一种人工器官用生物组织材料及其制备方法与流程

本发明涉及生物医学替代材料技术领域，特别是涉及用于修补人体软组织中大/小孔径血管缺损的生物医学工程支架材料技术及其制备方法。

技术背景

随着心血管疾病日益增多，尤其是血管堵塞可能会造成血液中含氧量低、间接的器官衰竭甚至死亡使得临床上需要大量的血管支架替代材料。自体血管组织资源有限，远远不能满足血管移植的需求。目前，天然组织来源的异体血管已广泛应用于临床，用以弥补自体血管来源的稀缺。天然组织来源血管具有和自体血管类似的化学组分和利于细胞增殖与黏附的微观结构，与细胞亲和性强，能为细胞生长、增殖、分化及功能发挥提供近似体内组织发生发育的细胞外基质支架条件。但由于天然组织自活体取出后迅速发生降解且有严重的抗原性，在移植前需进行化学交联修饰。本发明的发明人所在实验室前期的研究成果表明：氧化羧甲基纤维素(DCMC)是一种较理想的氧化多糖交联剂，经它交联的血管组织不仅能较长时间保存良好的力学性能，且有效提高其抗酶降解性，同时消除了材料的抗原性；与传统交联剂戊二醛等相比，它具有良好的细胞相容性和与新生组织生长速率匹配的降解速率，这大大拓展了其应用范围。但与其他已投入临床应用的传统交联剂类似，DCMC交联血管也存在内皮化效果差、易钙化、易形成血栓等缺陷，几乎无法用于小孔径血管的修复。

有效改善材料的内皮化效果是制备血管支架替代材料亟待解决的首要问题。规整排列的单层内皮细胞层可以保持血管内壁光滑，抑制血栓形成；此外，它还可以保证血液正常流动，防止钙化，延长血管支架的使用寿命。因此，理想的血管支架替代材料除了应具备良好的生物相容性，与周围组织匹配的力学性能以及一定的抗酶降解性能，还应具备一定的“促内皮化能力”。目前，促进血管支架材料内皮化的方法主要有两种，一种为生长因子法，另一种为表面的蛋白修饰法。生长因子法由于生长因子的半衰期短、释放速率不易控制等缺陷难以达到最优的内皮化效果；表面的蛋白修饰法则由于其价格非常昂贵，难以投入临床应用。

为了解决上述血管支架替代材料存在的不足，需要寻找一种新的材料修饰方法，使之在保存其良好生物相容性与交联理化性能的同时，可以改善材料的内皮化作用，进一步促进血管内壁单层细胞层的形成，以制备出更为理想的血管支架替代材料。

技术实现要素：

针对现有技术血管支架替代材料存在的不足，本发明的目的旨在提供一种既有良好的生物相容性，与周围组织匹配的力学性能以及一定的抗酶降解性能，又有较好的“促内皮化能力”的人工器官用生物组织材料及其制备方法，使其具有双重防治改性效果。

本发明提供的人工器官用生物组织材料，是一种由脱细胞猪主动脉血管采用粒径微米级的掺锶聚磷酸钙(SCPP)进行掺锶修饰改进内皮化后，再经氧化羧甲基纤维素钠(DCMC)交联固定制取的生物组织材料，是一种有机/无机复合软组织工程支架材料。

上述掺锶修饰改进血管内皮化的SCPP，优先选用锶/钙摩尔比(6-9)：(91-94)、粒径20μm-50μm的SCPP粉末。

上述人工器官用生物组织材料，可通过括以下制备步骤的方法来制备：

(1)将脱细胞猪主动脉血管浸泡于0.5mg/ml-1.5mg/ml的SCPP/PBS(磷酸盐缓冲液)悬浊液中，交替采用震荡和真空两种吸附方式于不高于40℃下进行吸附掺锶4-6h，实现掺锶修饰改进血管内皮化；

