本发明涉及包合物制备领域，尤其涉及一种石榴鞣花酸包合物的制备方法及产品。
背景技术：
多酚类化合物是指一组植物中化学元素的统称，因具有多个酚基团而得名，其依据多酚类型，可分为两类：
一类是多酚单体，即非聚合物，包括各种黄酮类化合物(黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷醇、黄烷酮醇、花色素苷、查尔酮等)、绿原酸类、没食子酸和鞣花酸，也包括一些接有糖苷基复合类多酚化合物(如芸香苷等)；日常生活常见大豆异黄酮、洋葱提取物、绿茶提取物、蓝莓提取物等均属这一类。
另一类则是由单体聚合而成的低聚或多聚体，统称单宁类物质，包括缩合型单宁中原花色素和水解型单宁中没食子单宁和鞣花单宁等；日常生活常见乌龙茶提取物、葡萄籽提取物、生苹果提取物、儿茶树提取物等均属这一类。
石榴鞣花酸，为石榴中一种天然存在的多酚类化合物，有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、皮肤增白等多种药理作用。然而，石榴鞣花酸在水中几乎不溶，对光不稳定，体内吸收低，影响了石榴鞣花酸的临床应用。
包合技术是利用包合材料主分子较大空穴将客分子难溶性药物包嵌形成分子胶囊包合物的技术，可提高难溶性药物溶解度和稳定性。其中，羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)是常用的包合材料之一，本身无毒，有较好的水溶性和热稳定性，与难溶性药物形成包合物后，一方面可增加药物的溶解度，另一方面还能够提高药物的生物利用度和稳定性。
目前，已有大量关于多酚类化合物采用包合技术提高药物溶解度和生物稳定性的文献报道，例如：
(1)李守君等对原花青素羟丙基-β-环糊精包合物的制备工艺进行研究，确定了最佳制备工艺投料质量比(原花青素和羟丙基-β-环糊精的质量比1:4)、羟丙基-β-环糊精质量分数30％、包合温度20℃、包合时间2.5h，得到采用溶液搅拌法对原花青素进行包合是可行的，且包合率为24.5％的结论(李守君、刘丽、方丹等.原花青素羟丙基-β-环糊精包合物制备工艺的研究.黑龙江医药科学.2016年04期)。
(2)陈帅等以包合率和得率的总评归一值为考察指标，采用差示扫描量热法对包合物的形成进行验证，发现β-环糊精与白藜芦醇投料比(摩尔比)2∶1、包合温度40℃、包合时间63min时，差示扫描量热法分析结果显示白藜芦醇β-环糊精包合物已形成。包合率为44.58％(陈帅、王慧竹、钟方丽等.响应面法优化白藜芦醇β环糊精包合物的制备工艺.食品工业科技.2015年09期)。
(3)欧阳玉祝等以β-环糊精为壁材,制备了茶多酚-β-环糊精包络物，用红外光谱和紫外光谱对包络产物进行了表征。考查了包络物对超声波辐射、氧化剂和Pb2+作用的稳定性。实验结果表明，分别用80℃超声辐射和常温0.08mol/L Pb2+氧化360min，茶多酚的ΔA/A0值比包络物大48.54％和45.28％；在常温和80℃温度下，用0.1mol/L KClO3溶液氧化360min，茶多酚的ΔA/A0比包络物分别大33.6％和73.41％(欧阳玉祝，石爱华，陈小东等.茶多酚-β-环糊精包络物抗氧化性研究.食品与发酵工业.2007年08期)。
(4)马水仙等对橙皮素/环糊精配位包合物进行了制备，其中橙皮素与环糊精及其衍生物按摩尔比为3:1的比例准确称取，先把橙皮素化合物(0.03mM,9.1mg)溶解于乙醇/水的混合溶液中，乙醇与水的体积比为1:4，在室温下搅拌半小时，加入称好的环糊精及其衍生物(0.01mM：β-CD-11.35mg；DMβ-CD-13.3mg；TMβ-CD-14.3mg；HPβ-CD-14.6mg)，室温下继续搅拌7天。7天后把没有反应的底物过滤，然后把滤液通过旋转蒸发仪蒸干得到含有部分溶剂的包合物，通过在50℃真空干燥箱中干燥12小时，得到橙皮素/环糊精配位包合物。Hesperetin/β-CD、Hesperetin/DMβ-CD、Hesperetin/TMβ-CD、Hesperetin/HPβ-CD产率分别为86％、88％、92％和89％(马水仙.三种天然黄酮与环糊精的包合行为及性质研究.云南民族大学硕士论文.2012年05月)。
