次黄嘌呤核苷酸在制备心肌力增强制剂中的用途的制作方法

本发明属于医药领域，涉及核苷酸的药物用途，特别涉及次黄嘌呤核苷酸在制备增强心肌力的药物制剂中的应用。

背景技术：

目前关于次黄嘌呤核苷酸(IMP)的用途，主要集中在动物与食品科学。次黄嘌呤核苷酸又名肌苷酸，通常作为一种鲜味剂，用于增加或评价肉类食物的鲜味程度。

19世纪中叶，德国的Liebig博士从牛肉汤中分离出肌苷酸；1913年，日本的小玉新太郎证实肌苷酸及其盐类具有鲜味；1960年利用微生物发酵方法生产肌苷酸和鸟苷酸等核苷酸类食品增味剂取得成功，使食品增味剂的生产发展到一个新的水平。

肌苷酸自被发现以来，国外学者从食品科学、生物化学、生理和营养学等角度对其进行了广泛的研究，研究结果主要有如下几方面：己确定肉品中肌苷酸主要来源于A T P的降解；影响肌苷酸稳定性的因素主要是温度、pH和酶的作用；不同种类的动物肌苷酸的含量有较大差异；确定了肌苷酸的化学性质及在食品中的安全性；确定了肌苷酸与谷氨酸型鲜味剂的协同作用及对食品风味的影响；生理学研究发现，肌苷酸在口腔的敏感位置主要是舌后部，舌咽神经起主要作用，但对其神经刺激在体内的转导机制有待研究；在食品工业中，已经将肌苷酸作为鲜味增强剂使用。

技术实现要素：

本发明的目的在于探索次黄嘌呤核苷酸在医药领域的新用途，具体研究其对于心肌细胞的作用，以及作为心肌力增强剂的应用。

本发明研究发现，次黄嘌呤核苷酸(IMP)具有增强心脏正性肌力并不引起心律失常的的作用，并通过实验证实了这个作用的机制。

本发明通过采用IonOptix单细胞动缘检测系统检测IMP对大鼠心肌细胞功能的影响，结果显示IMP能增强心肌细胞的收缩而对心肌细胞钙瞬变没有显著影响。

本发明通过离体心脏灌流实验，证明了IMP对心脏心功能的影响，说明IMP直接作用到心脏可以增强心室收缩压力，改善心功能。

上述实验说明，次黄嘌呤核苷酸具有增强心肌细胞或整体心脏的收缩力的作用，可应用到心肌力增强剂的制备中。

由此，本发明提供一种用于增强心肌力的药物制剂，包含次黄嘌呤核苷酸作为活性成分。可以将次黄嘌呤核苷酸和药学上可接受的辅剂制成各种形式的药物制剂。

所述“药学上可接受的辅剂”包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与活性成分次黄嘌呤核苷酸相容。运用药学上可接受的辅剂制备药物制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的药物制剂包含次黄嘌呤核苷酸作为活性成分，将次黄嘌呤核苷酸和药学上可接受的辅剂组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂。本发明的制剂可以为单位剂量形式，如片剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、栓剂、丸剂、粉剂、膏剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂等各种剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药形式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。

综上，本发明发现次黄嘌呤核苷酸可以作为一种心肌力增强剂，它能有效增强心肌细胞或整体心脏的收缩力，从而可能成为心力衰竭、心肌炎、心梗等心肌力减弱疾病的治疗成分。

附图说明

图1显示了实施例1采用IonOptix单细胞动缘探测系统同步检测IMP对大鼠心肌细胞收缩及钙瞬变的结果。

图2显示了实施例2中灌流IMP导致的左心室发展压(LVDP)以及dP/dt(左心室收缩压每分上升速度)的变化，说明灌流IMP使离体心脏的收缩功能增强。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明，但不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1、IMP增强心肌细胞收缩实验

采用IonOptix单细胞动缘检测系统检测细胞功能。

(一)大鼠心肌细胞的分离

台式液：130mM NaCl，5.4mM KCl，0.5mM MgCl₂，25mM Hepes，0.33mM NaH₂PO₄，22mM Glucose，用NaOH调节pH至7.35。台式液预先充氧气30分钟以上并在灌流过程中持续充氧。

