本发明涉及医药化学领域，具体涉及龙血素C在制备防治阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆、抑郁症等中枢神经系统疾病药物中的应用。
背景技术：
：随着世界人口的老龄化与经济的发展，老年人的生活质量受到越来越多的重视。老年痴呆症是一种严重影响老年人生活质量的疾病，主要的类型有阿尔茨海默病(A1zheimer’sdisease,AD)及血管性痴呆(Vasculardementia,VD)，其中AD约为老年痴呆总人数的50％-60％，VD占10％-20％。目前老年痴呆症治疗药物的数量非常有限。帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是常见的中枢神经退行性疾病，主要临床表现包括静止性振颤、僵硬、动作迟缓、姿势反射异常等，严重者丧失生活自理能力。目前治疗帕金森病的药物在短期内可改善症状，但均不能逆转神经病理改变，而长期用药带来的异动症等副作用显著。现代社会中，工作和生活节奏逐步加快，人们所承受的压力与挑战(应激因素)也逐渐增加。严重或持久的应激，特别是慢性应激，严重影响着人类的身心健康，诱发许多躯体或精神疾病(如抑郁症)。抑郁症已经成为现代社会严重的精神卫生问题，据世界卫生组织统计，就疾病负担而言，预计到2020年，抑郁症将上升为仅次于心脏病的第二大疾患。综上，探寻潜在的阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆、抑郁症等中枢神经系统疾病的防治药物具有重要的医学意义和社会意义。龙血素C是从传统中药血竭(Dragon’sBlood)中分离鉴定的单体化合物。血竭是一味历史悠久的名贵中药。其性味甘咸、平，入心、肝经，具有散瘀定痛、活血生肌等功能。现代研究证实，血竭具有抗炎止痛、抗真菌、抗心律失常、增强机体免疫等多种药理作用。龙血素C的英文名为LoureirinC，CAS号为116384-24-8，分子式为C16H16O4，化学名为4,4'-二羟基-2-甲氧基二氢查耳酮(4,4'-dihydroxy-2-methoxydihydrochalcone)，结构如式(Ⅰ)所示：动物模型选择依据：(1)将兴奋性氨基酸——喹啉酸(quinolinicacid；QA)注入动物Meynert基底核会造成局部兴奋性氨基酸大量聚集，持续作用于NMDA受体，引起大量Ca2+内流，导致Ca2+超载，继而产生大量氧化应激产物，引发细胞炎症，线粒体功能紊乱。此外Meynert基底核是胆碱能神经元聚集最丰富的地方，该模型会造成胆碱能神经元变性、死亡，胆碱能神经系统功能障碍，继而引起认知及记忆能力减退，即喹啉酸可以引起类似AD的病理改变和认知障碍。(2)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)静脉或腹腔注射后可通过血脑屏障，在脑内由单胺氧化酶(MAO-B)代谢为毒性产物MPP+，再经多巴胺转运体选择性摄入黑质多巴胺能神经元，引起震颤、运动迟缓、肢体僵直、姿势反射异常等表现，补充左旋多巴能改善以上症状，MPTP可造成经典的PD模型。(3)脑梗塞所引起的缺血-再灌注是诱发血管性痴呆的主要原因之一。小鼠反复脑缺血再灌模型是通过夹闭颈总动脉造成脑供血供氧不足，引发急性脑损伤，通过再灌注时的钙超载和呼吸爆发(氧自由基过剩)等机制造成迟发性脑损伤。该模型脑损伤指标明显，记忆障碍显著，是一种经典的VD模型。(4)慢性不可预见轻度应激性抑郁模型(chronicunpredictablemildstress，CMS)与其他动物模型相比更能模拟人类日常生活中所遭遇的各种刺激，与临床抑郁症具有更强的病因学关联性。临床研究表明，长期暴露于不可控、不可预见的生活事件的人更容易罹患抑郁障碍。此外，在抗抑郁药物研发方面，因为抗抑郁药物的疗效需要用药一定时间后方可作出评价，这就需要用于此类研究的动物模型具有与临床相似的时间特性，即动物的抑郁行为必须能持续数周以上时间，这也是本抑郁模型的独特优势。综上，采用以上动物模型考察龙血素C防治阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆及抑郁症等中枢神经系统疾病作用有充分理论依据。