(2)将经步骤(1)掺锶修饰改进内皮化的血管浸泡于质量浓度0.5-1.0％的DCMC有机溶液中，于25-40℃下震荡交联反应48-120h；

(3)将经步骤(2)交联后的血管材料浸泡于温度0-10℃、质量浓度0.5-4％的NaBH₄/乙醇溶液中，使血管中的亚胺键还原为水相中可稳定存在的碳氮单键；

(4)将经步骤(3)还原处理后的血管材料用生理盐水反复漂洗后，即制得以生物来源组织为基体的人工器官用生物组织材料。

在本发明上述制备方法中，所述吸附掺锶最好于35-40℃下进行；且最好交替在恒温震荡箱中采用水浴震荡和在真空干燥箱中在真空下进行吸附掺锶，以保证SCPP颗粒充分吸附。

在本发明上述制备方法中，为了保证血管与交联液充分均匀接触，经掺锶修饰改进内皮化的血管浸泡于质量浓度0.5-1.0％的DCMC有机溶液，最好是采用摇床在持续轻微震荡条件下于35-37℃联反应48-76h；交联过程需保证DCMC交联液的用量充足，为此，交联剂DCMC有机溶液的用量一般为每1cm²血管不少于1ml，最好控制在1ml-5ml的范围。

在本发明上述制备方法中，经交联后的血管材料最好浸泡于温度4-6℃、质量浓度0.5-1.5％的NaBH₄/乙醇溶液中，使血管材料中的亚胺键还原为水相中可稳定存在的碳氮单键。

在本发明的上述制备方法中，所述脱细胞猪主动脉血管为经下述方法处理得到的猪主动脉血管：

(1)来自屠宰场的血管热缺血时间不超过6h的猪主动脉血管，用温度不大于10℃的生理盐水洗去血迹，剔去血管表面附着的脂肪层；

(2)将经步骤(1)处理后的猪主动脉血管分别依次先浸泡于0.01-0.1％胰蛋白酶/PBS溶液和体积浓度不低于1％的曲拉通溶液中于10-30℃下震荡脱去细胞成分得到网状支架的血管。

在本发明上述制备方法中，所述掺锶聚磷酸钙为经下述方法制备的掺锶聚磷酸钙：

(1)将Sr/Ca摩尔比为6-9：91-94的碳酸锶和碳酸钙混合粉末加入浓度为2mol/L-3mol/L的磷酸溶液中，持续搅拌至粉末完全溶解，密闭静置不少于8小时后，于60℃-90℃加热旋蒸出磷酸二氢锶和磷酸二氢钙的混合结晶；

(2)用乙醇充分洗涤至pH呈中性，装入瓷盘中经红外灯干燥后在马弗炉中经两次高温烧结:第一次以室温为起始点以8℃/min-10℃/min升温至400℃-600℃，保温8h-10h；随后升温至1000℃-1200℃，保温40min-1h，将坩埚从马弗炉中取出，迅速将其中的熔融、粘稠液体倒入由去离子水冻成的冰水混合物中淬火，得到块状透明烧料；第二次烧结将所得烧料以室温为起点以同样的升温速率升温至700℃-900℃，保温4h-6h,即制备出6％-9％的掺锶聚磷酸钙；

(3)将制取的掺锶聚磷酸钙以无水乙醇为分散剂在球磨机中研磨成粒径为20μm-50μm的粉末，即制得用于物理吸附修饰的SCPP微米级颗粒。

在制备人工器官用生物组织材料的研究完成过程中，发明人在前期研究中经过反复试验最终选定氧化羧甲基纤维素作为猪主动脉血管的交联剂。氧化羧甲基纤维素是羧甲基纤维素的衍生物，羧甲基纤维素是一种水溶性的纤维素醚，且其造价低廉、资源广泛可再生，生物相容性好，无免疫原性，不会诱发炎性反应。用高碘酸钠对羧甲基纤维素进行选择性氧化，在保留其良好生物相容性的前提下，引入高反应活性的醛基，能够与氨基酸或蛋白质发生反应。氧化羧甲基纤维素作为一种天然生物交联剂，具有较高的反应活性、较低的细胞毒性和优异的生物相容性；经它交联的主动脉血管具有可有效保持天然生物材料富有韧性、弹性好的力学性能优势，不会破坏生物来源材料促进细胞黏附与增殖的微观网状结构且有效消除材料的抗原性，抗酶降解性能和生物相容性优异。但是，DCMC交联血管也存在内皮化效果差、易钙化、易形成血栓等缺陷，几乎无法用于小孔径血管的修复。