(5)Vipin D.Bulani等通过冷冻干燥法获得鞣花酸羟丙基-β-环糊精包合物(EA-HP-β-CD)，并对其包合物采用红外光谱法(FTIR)，XRD(X射线衍射法)，扫描电镜(SEM)、核磁共振(NMR)及分子模型方法进行验证。研究发现鞣花酸与羟丙基-β-环糊精分子比为1:2时，与单纯鞣花酸相比，其包合物在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中体外溶解率可增加5倍，即从55％上升到60％。(Vipin D.Bulani,Pankaj S.Kothavade,Dnyaneshwar M.Nagmoti,et al.Characterisation and anti-inflammatory evaluation of the inclusion complex of ellagic acid with hydroxylpropyl-b-cyclodextrin.J Incl Phenom Macrocycl Chem.2015年03期)。
从上述文献中可以看出，虽然，目前已有大量已公开的多酚类化合物包合物的研究，但是针对鞣花酸包合物的研究还较少，而且上述研究普遍存在包合率低、溶解度有待提高等问题。因此，有必要进一步探究包合技术来提高鞣花酸包合物的包合率、收率、溶解度和稳定性。
技术实现要素：
本发明提供了一种鞣花酸包合物的制备方法及产品，该方法制备获得的鞣花酸包合物产品包合率、收率、溶解度和稳定性均显著提高。
一种石榴鞣花酸包合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)向羟丙基-β-环糊精水溶液中逐滴加入石榴鞣花酸乙醇溶液，进行超声处理，获得反应液；
(2)将所述反应液震荡搅拌，进行包合，获得包合母液；
(3)将所述包合母液进行浓缩、冷冻干燥后，得到所述石榴鞣花酸包合物。
本包合物的主分子是羟丙基-β-环糊精，客分子是石榴鞣花酸，利用主分子间的空穴包嵌作用，及主客分子间范德华力等作用力形成包合分子。
羟丙基-β-环糊精与石榴鞣花酸的用量比对包合物的形成量及其稳定性产生影响。作为优选，步骤(1)中，所述羟丙基-β-环糊精与石榴鞣花酸的摩尔比为3～1:1；更优选，羟丙基-β-环糊精与石榴鞣花酸的摩尔比为2:1。
作为优选，所述石榴鞣花酸乙醇溶液中，石榴鞣花酸与乙醇溶液的用量比为0.302g:100～150ml。若石榴鞣花酸含量偏高，则石榴鞣花酸不溶物过多；反之，则造成石榴鞣花酸浓度不够。
作为优选，步骤(1)中，所述超声的温度为10～30℃，频率为100～500kHz，时间为10～30min。若温度太高、频率太大、时间过长，则会对石榴鞣花酸稳定性产生较大影响；反之，石榴鞣花酸溶解太少。
作为优选，步骤(2)中，所述震荡搅拌的频率为80～150rpm。若频率过大或过小，不利于混合均匀，会影响包合的形成。
作为优选，步骤(2)中，所述震荡搅拌的温度为20～40℃，时间为12～24h。若温度过高、时间过长，则会破坏石榴鞣花酸的结构；反之，不利于包合的形成。
作为优选，步骤(3)中，所述包合母液浓缩至质量浓度为75～85％。若浓缩浓度过高，则易造成母液药物粘壁；反之，水分太多。
作为优选，步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度为-60～-20℃，时间为48～72h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以羟丙基-β-环糊精为包合剂，采用超声处理、震荡搅拌和冷冻干燥结合的方式对石榴鞣花酸进行包合，并配合合理的工艺条件，获得的石榴鞣花酸包合物不仅包合率高而且收率、溶解性和稳定性均非常高。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明做进一步地描述；其中，下列实施例涉及以下内容：
(1)材料与试剂：鞣花酸标准品购自天津尖峰生物技术发展有限公司，HP-β-CD购自上海伯奥生物科技有限公司。
(2)采用的色谱条件为：色谱柱：Hypersil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈：0.3％TFA(20:80)；柱温30℃；流速1.0mL/min；进样量10μL；检测波长254nm。在上述色谱条件下，鞣花酸特征峰的峰型良好。
(3)EA对照品溶液的制备方法为：精密称定鞣花酸对照品10.48mg，置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.1048mg/ml的对照品储备液。