迄今为止，未见有龙血素C防治阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆及抑郁症的记载和报道。技术实现要素：本发明是提供龙血素C的新用途，即用于防治阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆、抑郁症等中枢神经系统疾病。本发明分别通过阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆、抑郁症动物模型(大鼠Meynert基底核注射喹啉酸模型，小鼠腹腔注射MPTP模型，小鼠双侧颈总动脉反复缺血再灌注模型，小鼠慢性不可预知温和应激性抑郁模型)，观察龙血素C对上述中枢神经系统疾病的防治作用。研究结果表明，龙血素C对上述疾病的动物模型均显示出防治作用。本发明以Wistar大鼠和ICR小鼠为实验动物，造模方法和给药方案如下：(1)拟AD模型：Wistar大鼠两侧Meynert基底核(位置：前囟后1.4mm、矢状线旁±2.4mm、颅骨下6.8mm)均注入2μL(含喹啉酸120nmol)喹啉酸溶液，假手术组注入等体积PBS溶液。造模当日开始灌胃给药，龙血素C设置3个剂量0.112mg/kg、0.224mg/kg和0.448mg/kg。给药第8天开始依次进行Y迷宫、新物体辨别和Morris水迷宫实验，之后，采集大脑皮层组织，检测代表突触结构与功能的突触相关蛋白，生长相关蛋白-43(GAP43)、突触后致密物质-95(PSD95)和突触素(SYP)的表达水平。(2)拟PD模型：ICR小鼠按照20mg/kg体重的剂量腹腔注射MPTP，每间隔3小时注射一次，共注射4次，一天内完成。造模后开始灌胃给药，龙血素C设置3个剂量0.15mg/kg、0.3mg/kg和0.6mg/kg。给药第14天开始依次进行转棒实验、爬竿实验、平衡木实验和旷场实验。(3)血管性痴呆模型：分离ICR小鼠双侧颈总动脉，用动脉夹夹闭20min，放开10min，再夹闭20min，距尾尖1cm处放8-10滴血。造模后开始灌胃给药，龙血素C设置3个剂量0.15mg/kg、0.3mg/kg和0.6mg/kg。给药第8天开始依次进行Y迷宫、Morris水迷宫和被动回避实验，采集海马组织。检测突触相关蛋白GAP43、PSD95和SYP的表达水平。(4)抑郁模型：对照组ICR小鼠群养于标准实验室条件下，自由摄水及摄取饲料。模型组ICR小鼠单笼单只饲养，每日被动接受限水、限食、游泳、禁水、禁食、45度斜笼、湿笼等刺激中的1种，刺激时间不固定，随机安排28天，同种刺激不连续出现，使小鼠不能预料刺激的发生。造模期间开始灌胃给药。给药第29天开始依次进行糖水偏爱实验、强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验。实验结果，龙血素C高剂量显著提高拟AD和VD动物Y迷宫实验自发交替反应率、新物体辨别的优先指数和辨别系数、Morris水迷宫实验的目标象限游泳时间、被动回避实验逃避潜伏期等，Westernblot检测发现龙血素C高剂量组小鼠脑内GAP43、PSD95和SYP蛋白表达显著提高，以上结果提示龙血素C改善了拟AD和VD动物学习记忆障碍，对动物脑内神经细胞具有保护作用。与模型组相比，龙血素C高剂量显著延长拟PD动物转棒实验的潜伏期、缩短爬竿实验的转身时间和下降时间、提高平衡木实验得分、增加水平和垂直运动，以上结果提示龙血素C改善了拟PD动物运动障碍。龙血素C高剂量显著延长动物的糖水偏爱分数，缩短强迫游泳实验不动时间、悬尾实验不动时间，增加水平和垂直运动，以上结果提示龙血素C改善了动物的抑郁症状。综上，龙血素C可以有效改善阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆、抑郁症等中枢神经系统疾病症状。本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为药物使用的适当的施用形式或剂量形式。本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和穴位注射等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物龙血素C与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。