为了进一步提高人工器官用生物组织材料的生物相容性与活性，考虑引入锶元素对交联后血管支架表面修饰改性，希望通过锶元素的引入促进血管的内皮化效果。掺锶聚磷酸钙(SCPP)是一种含有锶元素的无机聚合物，由于它与天然骨的组成成分类似，故具有生物相容性好、抗酶降解性能优异且可控、力学强度高耐磨损等诸多优点。值得一提的是：由于其可控的降解性能，锶离子可以持续恒速地从SCPP中释放出来，长期促进内皮细胞的生长与管腔表面内皮细胞层的形成，有效改善材料的内皮化效果,保证血液正常流动，防止钙化，延长血管支架的使用寿命。

本发明是以氧化羧甲基纤维素为交联剂，以猪主动脉血管为主体，以SCPP微米级颗粒为掺锶修饰物制备的人工器官用生物组织材料，它既保留了天然生物组织中利于细胞增殖黏附的微观网状结构，又有效消除其抗原性，提高其力学性能与抗酶降解性能。DCMC的交联可以有效抑制改性后血管的钙化，不易变得僵硬，并能减小炎症反应，克服了传统交联剂的诸多缺陷。通过引入SCPP微米级颗粒，以物理吸附作用对交联血管进行掺锶改性，促进血管内壁形成单层内皮细胞层，抑制血栓形成；有效改善材料的内皮化效果,保证血液正常流动，防止钙化，延长血管支架的使用寿命，很适合作为血管替代材料，为血管的修复治疗奠定了坚实的基础。

后面的实施例充分表明了本发明提供的以无机掺锶聚磷酸钙(SCPP)微米级颗粒修饰、以氧化羧甲基纤维素钠(DCMC)交联固定猪主动脉血管得到的人工器官用生物组织材料，作为有机/无机复合软组织工程支架材料，不仅能较长时间保存良好的力学性能，有效提高其抗酶降解性，同时消除了材料的抗原性；且它有优异的“促内皮化效果”，有效抑制钙化，防止血栓的形成。是一种种既有良好的生物相容性，与周围组织匹配的力学性能以及一定的抗酶降解性能，又有较好的“促内皮化能力”的具有巨大临床应用前景的新型血管支架替代材料。

附图说明

附图1新鲜样及DCMC/SCPP交联修饰样的EDS谱图。图中1-a为新鲜样的元素含量图，图中1-b为DCMC/SCPP交联修饰样的元素含量图。

附图2交联前后材料在D-Hanks溶液中浸泡一定时长后(分别为0d,1d,3d,7d,15d和30d)的力学稳定性。图中2-1为最终断裂强度随浸泡时间的变化柱状图；图中2-2为弹性模量随浸泡时间的变化柱状图。其中*表示与新鲜样有显著性差异，P＜0.05。

附图3内皮细胞在与经不同方式修饰处理的血管复合培养的生长曲线图。

附图4内皮细胞在与经不同方式修饰处理的复合培养4d的形态学扫描电镜照片(放大500倍)。图中4-a中的材料为新鲜样，图中4-b中的材料为DCMC交联血管样，图中4-c中的材料为DCMC/SCPP交联修饰血管样，图中4-d中的材料为GA交联血管样。

附图5内皮细胞在与经不同方式修饰处理的复合培养4d的FDA/PI活死细胞染色图，其中(a)-(d)为FDA染色的活细胞显绿色荧光图，(a’)-(d’)为PI染色的死细胞显红色荧光图。图中(a)和(a’)的材料为新鲜样，图中5(b)和(b’)中的材料为DCMC交联血管样，图中5(c)和(c’)中的材料为DCMC/SCPP交联修饰血管样，图中5(d)和(d’)中的材料为GA交联血管样。

具体实施方案

下面给出本发明的实施案例，并通过实施例对本发明进行进一步的具体描述。需要特别指出的是：实施例只是就本发明做进一步的阐释说明，不应理解为本发明的保护范围仅限于此例。实际上，凡基于本发明的相关内容实现的技术均应属于本发明的保护范围。

1.以无机掺锶聚磷酸钙(SCPP)微米级颗粒修饰氧化羧甲基纤维素(DCMC)