(4)EA-HP-β-CD供试品溶液的制备方法为：取EA-HP-β-CD适量，置于10ml的量瓶中，加入甲醇，超声30min，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
(5)标准曲线的绘制方法为：精密吸取鞣花酸对照品溶液适量，稀释后，得浓度为0.1048、0.524、1.048、2.096、5.240、10.48、20.96μg/ml的系列标准溶液，照上文所述的色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为横坐标(X)，系列标准溶液浓度为纵坐标(Y)，绘制鞣花酸的标准曲线，鞣花酸的回归方程为：Y＝0.6285X+0.0468，r＝0.9999(n＝7)，线性范围为0.1048～20.96μg/ml。
(6)加样回收率试验的方法为：取已知质量浓度(1.048μg/ml)的EA-HP-β-CD供试品溶液10ml，共9份，按照低、中、高三个浓度分别加入适量鞣花酸对照品溶液，按上述方法制备鞣花酸对照品溶液；并进样分析，计算鞣花酸的平均回收率为99.55％，RSD 1.44％。
(7)包合率的计算：将制备获得的石榴鞣花酸包合物置于10mL量瓶中，加甲醇适量，超声30min，再用甲醇稀释至刻度，摇匀。按上文所述的色谱条件进行分析，根据外标法计算EA的含量，代入下式计算包合率。
包合率/％＝包合物中药物量/投入药物量×100；
包合物收率(％)＝包合物的质量/(羟丙基-β-环糊精质量+药物投料质量)×100。
(8)包合物溶解度的测定方法为：取过量PA和PA包合物，分别置于10ml具塞刻度试管中，加水适量，于室温下充分振摇，使之溶解达平衡，然后离心，取上清液以0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液，以水稀释适当倍数后，于254nm处测定吸收值，根据标准曲线方程计算PA和PA包合物的溶解度。
(9)稳定性的测定：大多数多酚类物质具有紫外吸收特征光谱，其中，石榴鞣花酸在254nm有显著的吸收峰，当石榴鞣花酸的结构发生改变时，其相应的特征紫外吸收带也一定发生改变，因此可以通过峰形和峰位的变化可以来推测其结构的变化。
通过温度、pH值及金属离子对石榴鞣花酸与石榴鞣花酸包合物稳定性进行比较，具体方法如下：
(a)取0.302g石榴鞣花酸包合物，溶解在100mL的水中，配置成浓度为0.01mol/L的溶液。
(b)取样，加热至80℃，时间分别在0、5、10、20、30、35、40、60、100、250、400、600min后取样800μL定容于10mL进行紫外测定，扫描范围为200～800nm，比较其谱图变化。
(c)取样若干份，然后调节不同的pH值(1-14)，72h后取样2mL定容于10mL的容量瓶中，进行紫外光谱扫描，扫描范围为200～800nm，。
(d)取样，加入0.1mol/L金属离子溶液(如Fe3+)，混合均匀6h后对其进行紫外可见光谱扫描，波长扫描范围200～800nm。
下列实施例中提及的“EA”代表鞣花酸，“PA”代表石榴鞣花酸。
实施例1
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
(1)取2.862g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；取0.302g石榴鞣花酸溶解至100ml的乙醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤得到石榴鞣花酸乙醇溶液；对20ml的羟丙基-β-环糊精水溶液进行超声处理，并在超声的同时，向羟丙基-β-环糊精水溶液中逐滴缓慢加入80ml的石榴鞣花酸乙醇溶液，25℃、300kHz频率下超声30min后，得到反应液；
(2)将步骤(1)中获得的反应液在30℃、100rpm频率下震荡搅拌18h，进行石榴鞣花酸与羟丙基-β-环糊精的包合，得到包合母液；
(3)将所述包合母液浓缩至10ml(其中，石榴鞣花酸包合物的浓度为80％左右)，再在-40℃下冷冻干燥48h，得到所述石榴鞣花酸包合物。
实施例2
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
