一种具有生物活性的复合敷料及其制备方法与流程

本发明属于生物医用敷料领域，具体涉及一种具有生物活性的复合敷料及其制备方法。

背景技术：

随着对皮肤损伤治疗研究的进展，组织工程皮肤是近年来研究的热点，有着广阔的临床应用前景。皮肤在面临大面积烧伤或损坏时急需获得大量的表皮覆盖以促进皮肤组织的再生与修复。天然真皮替代物具有完整的胶原三维结构，生物相容性好，在组织成分上与自体皮肤最接近，在皮肤重建中具有较高的应用价值。天然真皮替代物取材于同种异体皮或异种皮，通过化学和生化等手段，去除了皮肤中的表皮层及含抗原成分的细胞仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质，具有抵抗原性、良好的生物学性能和力学性能，是一种理想的皮肤修复材料。异种(猪)脱细胞真皮基质相比于异体脱细胞真皮基质具有来源广泛，价廉质优等优点，并且在胶原含量、结构上与人体皮肤具有很高的组织同源性并且高度相似，已在临床上取得广泛应用。但是这类脱细胞真皮基质由于缺乏活的成纤维细胞，延缓真皮重建，只是达到真皮替代的效果，而没有达到表皮重建的效果，不能促进伤口的愈合。因此如何制备出具有生物活性的脱细胞真皮基质是克服脱细胞真皮基质真皮修复缓慢的有效方法。

在人体伤口愈合的过程中，成纤维细胞分泌胶原是伤口皮肤愈合的根本原因。所以，凡是促进皮肤成纤维细胞生长和分泌作用的因素均为备选的有利因素。成纤维细胞生长因子(FGF)不但可以有力的促进成纤维细胞的生长和分泌作用，同时，对肌肉等组织也有很强的促损伤修复功能。但是FGF在体内的半衰期很短，全身应用后容易失活而难以发挥其生理活性，而且FGF在溶液中的稳定性较差，极易受温度、pH、有机溶剂、酶等因素影响而失活，局部穿刺分次给药也难以产生有效作用，不适合长期供药。因此如何有效地保护和释放生长因子是目前亟待解决的问题。而利用缓释载体负载生长因子，既能保护生长因子的生物活性，又可以使生长因子平稳缓慢释放，从而持续促进组织再生修复。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中的缺陷，提供一种具有生物活性的复合敷料及其制备方法，该复合敷料中具有生物活性的复合猪脱细胞真皮基质免疫原性低，来源丰富，价格低廉，其制备方法简单；该复合敷料保质期长，在保存及运输过程中以干物质形态存在，使成纤维细胞生长因子(FGF)的生物活性可以长期保持；该复合敷料在使用时，复合敷料与伤口接触表面能产生水凝胶层，产生的水凝胶层可以使成纤维细胞生长因子(FGF)达到缓慢释放的效果。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种具有生物活性的复合敷料，所述的复合敷料由具有生物活性的复合猪脱细胞真皮基质构成，所述的复合敷料为单层结构；所述的复合猪脱细胞真皮基质由猪脱细胞真皮基质、丝素蛋白、成纤维细胞生长因子和庆大霉素构成。丝素蛋白材料具有良好的透氧性、无毒性、无刺激性，可生物降解，具有优良的生物相容性等特性；同时，丝素蛋白作为缓释载体负载成纤维细胞生长因子与猪脱细胞真皮基质，既能保护生长因子的生物活性，又可以使生长因子平稳缓慢释放，从而持续促进组织再生修复。

进一步的，所述复合猪脱细胞真皮基质中各成分按重量份数计：由猪脱细胞真皮基质5~8份、丝素蛋白50~100份、成纤维细胞生长因子0.2~0.5份和庆大霉素2份构成。

更进一步的，所述的猪脱细胞真皮基质为参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得。

更进一步的，所述的丝素蛋白为家蚕后部丝腺来源的丝素蛋白。

为实现上述目的，本发明的另一个技术方案为：一种具有生物活性的复合敷料的制备方法，所述制备方法的具体步骤如下：

（1）将丝素蛋白加入200ml去离子水中，搅拌至全部溶解，然后加入成纤维细胞生长因子和庆大霉素，温度为4-10℃，转速为1000-1500 r/min，搅拌1~2h，形成具有生物活性的混合液，置于4℃冰箱中，备用；