交联固定猪主动脉血管制备血管支架替代材料实施例

实施例1

将Sr/Ca摩尔比为8:92的碳酸锶和碳酸钙混合粉末加入浓度为2mol/L的磷酸溶液中，持续搅拌至粉末完全溶解为止，密闭并静置8小时。随后，将溶液转移至梨形瓶中，80℃加热旋蒸出磷酸二氢锶和磷酸二氢钙的混合结晶。随后，用乙醇充分洗涤至pH呈中性，装入瓷盘中经红外灯干燥后在马弗炉中经两次高温烧结:第一次以室温为起始点以10℃/min的升温速率至600℃，保温8h；随后升温至1100℃，保温1h。将坩埚从马弗炉中取出，迅速将其中的熔融、粘稠液体倒入由去离子水冻成的冰水混合物中淬火，得到块状透明烧料。第二次烧结将所得烧料以室温为起点以同样的升温速率升温至800℃，保温6h,即制备出8％的掺锶聚磷酸钙。将制取的掺锶聚磷酸钙以无水乙醇为分散剂在球磨机中研磨成粒径为20μm-50μm的粉末，即制得用于物理吸附修饰的SCPP微米级颗粒。

实施例2

将将Sr/Ca摩尔比为7:93的碳酸锶和碳酸钙混合粉末加入浓度为2mol/L的磷酸溶液中，持续搅拌至粉末完全溶解为止，密闭并静置8小时。随后，将溶液转移至梨形瓶中，80℃加热旋蒸出磷酸二氢锶和磷酸二氢钙的混合结晶。随后，用乙醇充分洗涤至pH呈中性，装入瓷盘中经红外灯干燥后在马弗炉中经两次高温烧结:第一次以室温为起始点以8℃/min的升温速率至600℃，保温10h；随后升温至1200℃，保温1h。将坩埚从马弗炉中取出，迅速将其中的熔融、粘稠液体倒入由去离子水冻成的冰水混合物中淬火，得到块状透明烧料。第二次烧结将所得烧料以室温为起点以同样的升温速率升温至800℃，保温8h,即制备出8％的掺锶聚磷酸钙。将制取的掺锶聚磷酸钙以无水乙醇为分散剂在球磨机中研磨成粒径为20μm-50μm的粉末，即制得用于物理吸附修饰的SCPP微米级颗粒。

实施例3

将Sr/Ca摩尔比为6:94的碳酸锶和碳酸钙混合粉末加入浓度为2mol/L的磷酸溶液中，持续搅拌至粉末完全溶解为止，密闭并静置8小时。随后，将溶液转移至梨形瓶中，80℃加热旋蒸出磷酸二氢锶和磷酸二氢钙的混合结晶。随后，用乙醇充分洗涤至pH呈中性，装入瓷盘中经红外灯干燥后在马弗炉中经两次高温烧结:第一次以室温为起始点以10℃/min的升温速率至600℃，保温8h；随后升温至1100℃，保温1h。将坩埚从马弗炉中取出，迅速将其中的熔融、粘稠液体倒入由去离子水冻成的冰水混合物中淬火，得到块状透明烧料。第二次烧结将所得烧料以室温为起点以同样的升温速率升温至800℃，保温6h,即制备出6％的掺锶聚磷酸钙。将制取的掺锶聚磷酸钙以无水乙醇为分散剂在球磨机中研磨成粒径为20μm-50μm的粉末，即制得用于物理吸附修饰的SCPP微米级颗粒。

实施例4

将自屠宰场活杀猪体上取下的主动脉血管用4℃生理盐水洗去多余的血迹，用镊子小心地剔去血管表面附着的脂肪层。猪主动脉自活体取出至进行交联处理的时间(热缺血时间)不超过6h，且需在4℃的冰生理盐水中浸泡运输。将脱细胞血管置于1mg/ml的SCPP/PBS悬浊液中6h进行以物理吸附作用为主的掺锶修饰，过程中交替在恒温震荡箱中37℃震荡和在真空干燥箱中抽真空以保证SCPP颗粒充分吸附。将血管置于1％的DCMC有机溶液体系中进行交联处理，在恒温震荡箱中37℃持续震荡反应72h以上。反应时，需保证DCMC交联液的用量充足：每1cm²的组织样块用1.5ml的交联液进行处理；为了保证血管与交联液充分均匀接触，优先选择在摇床内有轻微震动的条件下进行交联处理。由0.625％戊二醛/PBS溶液交联的血管作为实验的对照样。随后，将试样于4℃下重新浸泡于1％的NaBH₄/乙醇溶液中，使亚胺键还原为水相中可稳定存在的碳氮单键。经生理盐水反复漂洗后即制得以生物来源组织为基体的血管替代材料。