(1)取2.862g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；取0.302g石榴鞣花酸溶解至100ml的乙醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤得到石榴鞣花酸乙醇溶液；对20ml的羟丙基-β-环糊精水溶液进行超声处理，并在超声的同时，向羟丙基-β-环糊精水溶液中逐滴缓慢加入80ml的石榴鞣花酸乙醇溶液，25℃、200kHz频率下超声30min后，得到反应液；
(2)将步骤(1)中获得的反应液在30℃、120rpm频率下震荡搅拌18h，进行石榴鞣花酸与羟丙基-β-环糊精的包合，得到包合母液；
(3)将所述包合母液浓缩至10ml(其中，石榴鞣花酸包合物的浓度为75％左右)，再在-40℃下冷冻干燥48h，得到所述石榴鞣花酸包合物。
实施例3
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
(1)取2.862g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；取0.302g石榴鞣花酸溶解至100ml的乙醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤得到石榴鞣花酸乙醇溶液；对20ml的羟丙基-β-环糊精水溶液进行超声处理，并在超声的同时，向羟丙基-β-环糊精水溶液中逐滴缓慢加入80ml的石榴鞣花酸乙醇溶液，25℃、250kHz频率下超声30min后，得到反应液；
(2)将步骤(1)中获得的反应液在30℃、130rpm频率下震荡搅拌18h，进行石榴鞣花酸与羟丙基-β-环糊精的包合，得到包合母液；
(3)将所述包合母液浓缩至10ml(其中，石榴鞣花酸包合物的浓度为85％左右)，再在-20℃下冷冻干燥48h，得到所述石榴鞣花酸包合物。
实施例4
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
(1)取2.862g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；取0.302g石榴鞣花酸溶解至100ml的乙醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤得到石榴鞣花酸乙醇溶液；对20ml的羟丙基-β-环糊精水溶液进行超声处理，并在超声的同时，向羟丙基-β-环糊精水溶液中逐滴缓慢加入80ml的石榴鞣花酸乙醇溶液，25℃、150kHz频率下超声30min后，得到反应液；
(2)将步骤(1)中获得的反应液在30℃、140rpm频率下震荡搅拌18h，进行石榴鞣花酸与羟丙基-β-环糊精的包合，得到包合母液；
(3)将所述包合母液浓缩至10ml(其中，石榴鞣花酸包合物的浓度为75％左右)，再在-40℃下冷冻干燥48h，得到所述石榴鞣花酸包合物。
对比例1搅拌法
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
取0.302g石榴鞣花酸溶解至100ml的乙醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤得到石榴鞣花酸乙醇溶液；取2.862g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；搅拌下，向石榴鞣花酸乙醇溶液缓慢滴入羟丙基-β-环糊精水溶液中，室温下搅拌1h，过夜，抽滤，并用少量无水乙醇洗涤包合物沉淀，真空干燥，得到石榴鞣花酸包合物。
对比例2研磨法
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
取0.302g石榴鞣花酸溶解至100ml的乙醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤得到石榴鞣花酸乙醇溶液；取2.862g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；将羟丙基-β-环糊精水溶液研成糊状，再将石榴鞣花酸加入至所述糊状物中，充分研磨1h，减压抽滤，滤饼在50℃烤箱干燥至恒重，得到石榴鞣花酸包合物。
对比例3震荡搅拌+冷冻干燥
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
