体结果显示：(1)从早产胎盘采集HPP和UCB是可行的；(2)从早产胎盘分离的有核细胞总数与从足月胎盘分离的相当；(3)当标准化成相似重量时，从早产胎盘分离的HPP/UCB的TNC含量显著高于足月胎盘中显示的TNC含量；(4)从早产胎盘分离的脐带血细胞的细胞组成与足月胎盘不同；足月胎盘中CD38⁺CD45⁺细胞在统计学上显著高于早产胎盘(p值0.0146)，而早产胎盘中CD38^-CD45^-细胞在统计学上明显高(p值0.0335)；以及(5)从早产胎盘分离的HPP的细胞组成与足月胎盘没有显著差异。

从早产胎盘产生数量完全超过常规UCB干细胞分离方法的HPP和UCB干细胞是可行的。所述组合的细胞产物可用于治疗与早产有关的并发症，因为所述产物为多种祖细胞的丰富来源，具有保护内生细胞免于因缺氧死亡的营养能力，以及在体内形成血液细胞、成血管细胞和神经细胞的分化能力。

6.3.1方法：

对象：等待选择性剖腹产的妇女在产前门诊征集，自然分娩的妇女在产房征集。

脐带血与胎盘采集：采集胎盘，切断脐带并夹紧。从脐带中排出尽可能多的脐带血。然后再次夹紧脐带以防止进一步血液流失，将胎盘和脐带血立即运送到实验室。

实验室处理：到达实验室后，(在分娩后10-15分钟之内)，称量胎盘并去除胎盘膜。评估胎盘和脐带是否适合灌洗，例如脐带是否完全与胎盘连接且无撕裂迹象，且胎盘上是否没有深裂痕。然后使用保存液覆盖胎盘。然后将胎盘置于冰箱中48小时。将脐带血样品立即用于Cell-Dyn和FACS分析。

胎盘灌洗：灌洗胎盘，低温保存灌洗液。使用Masterflex L/S 7523可编程蠕动泵完成压力受控灌洗。将脐带导管插入到胎盘脐带的每条静脉中并与三通活塞连接。然后将这种装置连接到来自Utah medical的DPT100一次性压力传感器，再连接到Masterflex L/S 16蠕动泵管，该蠕动泵管然后连接到1袋注射级盐水。将血液采集袋的管子插入到脐静脉中以采集脐带血。用Labview软件监测灌洗压力，手动调节Masterflex泵到所需压力。灌洗限于3小时，每灌洗一小时后进行容量和NOC测试。

胎盘灌洗液细胞的活力测试：充分混合包含人胎盘灌洗液(HPP)的袋子，从袋中移出一小份HPP。通过用乙酸处理样品裂解污染的红细胞。红细胞裂解完成之后，每个样品进行台盼蓝染色或通过Cell Dyne 3200计数。为测定活细胞的百分比，检测显微镜视野内不摄取台盼蓝的完整细胞的数量，重复测定三次。将活细胞数除以总细胞数再乘以100。

流式细胞术：使用下列抗体对HPP或UCB或组合细胞进行流式细胞术研究：

使用缓冲液洗涤细胞，然后以一系列浓度范围(即每100μL 1×10⁶个活细胞)重悬在缓冲液中。然后将细胞用荧光共轭抗体染色、保温，然后使用缓冲液洗涤以去除过量抗体。在流式细胞仪上检测染色细胞以测定目标标记的阳性或阴性表达。

6.3.2结果

发现早产胎盘和足月胎盘的重量显著不同(分别平均为345g和731 g；p＝0.0001)。未发现来自早产胎盘和足月胎盘的细胞活力的差异显著(分别活力为93.13％和90.84％；p＝0.0724)。但是，可从早产胎盘获得的总有核脐带血细胞存在显著差异(p＝0.0001)。平均5.277×10⁷个细胞获自早产胎盘，平均1.9498×10⁸个细胞获自足月胎盘。相似地，可从早产胎盘获得的总有核灌洗细胞存在显著差异(p＝0.0016)。平均1.28×10⁷个细胞获自早产胎盘，平均3.76×10⁷个细胞获自足月胎盘。因此，可从早产胎盘的每克胎盘组织获得的有核细胞数量显著高于足月胎盘(p＝0.0001)。可从早产胎盘获得的总灌洗液+脐带血有核细胞为1.79×10⁸个。这与足月胎盘的5.71×10⁸个相比差异极为显著(p＝0.0001)。未发现每克胎盘组织的组合的总有核细胞有显著差异。

6.3.3流式细胞术

未发现来自早产胎盘和足月胎盘的脐带血中的CD34⁺细胞、CD38^-CD45⁺细胞、或CD38⁺CD45^-细胞的百分比之间有统计学上的显著差异。发现足月胎盘中的CD38⁺CD45⁺细胞数量显著高(16.68％TNC相对于早产胎盘中的2.0％TNC)，发现早产胎盘中的CD38^-CD45^-细胞数量显著高(56.52％相对于足月胎盘的24.58％)。未发现早产胎盘和足月胎盘之间源于灌洗液的CD38^-CD45⁺细胞、CD38⁺CD45^-细胞、CD38⁺CD45⁺细胞或CD38^-CD45^-细胞的百分比有统计学上的显著差异。

本发明的范围不限于本文所述的具体实施方案。实际上，根据上述描述，除本文所描述的之外的本发明的各种修改对本领域技术人员是显而易见的。此类修改意在落入所附权利要求的范围内。

本文所引用的所有参考文件其全部内容就各方面而言通过引用结合到本文中，如同每个单独的出版物、专利或专利申请特定地、单独地指出其全部内容就各方面而言通过引用结合到本文中一样。

任何出版物的引用是因为其公开早于申请日，不应解释为承认本发明不能由于在先完成而在时间上早于这样的出版物。