2.人工血管支架材料性能指标测试实施例

(1)元素分析测试实施例

EDS元素分析是一种可以精确确定固体样品表面元素成分的方法，它可以对绝大部分元素进行定性、定量分析，主要应用于表面元素分析、化合物结构鉴定等领域。经过DCMC/SCPP的交联修饰，血管支架的元素组成会发生明显变化。通过EDS分析，确定交联修饰前后血管支架的元素组成。取经过交联和掺锶修饰处理的血管样块，经冷冻干燥后进行EDS分析，确定是否有锶元素引入。

从附图1看出：新鲜样中完全检测不到Sr的信号；而经DCMC/SCPP两步修饰的血管材料在其表面元素分析的谱图中出现了Sr的明显出峰，说明这一修饰方法能有效引入锶元素，粘附在血管表面和内部。

(2)交联修饰血管在D-Hanks溶液中的力学稳定性测试实施例

作为血管支架替代材料的生物组织工程材料，DCMC/SCPP两步修饰固定血管的理化性能表征主要侧重在力学稳定性上。分别测试在D-Hanks溶液中浸泡0d,1d,3d,7d,15d和30d的交联试样的最大载荷与弹性模量值。不同修饰方法的血管材料的力学稳定性能采用INSTRON公司的302instron万能材料试验机测试:试样尺寸为40mm×5mm的长方形条状样品，每组样品5个，加载速度10mm/min。

从附图2可以看出：本实验中以新鲜样未经D-Hanks溶液浸泡时所具有的最大载荷与弹性模量值作为经交联处理的血管样条应达到的力学强度最低值，用以评价血管在交联、后期修饰处理后力学强度与力学稳定性的变化。

未经D-Hanks溶液浸泡时(第0天)，经交联处理血管的力学强度明显增大，且单纯经DCMC交联样的力学强度要略好于DCMC/SCPP联合修饰样。这说明每个氧化多糖分子链中有两个或两个以上的活性官能团，可以与血管中的氨基反应形成分子内或分子间交联，且NaBH₄还原和掺入微米级SCPP颗粒都不会破坏这种稳定的交联结构。这说明DCMC是一种有效的新型组织交联剂，它可以在一段时间内保持材料的力学强度。

在经D-Hanks溶液浸泡后的贮存初期，DCMC交联后血管样条和DCMC/SCPP联合修饰的产品在D-Hanks溶液中俱显示较好的力学稳定性；在贮存一段时间后(约在7或15d时)，它们的力学强度有略微的降低，但始终高于新鲜样，这可能是因为DCMC作为一种氧化多糖本身会发生降解，致使在组织表面形成微孔使其与酶接触的机会增大。经DCMC/SCPP两步修饰的血管试样在贮存同样时间段后其力学强度略好于单纯经DCMC交联的试样。在用交联剂处理后，血管的弹性模量也有明显增大，但是在D-Hanks溶液中浸泡7d后，单纯经DCMC交联的样块弹性模量逐渐降低，最终几乎与开始时的新鲜样类似。而DCMC/SCPP联合修饰样的弹性模量减小速度相对较慢。这可能是因为SCPP的微小颗粒会减小血管组织与溶液的接触的机会，起到一定的保护作用。这说明DCMC交联剂可以在一段时间内保持材料的力学稳定性；而引入锶元素的二次修饰也对其力学稳定性有一定改善。

(3)细胞增殖实验实施例

内皮细胞在血管支架表面的正常生长对血管替代材料功能的发挥起着至关重要的作用。规整排列的单层内皮细胞层可以保持血管内壁光滑，抑制血栓形成；此外，它还可以保证血液正常流动，防止钙化，延长血管支架的使用寿命。为了定量表征不同交联剂和不同交联修饰方法处理过的血管对HUVECs细胞生长、增殖的影响，需进行MTT测试。