例如，将本发明化合物龙血素C制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。此外，如需要也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过滤器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。为了达到用药目的，增加防治效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要防治的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此，在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如疾病的严重程度，患者的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的防治剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量做出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。本发明提供了龙血素C的新应用——在制备防治阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆、抑郁症等中枢神经系统疾病药物中的应用。附图说明图1龙血素C对Meynert基底核注射喹啉酸大鼠Y迷宫实验自发交替反应率的影响图2龙血素C对Meynert基底核注射喹啉酸大鼠新物体辨别实验1h、24h优先指数和辨别系数的影响图3龙血素C对Meynert基底核注射喹啉酸大鼠Morris水迷宫实验目标象限游泳时间的影响图4龙血素C对Meynert基底核注射喹啉酸大鼠大脑皮层突触相关蛋白表达的影响A：龙血素C对SYP蛋白表达的影响B：龙血素C对PSD95蛋白表达的影响C：龙血素C对GAP43蛋白表达的影响图5龙血素C对腹腔注射MPTP小鼠转棒实验潜伏期的影响图6龙血素C对腹腔注射MPTP小鼠爬竿实验转身时间和下降时间的影响图7龙血素C对腹腔注射MPTP小鼠平衡木实验得分的影响图8龙血素C对腹腔注射MPTP小鼠旷场实验水平和垂直运动的影响图9龙血素C对双侧颈总动脉反复缺血再灌注小鼠Y迷宫实验自发交替反应率的影响图10龙血素C对双侧颈总动脉反复缺血再灌注小鼠Morris水迷宫实验目标象限游泳时间、游泳路程的影响图11龙血素C对双侧颈总动脉反复缺血再灌注小鼠被动回避实验逃避潜伏期的影响图12龙血素C对双侧颈总动脉反复缺血再灌注小鼠海马突触相关蛋白表达的影响A：龙血素C对SYP蛋白表达的影响B：龙血素C对PSD95蛋白表达的影响C：龙血素C对GAP43蛋白表达的影响图13龙血素C对抑郁小鼠糖水偏爱分数的影响图14龙血素C对抑郁小鼠强迫游泳实验不动时间的影响图15龙血素C对抑郁小鼠悬尾实验不动时间的影响图16龙血素C对抑郁小鼠旷场实验水平和垂直运动的影响。具体实施方式下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1龙血素C对大鼠Meynert基底核注射喹啉酸致AD模型的影响雄性Wistar大鼠，体重270-290克，随机分为5组，每组12只。5组分别为假手术组、模型组、龙血素C低剂量组(0.112mg/kg)、中剂量(0.224mg/kg)和高剂量组(0.448mg/kg)。大鼠用3.5％的水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，剪去颅顶切口区毛发，酒精消毒，并将头部固定于脑立体定位仪上，根据大鼠脑立体定位图谱确定大鼠Meynert基底核位置(前囟后1.4mm、矢状线旁±2.4mm、颅骨下6.8mm)，标记后用微型牙钻钻开颅骨，将10μL微量进样器移入并注射。除假手术组外，每组大鼠两侧Meynert基底核均注入2μL(含喹啉酸120nmol)喹啉酸溶液(用0.01mol/L，pH7.4PBS缓冲液溶解)，缓慢推注1min，留针6min，假手术组注入等体积PBS溶液。