酶液1：台式液35mL，8.75μL CaCl₂(0.2M)，II型胶原酶25mg，XIV型蛋白酶3mg；

酶液2：10mL酶液1，7.5μL CaCl₂(0.2M)；

酶液3：15mL酶液1，50μL CaCl₂(0.2M)，BSA 40mg；

复钙液：台式液20mL，100μL CaCl₂(0.2M)，BSA 40mg。

大鼠用20％乌来糖溶液麻醉(1mL/100g)，待动物麻醉后，打开胸腔，取出心脏。待心脏在冷冻台式液中排除残留血液后，将主动脉插入langendoff灌流管前端针头，并用细线结扎。使用循环水浴系统维持灌流液恒温37℃，灌流速度为3mL/min。先用无钙台式液灌流液将心脏内部血液排除后，再用酶液1灌流。用酶液2灌流循环大约15分钟，待心脏变软时将左心室剪下(不要心房及右心室)并在37℃酶液3中剪碎。剪碎的心肌组织和酶液3混悬后在离心机上以500rpm的速度离心1分钟，去除酶液，用复钙液重悬细胞沉淀。组织碎渣继续与酶液3混悬后500rpm离心1分钟，去酶液，用复钙液重悬细胞沉淀，重复3次，至碎渣没有细胞为止。将几次重悬细胞的收集液合并，静置30分钟使细胞沉淀，吸掉上清，加入适量复钙液重悬细胞即可用于后续实验。

(二)采用IonOptix单细胞动缘探测系统(IonOptix公司，美国)同步检测心肌细胞收缩及钙瞬变(Ca²⁺transient)。

将Fura-2/AM(终浓度2μg/mL)与心肌细胞室温避光孵育30min，采用双激发荧光光电倍增系统(IonOptix，美国)检测荧光信号。75W紫外氙光灯发射的光通过340nm或380nm的滤光片到达0.5Hz刺激下收缩的心肌细胞，细胞内与游离Ca²⁺结合的荧光物质被激发，其发射光在510nm处被检测并通过光电倍增管记录。细胞相继迅速被340nm和380nm激发光照射并交替扫描，细胞内游离Ca²⁺浓度的改变由上述两种波长荧光强度的比率所反映。

取孵育Fura-2/AM的适量(一般30μl)心肌细胞悬液置于倒置显微镜(Olympus)载物台上的细胞灌流小室内，以含氧台氏液灌流(1mL/min)，0.5Hz、5ms波宽的电场刺激，场刺激由灌流小室底部两侧镶嵌的铂电极产生，细胞收缩影像通过40×物镜传输到IonOptix的MyoCam照相系统并呈现在监视器上。心肌细胞肌小节(sarcomere)收缩幅度和收缩/舒张速度等指标由计算机自动实时采集并记录。细胞进入灌流小室后，立即下沉并与小室底部很快粘附，灌流液在常规速度不能将其冲走。选取长杆状、细胞边缘折光性好，横纹清晰，细胞膜上无空泡的心室肌细胞进行实验观察。给药前细胞收缩幅度恒定至少5min以上。系统记录的结果如图1所示，实验中所用的IMP的浓度为10^-4M。

统计时以未给药前细胞肌小节收缩幅度值为基础值，加药后，系统记录到细胞收缩的幅度值与基础值比较所得的值来反应加药后对心肌细胞的影响，如图1所示。从图1可以看出，IMP灌流后心肌细胞的收缩幅度增强。

实施例2、离体心脏灌流检测IMP对心脏心功能的影响

Krebs-Henseleit(K-H)灌流液：NaCl 118.0mmol/L、KCI 4.7mmol/L、KH₂PO₄1.2mmol/L、MgSO₄·7H₂O 1.2mmol/L、CaCl₂ 2.5mmol/L、NaHCO₃ 2.5mmol/L、Glucose 11.1mmol/L。

大鼠用20％乌来糖溶液麻醉(0.5mL/100g)，待动物麻醉后，舍下静脉注射肝素，打开胸腔，迅速取出心脏置于4℃的Krebs-Henseleit(K-H)灌流液中，轻轻挤压心脏，排空心脏内残留的血液，立即将主动脉固定于langendorff灌流装置的插管上，经三通管开关接K-H灌流液，灌流液以95％O₂和5％CO₂充分饱和、灌流压力约70mmHg，灌流温度为37℃左右。从左心耳插入尖端带有水囊的导管，调节水囊充水程度，使心脏的前负荷在10mmHg以内，通过压力传感器接MedLab生物信号釆集处理系统记录左心室内压力曲线，采集各心功能指标。

首先用Krebs-Henseleit(K-H)灌流液灌流心脏至少10min，待心脏稳定收缩舒张后，通过三通管开关调节灌流IMP，同时检测心功能变化，结果如图2所示，可以看出Krebs-Henseleit(K-H)灌流液灌流后，离体心脏心室收缩舒张压力变化平稳，如图2中A段所示，灌流IMP后，离体心脏心室收缩最大压力增强，如图2中B段所示；心脏每分钟收缩压变化(dP/dt部分)也增强，说明心脏灌流IMP后，心脏收缩能力增强，心功能改善。