本发明涉及生物
技术领域：
，具体的说是涉及一种牙齿标本消毒方法。
背景技术：
：牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。成功从离体的牙齿中提取出足够量符合标准的牙髓干细胞，首先遇到的问题就是离体牙齿消毒的问题。口腔环境较其他组织环境不同，口腔内的细菌数量很多，种类相当繁杂，离体牙齿消毒方式不当极易发生染菌，且牙齿内细胞量较少，离体牙齿消毒方式不当也极易发生牙髓干细晌提取失败的情况。文献《人乳牙牙髓干细胞的体外培养观察》(陆家瑜等，口腔颌面外科杂志，2007年3月第17卷第1期)中公开了从人乳牙中分离牙髓干细胞的研究内容，其中涉及到消毒措施：收集7-8岁儿童因滞留而拔出的乳切牙，拔出前彻底消毒，拔出后立即放入预冷的含高倍双抗的DMEM不完全培养基中，从预冷的培养液中取出牙齿,乙醇消毒牙面,用含双抗的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS)反复冲洗。但是由于研究的重点是牙髓干细胞体外培养，故该文献并未记载此消毒措施的效果。中国专利CN104705289A公开了一种离体牙齿保存液，每升保存液中有以下组分：青霉素0.3-0.6g、链霉素0.5-1g、甲硝唑0.02-0.04g、两性霉素B0.015-0.025g、羟甲基纤维素5-10g、胰岛素50-100μg，余量为MEM。该保存液能够有效保持牙髓干细胞的活性，并在一定程度上降低细菌污染。虽然上述两个专利公开的技术内容在对牙齿标本消毒上可能有一定的帮助，但是经过实际的试验研究发现，其消毒效果以及消毒后牙髓干细胞活性并不理想。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种牙齿标本消毒方法，使得所述消毒方法能够避免牙齿染菌情况，并保证提取的牙髓干细胞活性较高，不受明显影响。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种牙齿标本消毒方法，包括：步骤1、将拔出的牙齿标本放入预冷的保存液中；步骤2、从保存液中取出牙齿标本消毒；步骤3、剔除牙齿表面的牙周膜组织，重复步骤2的消毒措施；步骤4、将牙齿标本放置在保存液中清洗；其中，所述保存液包括：氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、青霉素、链霉素和两性霉素B。针对现有的消毒方法在消毒效果以及消毒后牙髓干细胞活性上不佳的问题，本发明在消毒的过程中加入了牙齿标本保存液进行消毒，同时在剔除牙周膜组织后再次进行一次消毒，最终在两个方面都取得了较好地效果。其中，所述保存液在具体实施过程中各组分浓度为：氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、磷酸二氢钾0.24g/L、青霉素50U-500U/mL、链霉素50μg-500μg/mL和两性霉素B0.5μg-5μg/mL，pH值7.2。进一步优选地，所述青霉素浓度为100U/mL，所述链霉素浓度为100μg/mL，所述两性霉素B浓度为1μg/mL。同时，本发明还提供了所述保存液的制备方法，配制氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、磷酸二氢钾0.24g/L的混合溶液，调pH值为7.2，灭菌后加入青霉素、链霉素以及两性霉素B，使其终浓度分别为500U-50U/mL、500μg-50μg/mL、5μg-0.5μg/mL。在实际配制过程中，可以定容到1L来进行配制。作为优选，步骤2具体为从保存液中取出牙齿标本消毒进行碘伏消毒或乙醇消毒。更具体地，步骤2为：用无菌镊子取出牙齿标本放入75％乙醇中，如果牙齿完整，无缺损，将牙齿完全浸没于消毒液中3-5min；如果牙齿缺损且暴露牙髓组织，将牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用无菌纱布浸润75％乙醇擦拭牙髓暴露处30-60秒。作为优选，所述预冷为预先在2-8℃下冷藏。作为优选，步骤1中将拔出的牙齿标本放入预冷的保存液中10min-48h。本发明将CN104705289A中公开的保存液替换本发明保存液进行消毒作为对照，同时以文献《人乳牙牙髓干细胞的体外培养观察》作为另一个对照，进行牙齿消毒效果和牙髓干细胞活性的检测。结果显示，本发明所述消毒方法能够避免牙齿标本染菌情况的出现，同时消毒后牙齿提取的牙髓干细胞的活性也较高，而两个对照组均出现了牙齿染菌情况，并且牙髓干细胞的活性也高低不一。由以上技术效果可知，本发明在消毒的过程中加入了牙齿标本保存液进行消毒，同时在剔除牙周膜组织后再次进行一次消毒，消毒后的牙齿标本能够避免染菌情况的出现，同时所提取的牙髓干细胞仍然保持较高的活性，未受到明显影响。具体实施方式本发明实施例公开了一种牙齿标本消毒方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种牙齿标本消毒方法进行详细说明。实施例1：本发明所述消毒方法1、配制本发明所述保存液8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)、1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，调pH7.2，定容1L；然后高压蒸汽灭菌，取10mL溶液加入青霉素，使其终浓度为100U/mL，加入链霉素使其终浓度为100μg/mL,加入两性霉素B，使其终浓度为1μg/ml，放置4℃备用。2、本发明消毒方法在牙齿标本采集后，放入经过消毒的装有预冷保存液的容器中10min-48h(根据运送标本时间而具体调整)。然后用无菌镊子取出牙齿标本放入75％乙醇中，如果牙齿完整，无缺损，将牙齿完全浸没于消毒液中3-5min；如果牙齿缺损且暴露牙髓组织，将牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用无菌纱布浸润75％乙醇擦拭牙髓暴露处30-60秒。