（2）将猪脱细胞真皮基质用75-95%的乙醇进行梯度脱水，然后置于无水乙醇中进行超声处理，超声时间为60~120min，在无菌环境下将猪脱细胞真皮基质取出，紫外照射灭菌，紫外照射时间为3h；

（3）将经步骤（2）处理的猪脱细胞真皮浸泡于步骤（1）制备的具有生物活性的混合液中，在温度为2~6℃，转速为1000 r/min下搅拌1-2h，然后再用无水乙醇浸泡30min，取出、-80℃冷冻干燥，得到具有生物活性的复合猪脱细胞真皮基质；

（4）将步骤（3）制备的具有生物活性的复合猪脱细胞真皮基质在无菌环境下用分切机裁剪分切、包装、灭菌，得到具有生物活性的复合敷料。

进一步的，所述步骤（1）中具有生物活性的混合液中丝素蛋白的质量浓度为0.25~0.5g/mL。

更进一步的，所述步骤（1）中具有生物活性的混合液中成纤维细胞生长因子的质量浓度为0.01~0.05ug/ml。

更进一步的，所述步骤（1）中每100ml具有生物活性的混合液中含有庆大霉素2~3万个活性单位。

更进一步的，所述步骤（2）中梯度脱水的具体步骤为：将猪脱细胞真皮基质浸泡于75%的乙醇中5h，取出后置于85%的乙醇5h，取出后再置于95%的乙醇中5h，再置于无水乙醇中进行超声处理。

优选的，所述步骤（3）中具有生物活性的混合液与猪脱细胞真皮基质的质量比为50:1。

本发明的有益效果为：

（1）本发明公开的复合敷料及其制备方法，具有生物活性的脱细胞真皮基质敷料免疫原性低，来源丰富，价格低廉，其制备方法简单。

（2）本发明以丝素蛋白作为缓释载体通过将成纤维细生长因子胞（FGF）复合到猪脱细胞真皮当中，不仅克服了猪脱细胞真皮基质缺乏生物活性，真皮修复缓慢的缺点；同时，也保护了生长因子的生物活性，使生长因子平稳缓慢释放，从而持续促进组织再生修复。

（3）本发明制备的复合敷料添加的丝素蛋白，使复合敷料在用生理盐水浸润时表面能产生水凝胶层，与伤口接触时能舒缓伤口痛楚减少创面的水分流失，且凝胶层可以使成纤维细胞生长因子(FGF)和庆大霉素达到缓慢释放的效果，长时间作用于患处，能达到持续抗菌，促进伤口愈合的效果，减少换药次数，减轻病人换药的痛苦。

（4）本发明公开的制备方法中对猪脱细胞真皮基质进行反复梯度脱水及超声处理，能有效地去除原有细胞等成份，从而降低排异反应，并能使得猪脱细胞真皮基质结构疏松，使得丝素蛋白和成纤维细生长因子胞（FGF）能更加均匀地复合在猪脱细胞真皮基质当中。

（5）本发明通过将猪脱细胞真皮基质、丝素蛋白、成纤维细胞生长因子（FGF）和庆大霉素进行复合制备的具有生物活性的复合敷料，相比于普通的猪脱细胞真皮基质敷料具有更好地促伤口愈合的作用，而庆大霉素的添加能使复合敷料局用抗菌的效果。

附图说明

图1为实验组1~3制备的具有生物活性的复合敷料与对比例2进行成纤维细胞生长因子(FGF)释放效果分析对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

实施例1

一种具有生物活性的复合敷料由具有生物活性的复合猪脱细胞真皮基质构成，为单层结构；所述复合猪脱细胞真皮基质由以下成分按重量份数计构成：猪脱细胞真皮基质5份、丝素蛋白50份、成纤维细胞生长因子0.2份和庆大霉素2份；所述的猪脱细胞真皮基质为参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得，所述的丝素蛋白为家蚕后部丝腺来源的丝素蛋白。

实施例2

一种具有生物活性的复合敷料由具有生物活性的复合猪脱细胞真皮基质构成，为单层结构；所述复合猪脱细胞真皮基质由以下成分按重量份数计构成：猪脱细胞真皮基质6份、丝素蛋白80份、成纤维细胞生长因子0.3份和庆大霉素2份；所述的猪脱细胞真皮基质为参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得，所述的丝素蛋白为家蚕后部丝腺来源的丝素蛋白。