造模当日动物苏醒后开始灌胃给药，假手术组和模型组给予等量的溶剂。给药第8天开始依次进行Y迷宫、新物体辨别和Morris水迷宫实验，行为学实验期间继续给药，每天1次直至行为学结束，处死动物，采集大脑皮层组织。检测突触相关蛋白GAP43、PSD95和SYP表达。①大鼠Y迷宫实验给药第8天，各组大鼠进行Y迷宫实验。大鼠Y迷宫实验旨在考察龙血素C对大鼠自发交替活动和工作记忆的影响。装置由三个夹角为120°的木制支臂组成，分别为A、B、C三臂。实验时将大鼠放入A臂末端，让其自由出入三个臂，记录8min内每只大鼠进入三个臂的总次数及进臂顺序，以连续进入三个不同的臂为一次正确交替反应，记录正确交替反应次数。用自发交替反应率(％)反映空间工作记忆能力。实验结果如图1所示：与假手术组相比，模型组自发交替反应率显著降低；而与模型组相比，龙血素C组自发交替反应率显著增加，提示龙血素C能够显著提高拟AD大鼠的工作记忆能力。实验数据用均值±标准差表示，与对照组相比##p<0.01；与模型组相比***p<0.001，N＝12。②大鼠新物体辨别实验给药第9天，各组大鼠进行新物体辨别实验。大鼠新物体辨别实验旨在考察龙血素C对大鼠形象辨别记忆的影响。实验装置为一黑色塑料圆形开放场，直径约60cm，高20cm。本实验分为适应阶段和测试阶段。适应阶段每次将2～3只大鼠放入开放场中，让其自由探索3min以适应环境，每天2次，进行2天。第3天进行测试，每次将一只大鼠放入开放场中先自由探索3min，后取出大鼠，将2个相同的物体(A1,A2)置于开放场中央，放入大鼠，记录5min内探索两物体的时间(tA1,tA2)。1h后，将A2物体换成新物体B，将大鼠再次放入，记录探索两物体的时间(tA1,tB)。24h后，将物体B换成物体C，将大鼠再次放入，记录探索两物体所用的时间(tA1,tC)。探索的判定标准为大鼠用鼻子指向物体并距离物体1cm以内，或触及鼻子、舔物体、或用前爪触碰物体。计算对新物体的优先指数(Preferentialindex)及辨别系数(Discriminationindex)。优先指数计算公式如下：优先指数(1h)＝tB/(tA1+tB)优先指数(24h)＝tC/(tA1+tC)辨别系数计算公式如下：辨别系数(1h)＝(tB-tA1)/(tA1+tB)辨别系数(24h)＝(tC-tA1)/(tA1+tC)实验结果如图2所示：与假手术组相比，模型组大鼠1h及24h测试阶段的优先指数和辨别系数均显著降低，提示模型组大鼠形象记忆能力减弱。与模型组相比，龙血素C组1h及24h优先指数和辨别系数均显著增加，提示龙血素C能显著改善拟AD大鼠形象辨别记忆障碍。实验数据用均值±标准差表示，与假手术组相比###p<0.001；与模型组相比**p<0.01，***p<0.001，N＝12。③大鼠Morris水迷宫实验给药第13天，各组大鼠进行Morris水迷宫实验。Morris水迷宫实验旨在考察龙血素C对空间学习记忆障碍的影响。水迷宫装置由直径为1.5米、高为50厘米的黑色不锈钢圆形水池和一个直径为10厘米的圆形金属平台组成，平台可自由移动位置。实验前向水池中注水(水温24±1℃)，使水面高于平台1厘米。训练阶段，每天上下午各进行1次训练，历时6天。平台置于第四象限，将大鼠面向池壁放入水中，记录90秒，90秒内如果大鼠找到平台则让其在平台上休息10秒。如果90秒未找到平台，将大鼠引导至平台上休息10秒。给药第19天进行测试，撤除平台，让大鼠自由游泳90秒。迷宫系统自动记录大鼠在原平台象限(目标象限)停留的时间。实验结果如图3所示：与假手术组相比，模型组目标象限游泳时间显著减少，提示模型组大鼠空间记忆能力下降。与模型组相比，龙血素C组目标象限游泳时间显著增加，提示龙血素C能剂量依赖地改善造模大鼠的空间记忆障碍。实验数据用均值±标准差表示，与假手术组相比###p<0.001；与模型组相比*p<0.05，***p<0.001，N＝12。④Westernblot检测突触相关蛋白表达脑组织低温充分匀浆，重悬于蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40分钟，4℃下12000转/分钟，离心30分钟，取上清。