取出牙齿，置于无菌平皿中，在用无菌锋利刀片去除牙齿表面的牙周膜组织，将牙齿表面剔除干净后，再放置含有75％的乙醇中浸泡3-5min。如果牙齿完整，无缺损，将牙齿完全浸没于消毒液中3-5min；如果牙齿缺损且暴露牙髓组织，将牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用无菌纱布浸润75％乙醇擦拭牙髓暴露处30-60秒。经过乙醇消毒后，将牙齿放置在保存液中清洗牙齿，去除乙醇。实施例2：本发明所述消毒方法1、配制本发明所述保存液8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)、1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，调pH7.2，定容1L；然后高压蒸汽灭菌，取10mL溶液加入青霉素，使其终浓度为50U/mL，加入链霉素使其终浓度为500μg/mL,加入两性霉素B，使其终浓度为0.5μg/ml，放置4℃备用。2、本发明消毒方法在牙齿标本采集后，放入经过消毒的装有预冷保存液的容器中10min-48h(根据运送标本时间而具体调整)。然后用无菌镊子取出牙齿标本放入碘伏消毒液中，如果牙齿完整，无缺损，将牙齿完全浸没于消毒液中3-5min；如果牙齿缺损且暴露牙髓组织，将牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用无菌纱布浸润75％乙醇擦拭牙髓暴露处30-60秒。取出牙齿，置于无菌平皿中，在用无菌锋利刀片去除牙齿表面的牙周膜组织，将牙齿表面剔除干净后，再放置含有碘伏消毒液中浸泡3-5min。如果牙齿完整，无缺损，将牙齿完全浸没于消毒液中3-5min；如果牙齿缺损且暴露牙髓组织，将牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用无菌纱布浸润75％乙醇擦拭牙髓暴露处30-60秒。经过碘伏消毒液消毒后，将牙齿放置在保存液中清洗牙齿，去除碘伏消毒液。实施例3：本发明所述消毒方法1、配制本发明所述保存液8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)、1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，调pH7.2，定容1L；然后高压蒸汽灭菌，取10mL溶液加入青霉素，使其终浓度为500U/mL，加入链霉素使其终浓度为50μg/mL,加入两性霉素B，使其终浓度为5μg/ml，放置4℃备用。2、本发明消毒方法在牙齿标本采集后，放入经过消毒的装有预冷保存液的容器中10min-48h(根据运送标本时间而具体调整)。然后用无菌镊子取出牙齿标本放碘伏消毒液中，如果牙齿完整，无缺损，将牙齿完全浸没于消毒液中3-5min；如果牙齿缺损且暴露牙髓组织，将牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用无菌纱布浸润75％乙醇擦拭牙髓暴露处30-60秒。取出牙齿，置于无菌平皿中，在用无菌锋利刀片去除牙齿表面的牙周膜组织，将牙齿表面剔除干净后，再放置含有75％的乙醇中浸泡3-5min。如果牙齿完整，无缺损，将牙齿完全浸没于消毒液中3-5min；如果牙齿缺损且暴露牙髓组织，将牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用无菌纱布浸润75％乙醇擦拭牙髓暴露处30-60秒。经过乙醇消毒后，将牙齿放置在保存液中清洗牙齿，去除乙醇。实施例4：消毒方法的对比1、对照对照方法1：文献《人乳牙牙髓干细胞的体外培养观察》中涉及到消毒措施：收集7-8岁儿童因滞留而拔出的乳切牙，拔出前彻底消毒，拔出后立即放入预冷的含高倍双抗的DMEM不完全培养基中，从预冷的培养液中取出牙齿,乙醇消毒牙面,用含双抗的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS)反复冲洗。对照方法2：用专利CN104705289A实施例1保存液替换本发明保存液，其余按照实施例1中的消毒方法进行。2、牙髓干细胞提取方法及活性检测将消毒后的牙齿用PBS清洗2次。再用钳子钳开牙齿，组织镊取出牙髓。放置在0.3％I型胶原酶+0.4％分散酶消化30-60min后，以1200rpm离心10min中，用PBS清洗一次后，过100μm细胞筛，再次以1200rpm离心5min。用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素、1μg/ml两性霉素B的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种到25ml培养瓶中，在37℃，5％CO2培养，每2天换液一次，当细胞待细胞达到汇合点(即细胞长满瓶底的70％-80％)时，用2.5g/L胰蛋白酶消化进行传代，按1:3传代，第5代细胞进行细胞活力检测。4、牙齿染菌试验将20颗离体健康牙齿按照各方法消毒后，放置装有LB培养液(10mg/mL胰蛋白胨(tryptone),5mg/mL酵母提取物(yeastextract),10mg/mL氯化钠(NaCl))的试管中，37℃200rpm摇晃过夜，用接种环接种50μL少量液体接种徒步LB平皿，放置37摄氏度培养箱5天，观察是否有细菌菌落形成。5、试验结果见表1。表1牙齿染菌试验结果及牙髓干细胞活性形成细菌菌落的牙齿数量无细菌菌落的牙齿数量牙髓干细胞活性实施例102090％实施例202085％实施例302087％对照161489％对照251583％由上表可知，本发明消毒方法可以完全避免牙齿染菌现象的出现，而对照的两个方法均出现染菌情况，且本发明得到的牙髓干细胞活力均大于85％。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页1 2 3