附图3中展示了经不同交联剂和不同交联方法处理的血管样块在与HUVECs共同培养时显示出的细胞毒性。从图中可以看出：除新鲜样和GA交联样，经过交联处理的组织样块其细胞毒性都有一定降低，且随与材料接触时间的延长，细胞可以有一定程度的增殖。而新鲜样与戊二醛交联组细胞数量很少且随培养时间的延长细胞数目变化不大。这是因为GA交联样的细胞毒性较大，且会持续释放出高细胞毒性的自由醛基，严重抑制了细胞增殖与生长。新鲜样有较强的抗原性，也会严重影响HUVECs细胞的正常增殖。对于经DCMC交联的组织样块，其细胞相容性有较明显的改善；而经进一步掺锶修饰后，所测得的材料的OD值明显增大，这说明随SCPP降解而持续释放出的Sr²⁺不仅会彻底消除其细胞毒性，还会明显地促进内皮细胞的增殖与粘附，进一步改善其细胞相容性。

(4)不同种类血管支架材料表面内皮细胞的生长形态扫描电镜观察实验实施例

材料与细胞接触后，细胞首先在材料表面完成粘附和铺展行为，继而经过一段时间的滞留期后才开始增殖，因此细胞在材料表面的粘附情况是细胞在材料表面发挥功能的前提。本例通过扫描电镜观察细胞在材料表面的形貌与铺展黏附情况。

将内皮细胞与不同种类血管支架材料进行共同培养，四天后做扫描电镜观察。附图4是内皮细胞在不同种类血管支架上复合培养4d的形态学扫描电镜照片(放大1000倍)。图4-a的支架材料为新鲜样，图4-b的支架材料为DCMC交联样，图4-c的支架材料为DCMC/SCPP联合修饰样，图4-d的支架材料为GA交联样。如图所示：在新鲜样和GA交联样表面细胞数量很少且都为圆球形。这主要是因为新鲜样没有经过交联剂处理，带有较大抗原性；GA细胞毒性极高，严重影响在细胞在其表面的生长与铺展。在DCMC交联样表面有一定数量的细胞生长，但细胞形态不规则：在细胞的四周虽然有一些突触但细胞没有多边形铺展。这说明DCMC交联样虽然不影响细胞的增殖，但是在一定时间段内会影响内皮细胞在其表面的粘附、铺展效果。而DCMC/SCPP联合修饰样表面的内皮细胞生长状态良好且完全铺展开，从细胞四周伸出的伪足清晰可见，并与周围细胞紧密联系；细胞与材料紧密地贴附在一起且有融合为一层内皮细胞层的趋势。这说明在掺锶修饰试样表面细胞的粘附和增殖都受到明显的促进作用，细胞形态良好，细胞活性较高。

(5)不同种类血管支架材料表面内皮细胞的活死细胞荧光染色实验实施例

活死细胞荧光染色可以观察到在血管支架材料表面细胞的数量和分布状况，且可以在一定程度上反应出细胞的形态。其中，FDA染色活细胞成绿色，PI染色死细胞成红色。如附图5，新鲜样和经GA交联的组织样块表面活细胞极少，且皆为圆球形；而单纯的DCMC交联样表面虽然细胞数量较多，但细胞活性不好，多为球形或椭球形。DCMC交联样虽然不影响细胞的增殖，但是在一定时间段内会影响内皮细胞在其表面的粘附、铺展效果。而DCMC/SCPP联合修饰样表面的细胞生长状况最好，数目多，排列密集且几乎都为多边形细胞，细胞活性较高，死细胞数量很少。这说明随SCPP降解而持续释放出的Sr²⁺可以有效消除材料的细胞毒性，提高表面细胞的生长活性，有优异的促内皮化效果。

综上实施例，以无机掺锶聚磷酸钙(SCPP)微米级颗粒修饰氧化羧甲基纤维素钠(DCMC)交联固定猪主动脉血管得到的有机/无机复合软组织工程支架不仅能较长时间保存良好的力学性能，有效提高其抗酶降解性，同时消除了材料的抗原性；且它有优异的“促内皮化效果”，有效抑制钙化，防止血栓的形成。是一种种既有良好的生物相容性，与周围组织匹配的力学性能以及一定的抗酶降解性能，又有较好的“促内皮化能力”的具有巨大临床应用前景的新型血管支架替代材料。