采用Bradford法进行蛋白定量。40μg蛋白提取物加入上样缓冲液，沸水浴加热5分钟，充分变性。10％SDS-PAGE电泳分离蛋白→半干法将蛋白转移至PVDF膜→5％脱脂奶粉封闭2小时→一抗孵育，4℃过夜→PBS洗脱→二抗室温孵育2小时→ECL法显影。实验结果如图4所示：与假手术组相比，模型组大鼠大脑皮层GAP43、PSD95和SYP蛋白表达水平显著降低；与模型组相比，龙血素C组显著提高GAP43、PSD95和SYP蛋白表达水平，提示龙血素C具有神经突触保护作用。实验数据用均值±标准差表示，与假手术组相比#p<0.05；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01，N＝5。实施例2龙血素C对小鼠腹腔注射MPTP致PD模型的影响雄性ICR小鼠，体重22-25克，随机分为5组，每组10只。5组分别为对照组、模型组、龙血素C低剂量组(0.15mg/kg)、中剂量组(0.3mg/kg)和高剂量组(0.6mg/kg)。按照20mg/kg体重的剂量腹腔注射MPTP，每间隔3小时注射一次，共注射4次，一天内完成。造模后给药组连续灌胃给药，每天一次，直到处死动物，对照组和模型组给予同体积溶剂。给药第14天进行转棒实验、第15天进行爬竿实验、第16天进行平衡木实验、第17天进行旷场实验。①小鼠转棒实验给药第12天，各组小鼠置于转棒仪进行训练，设定转速5圈/分钟，300秒/次，3次/天；给药第13天，各组小鼠置于转棒仪进行训练，设定转速10圈/分钟，300秒/次，3次/天；给药第14天对各组小鼠进行测试，转棒仪设定转速30圈/分钟，200秒/次，共测试3次。记录测试时小鼠从转棒仪掉落的时间，取均值——即潜伏期。实验结果如图5所示：与对照组相比，模型组潜伏期显著降低；而与模型组相比，龙血素C组潜伏期显著延长，提示龙血素C能够显著改善PD小鼠的运动障碍。实验数据用均值±标准差表示，与对照组相比##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，N＝10。②小鼠爬竿实验给药第15天，在水平桌面上设置一垂直于桌面的粗糙塑料杆，直径10mm、高30cm。将小鼠头部向上置于塑料杆顶端，小鼠将自动转身直至头部向下，并沿塑料杆下降到桌面。记录小鼠转向所需的时间和下降到桌面(以双前足均接触桌面为准)的时间。实验结果如图6所示：与对照组相比，模型组转身时间和下降时间均显著降低；而与模型组相比，龙血素C组转身时间和下降时间显著延长，提示龙血素C能够显著改善PD小鼠的运动障碍。实验数据用均值±标准差表示，与对照组相比##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，N＝10。③小鼠平衡木实验给药第16天，将一100cm长、直径10mm的钢质圆杆两端固定于直径20cm、高30cm的圆形平台上。实验时，将小鼠放于钢杆中央，测试时间为60s，记录小鼠在杆上的平衡时间(即从抓杆到落下的时间)。若小鼠在60s内仍在杆上或逃至两端的平台之一，则记录时间为60s。每只小鼠分别在杆上连续测试3次。评分标准：0分：动物从杆上掉下；1分：60s内动物未从杆上落下，但也未移动；2分：60s内动物未从杆上落下，且在杆上移动，但未达到平台；3分：60s内动物未从杆上落下，且在40-59s内到达平台；4分：60s内动物未从杆上落下，且在20-39s内到达平台；5分：60s内动物未落下，且在20s内到达平台。记录并计算出每只小鼠在杆上3次的积分均值。实验结果如图7所示：与对照组相比，模型组得分显著降低；而与模型组相比，龙血素C组得分显著增加，提示龙血素C能够显著改善PD小鼠的平衡能力。实验数据用均值±标准差表示，与对照组相比#p<0.05；与模型组相比*p<0.05，N＝10。④小鼠旷场实验给药第17天，进行旷场实验，以考察小鼠的探索行为，实验装置为一个长、宽、高均为50cm的无盖木箱，木箱底部被分为25个边长为2cm的正方形。实验时间共20min，将小鼠置于木箱底部一角，适应15min后，观察记录最后5min小鼠的水平运动(四肢跨越的格子数)及垂直运动(小鼠以后肢站立的次数)。