取2.75g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；取0.302g鞣花酸加入到羟丙基-β-环糊精水溶液中，得到鞣花酸羟丙基-β-环糊精溶液；在室温震荡搅拌24h，微孔滤膜(0.45μm)过滤，滤液在-60℃下冷冻干燥24h，得到石榴鞣花酸包合物。
对比例4超声+搅拌
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
取2.75g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；取0.302g鞣花酸加入到羟丙基-β-环糊精水溶液中，得到鞣花酸羟丙基-β-环糊精溶液；在室温下300kHz频率下超声至30min，室温下搅拌1h，过夜，抽滤，并用少量无水乙醇洗涤包合物沉淀，真空干燥，得到石榴鞣花酸包合物。
对比例5
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
(1)取2.862g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；取0.302g石榴鞣花酸溶解至100ml的乙醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤得到石榴鞣花酸乙醇溶液；对20ml的羟丙基-β-环糊精水溶液进行超声处理，并在超声的同时，向羟丙基-β-环糊精水溶液中逐滴缓慢加入80ml的石榴鞣花酸乙醇溶液，25℃、50kHz频率下超声40min后，得到反应液；
(2)将步骤(1)中获得的反应液在30℃、200rpm频率下震荡搅拌12h，进行石榴鞣花酸与羟丙基-β-环糊精的包合，得到包合母液；
(3)将所述包合母液浓缩至10ml(其中，石榴鞣花酸包合物的浓度为80％左右)，再在-40℃下冷冻干燥48h，得到所述石榴鞣花酸包合物。
对比例6
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
(1)取2.862g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；取0.302g石榴鞣花酸溶解至100ml的乙醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤得到石榴鞣花酸乙醇溶液；对20ml的羟丙基-β-环糊精水溶液进行超声处理，并在超声的同时，向羟丙基-β-环糊精水溶液中逐滴缓慢加入80ml的石榴鞣花酸乙醇溶液，25℃、600kHz频率下超声20min后，得到反应液；
(2)将步骤(1)中获得的反应液在30℃、60rpm频率下震荡搅拌30h，进行石榴鞣花酸与羟丙基-β-环糊精的包合，得到包合母液；
(3)将所述包合母液浓缩至10ml(其中，石榴鞣花酸包合物的浓度为80％左右)，再在-40℃下冷冻干燥48h，得到所述石榴鞣花酸包合物。
对比例7
一种石榴鞣花酸包合物，其制备方法的具体步骤如下：
(1)取2.862g羟丙基-β-环糊精溶于20ml水中，得到羟丙基-β-环糊精水溶液；取0.302g石榴鞣花酸溶解至100ml的乙醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤得到石榴鞣花酸乙醇溶液；对20ml的羟丙基-β-环糊精水溶液进行超声处理，并在超声的同时，向羟丙基-β-环糊精水溶液中逐滴缓慢加入80ml的石榴鞣花酸乙醇溶液，25℃、300kHz频率下超声30min后，得到反应液；
(2)将步骤(1)中获得的反应液在30℃、搅拌18h，进行石榴鞣花酸与羟丙基-β-环糊精的包合，得到包合母液；
(3)将所述包合母液浓缩至10ml(其中，石榴鞣花酸包合物的浓度为80％左右)，再在-40℃下冷冻干燥48h，得到所述石榴鞣花酸包合物。
对上述实施例和对比例获得的石榴鞣花酸包合物进行包合率、收率、溶解度和稳定性的测定，获得的结果如表1所示。
表1不同制备工艺获得的石榴鞣花酸包合物的包合率、收率、溶解度和稳定性
由上述结果可知，采用实施例1～4的制备方法能够获得包合率、得率、溶解度和稳定性均较高的石榴鞣花酸包合物，其中，实施例1的制备方法最佳。
从实施例和对比例的对比中可以看出，采用超声处理、震荡搅拌和冷冻干燥结合的方式对石榴鞣花酸进行包合处理，能够获得最佳的结果；而单独采用其中一种或两种处理方法均无法获得最佳结果，并且单独一种或两种处理方法获得的结果无规律可循，无法预期。