实施例3

一种具有生物活性的复合敷料由具有生物活性的复合猪脱细胞真皮基质构成，为单层结构；所述复合猪脱细胞真皮基质由以下成分按重量份数计构成：猪脱细胞真皮基质8份、丝素蛋白100份、成纤维细胞生长因子0.5份和庆大霉素2份；所述的猪脱细胞真皮基质为参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得，所述的丝素蛋白为家蚕后部丝腺来源的丝素蛋白。

实施例4

实施例1～实施例3任一例具有生物活性的复合敷料，其制备方法的具体步骤如下：

（1）将丝素蛋白加入200ml去离子水中，搅拌至全部溶解，然后加入成纤维细胞生长因子和庆大霉素，温度为4-10℃，转速为1000-1500 r/min，搅拌1~2h，形成具有生物活性的混合液，置于4℃冰箱中，备用；所述的具有生物活性的混合液中丝素蛋白的质量浓度为0.25~0.5g/mL，成纤维细胞生长因子的质量浓度为0.01~0.05ug/ml， 每100ml具有生物活性的混合液中含有庆大霉素2~3万个活性单位；

（2）将猪脱细胞真皮基质用75-95%的乙醇进行梯度脱水，具体步骤为：将猪脱细胞真皮基质浸泡于75%的乙醇中5h，取出后置于85%的乙醇5h，取出后再置于95%的乙醇中5h；然后置于无水乙醇中进行超声处理，超声时间为60~120min，在无菌环境下将猪脱细胞真皮基质取出，紫外照射灭菌，紫外照射时间为3h；

（3）将经步骤（2）处理的猪脱细胞真皮浸泡于步骤（1）制备的具有生物活性的混合液中，所述具有生物活性的混合液与猪脱细胞真皮基质的质量比为50:1，在温度为2~6℃，转速为1000 r/min下搅拌1-2h，然后再用无水乙醇浸泡30min，取出、-80℃冷冻干燥，得到具有生物活性的复合猪脱细胞真皮基质；

（4）将步骤（3）制备的具有生物活性的复合猪脱细胞真皮基质在无菌环境下用分切机裁剪分切、包装、灭菌，得到具有生物活性的复合敷料。

实施例5

对比例1：为单独的猪脱细胞真皮基质（参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得）。

对比例2：为成纤维细胞生长因子与猪脱细胞真皮基质复合的敷料（参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得）。

实验组1~3：为实施例1～3，采用实施例4的方法制备而成。

将上述实施例1～3所制备的具有生物活性的复合敷料与对比例2进行成纤维细胞生长因子(FGF)释放效果分析对比，结果如图1所示。

从图1结果所示，本发明实施例1～3所制备的具有生物活性的复合敷料具有长效持续释放成纤维细胞生长因子FGF的效果，而对比例2则在第四天有一个明显的突释过程，到14天时以基本释放完全，无长效持续释放的效果。

实施例6

对比例1：为单独的猪脱细胞真皮基质（参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得）。

对比例2：为成纤维细胞生长因子与猪脱细胞真皮基质复合的敷料（参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得）。

实验组1~3：为实施例1～3，采用实施例4的方法制备而成。

将上述实施例1～3所制备的具有生物活性的复合敷料与对比例1~2进行抗菌试验分析，结果如下表所示：

从上表可以看出，本发明实施例1～3所制备的具有生物活性的复合敷料具有很好的杀菌、抗菌效果，而对比例1和2基本没有抗菌效果。

实施例7

对比例1：为单独的猪脱细胞真皮基质（参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得）。

对比例2：为成纤维细胞生长因子与猪脱细胞真皮基质复合的敷料（参考申请号为200410022506.9所公开的脱细胞真皮基质材料的制备方法所制得）。

实验组1~3：为实施例1～3，采用实施例4的方法制备而成。

将上述实施例1～3所制备的具有生物活性的复合敷料、对比例1与成纤维细胞L929进行共培养对细胞的相对增长率进行分析，结果如下表所示：

从上表可以看出，本发明实施例1～3所制备的具有生物活性的复合敷料具有明显的促细胞生长效果，而对比例1则没有促细胞生长的效果，显然通过将猪脱细胞真皮基质、丝素蛋白和成纤维细胞生长因子复合而成的具有生物活性的复合敷料具有明显的促细胞生长作用。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。