实验结果如图8所示：与对照组相比，模型组水平运动和垂直运动均显著降低；而与模型组相比，龙血素C组水平运动和垂直运动显著增加，提示龙血素C能够显著改善PD小鼠的运动障碍。实验数据用均值±标准差表示，与对照组相比##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01，N＝10。实施例3龙血素C对小鼠双侧颈总动脉反复缺血再灌注致血管性痴呆模型的影响雄性ICR小鼠，体重22-25克，随机分为5组，每组10只。5组分别为假手术组、模型组、龙血素C低剂量组(0.15mg/kg)、中剂量组(0.3mg/kg)和高剂量组(0.6mg/kg)。首先腹腔注射阿托品(1mg/kg)，5min后腹腔注射3.5％水合氯醛麻醉，背位固定。分离双侧颈总动脉，用动脉夹夹闭20min，放开10min，再夹闭20min，距尾尖1cm处放8-10滴血。假手术组只分离双侧颈总动脉，不夹闭不放血。造模当日动物苏醒后开始灌胃给药，假手术组和模型组给予等量的溶剂。给药第8天开始依次进行Y迷宫、Morris水迷宫和被动回避实验，行为学实验期间继续给药，每天1次直至行为学结束，处死动物，采集大脑海马组织。检测突触相关蛋白GAP43、PSD95和SYP表达。①小鼠Y迷宫实验给药第8天，各组小鼠进行Y迷宫实验。小鼠Y迷宫实验旨在考察龙血素C对小鼠自发交替活动和工作记忆的影响。装置由三个夹角为120°的木制支臂组成，分别为A、B、C三臂。实验时将小鼠放入A臂末端，让其自由出入三个臂，记录10min内每只小鼠进入三个臂的总次数及进臂顺序，以连续进入三个不同的臂为一次正确交替反应，记录正确交替反应次数。用自发交替反应率(％)反映空间工作记忆能力。实验结果如图9所示：与假手术组相比，模型组自发交替反应率显著降低；而与模型组相比，龙血素C组自发交替反应率显著增加，提示龙血素C能够显著提高血管性痴呆小鼠的工作记忆能力。实验数据用均值±标准差表示，与假手术组相比#p<0.05；与模型组相比*p<0.05，N＝10。②小鼠Morris水迷宫实验给药第9天，各组小鼠进行Morris水迷宫实验。Morris水迷宫实验旨在考察龙血素C对空间学习记忆障碍的影响。水迷宫装置由直径为1.2米、高为50厘米的黑色不锈钢圆形水池和一个直径为10厘米的圆形金属平台组成，平台可自由移动位置。实验前向水池中注水(水温24±1℃)，使水面高于平台1厘米。训练阶段，每天上下午各进行1次训练，历时5天。平台置于第四象限，将小鼠面向池壁放入水中，记录60秒，60秒内如果小鼠找到平台则让其在平台上休息10秒。如果60秒未找到平台，将小鼠引导至平台上休息10秒。给药第16天进行测试，撤除平台，让小鼠自由游泳60秒。迷宫系统自动记录小鼠在原平台象限(目标象限)停留的时间及路程。实验结果如图10所示：与假手术组相比，模型组目标象限游泳时间和路程显著降低；而与模型组相比，龙血素C组目标象限游泳时间和路程显著增加，提示龙血素C能够显著提高血管性痴呆小鼠的空间记忆能力。实验数据用均值±标准差表示，与假手术组相比##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，N＝10。③小鼠被动回避实验给药第15天，各组小鼠进行被动回避实验。被动回避实验旨在考察龙血素C对学习能力的影响。实验装置分明、暗两室。两室大小均为15厘米×10厘米×11厘米，两室之间有一直径为3厘米大小的半圆形门。两室底部均铺以铜栅，暗室底部铜栅可以通电，电压强度由稳压器控制。将小鼠背向门口放入明室，适应环境3分钟，然后通以30V电压。小鼠进入暗室立即遭到电击，然后从门口逃回明室，如此训练5分钟。1小时后测验，记录第一次进入暗室的潜伏期，以此作为记忆成绩。实验结果如图11所示：与假手术组相比，模型组进入暗室的逃避潜伏期显著缩短；而与模型组相比，龙血素C组进入暗室的潜伏期显著增加，提示龙血素C能够显著提高血管性痴呆小鼠的学习记忆能力。实验数据用均值±标准差表示，与假手术组相比##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，N＝10。④Westernblot检测海马突触相关蛋白表达方法同实施例1④。实验结果如图12所示：与假手术组相比，模型组小鼠海马GAP43、PSD95和SYP蛋白表达水平显著降低；与模型组相比，龙血素C组显著提高GAP43、PSD95和SYP蛋白表达水平，提示龙血素C具有神经突触保护作用。实验数据用均值±标准差表示，与假手术组相比#p<0.05，##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，N＝5。实施例4龙血素C对小鼠慢性不可预知温和应激性抑郁模型的影响雄性ICR小鼠，体重25-30克，随机分为5组，每组10只。5组分别为对照组、模型组、龙血素C低剂量组(0.15mg/kg)、中剂量组(0.3mg/kg)和高剂量组(0.6mg/kg)。对照组小鼠群养于标准实验室条件下，自由摄水及饲料。模型组小鼠单笼单只饲养，每日被动接受限水、限食、游泳、禁水、禁食、45度斜笼、湿笼等刺激中的1种，刺激时间不固定，随机安排28天，同种刺激不连续出现，使小鼠不能预料刺激的发生。造模同时，给药组连续灌胃给药，每天一次，直到处死动物，对照组和模型组给予同体积溶剂。给药第29天进行糖水偏爱实验、第30天进行强迫游泳实验，第31天进行悬尾实验，悬尾实验后处死动物，采集大脑皮层。检测突触相关蛋白GAP43、PSD95和SYP表达。①小鼠糖水偏爱实验给药第29天，各组小鼠进行糖水偏爱实验。测试前对小鼠禁水禁食18小时，测试时间选取在小鼠活动正常的夜间进行(7:00pm-12:00pm)，且实验过程保持无光照状态。测试时小鼠单笼单只摆放，同时给予饲料和提前称重、标记的两个同样的饮水瓶，分别装有1％的蔗糖水和清水，使其自由选择摄取。1小时后，同时取下两个饮水瓶，并再次称重记录。依据下列公式计算糖水偏爱分数：糖水偏爱分数＝糖水摄取量/(糖水摄取量+清水摄取量)×100％实验结果如图13所示：与假手术组相比，模型组糖水偏爱分数显著降低；而与模型组相比，龙血素C组糖水偏爱分数显著增加，提示龙血素C能够显著提高抑郁小鼠对奖赏的反应性。实验数据用均值±标准差表示，与对照组相比##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，N＝10。②小鼠强迫游泳实验给药第30天，各组小鼠进行强迫游泳实验。强迫游泳实验通过实验过程中动物的不动行为反映其行为绝望状态，是抑郁模型评价的指标之一。实验选取小鼠活动正常的夜间进行，实验过程中保持光线暗淡。首先向透明的圆柱形(高：40cm，直径：30cm)玻璃容器内注入30cm深的清水，水温保持在25±2℃。测试时将小鼠轻放入水中，首先使其适应游泳1分钟，从第2分钟开始记录后续5分钟内小鼠的漂浮不动时间。实验结果如图14所示：与假手术组相比，模型组不动时间显著延长；而与模型组相比，龙血素C组不动时间显著缩短，提示龙血素C能够显著改善抑郁小鼠的行为绝望状态。实验数据用均值±标准差表示，与对照组相比#p<0.05；与模型组相比*p<0.05，N＝10。③小鼠悬尾实验给药第31天，各组小鼠进行悬尾实验。悬尾实验与强迫游泳实验相似，也是通过实验过程中动物的不动行为反映其行为绝望状态，是抑郁模型评价的指标之一。实验选取小鼠活动正常的夜间进行，实验过程中保持光线暗淡。测试时将小鼠尾端约1cm处固定于支架上，使其处于自然的倒悬状态。首先使小鼠适应1分钟，从第二分钟开始记录后续5分钟内小鼠的不动时间。实验结果如图15所示：与假手术组相比，模型组不动时间显著延长；而与模型组相比，龙血素C组不动时间显著缩短，提示龙血素C能够显著改善抑郁小鼠的行为绝望状态。实验数据用均值±标准误差表示，与对照组相比##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，N＝10。④小鼠旷场实验给药第32天，进行旷场实验，以考察小鼠的抑郁样行为。方法同实施例2④。实验结果如图16所示：与对照组相比，模型组水平运动和垂直运动均显著降低；而与模型组相比，龙血素C组水平运动和垂直运动显著增加，提示龙血素C能够显著改善小鼠的抑郁样行为。实验数据用均值±标准差表示，与对照组相比##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01，N＝10。当前第1页1 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