一种促进皮肤伤口愈合的生物制剂的制作方法

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种促进皮肤伤口愈合的生物制剂。

背景技术：

皮肤是人体面积最大的器官，是机体与外界的机械屏障，具有复杂的组织结构和多重生理功能，创伤或烧伤后皮肤缺损或者糖尿病等慢性疾病所致的顽固性皮肤溃疡是临床常见的病症之一，有效地促进创面的修复是这类患者治疗的核心问题。

创面愈合是一个复杂的病理生理过程，大致分为炎症期、增殖期和重塑期。损伤严重时，组织持续缺氧、坏死、感染等因素使得创面愈合的3个时期被显著延长，愈合困难。近年来，以干细胞特别是以间充质干细胞(脂肪干细胞是间充质干细胞中的一种，相比其它间充质干细胞，脂肪干细胞拥有取材方便，无伦理学限制等优势)为基础的皮肤再生医学研究得到广泛关注，研究表明MSCs可以不同程度地影响创面愈合的各个阶段，从而加速创面愈合。体内研究表明在炎症期，损伤组织和炎症细胞释放的炎症因子和趋化因子可以促进MSCs迁移归巢到创面，MSCs通过分化为创面修复细胞核旁分泌机制发挥抗炎和抗凋亡作用。在增殖期，MSCs也可通过旁分泌机制发挥抗菌和促进创面血管形成等作用而加速创面愈合。随着研究的深入，发现MSCs发挥促进组织损伤修复的一个重要机制是旁分泌效应，在促进创面愈合过程中比细胞转分化的作用更大。其旁分泌中最有效的活性成分是MSCs分泌的exosome，在细胞信息传递中起着非常重要的作用，这一机制的提出为基于各种来源MSCs的非细胞治疗奠定了重要基础。

Exosome成分主要包括：microRNA、mRNA及蛋白等，不同来源的exosome的组成亦有差异，说明其功能的复杂性。由此可见，作为非细胞治疗的主要成分，间充质干细胞分泌的exosome在促进皮肤损伤修复中具有重要作用。间充质干细胞易于体外分离和培养，添加一定浓度的胎牛血清培养基被广泛用于间充质干细胞的培养和扩增，然后从体外培养的间充质干细胞中提取获得exosome，但由于其培养过程中动物源性蛋白或肽对间充质干细胞免疫排斥的可能，并且提取出的exosome也有导致朊病毒和某些未知动物传染病传播的风险。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其应用，可用于皮肤创伤/烧伤、各种原发性及继发性皮肤溃疡的治疗。

本发明的制剂，包含有从脂肪干细胞中提取的exosome、血小板提取物和人血清凝胶；

其中exosome是从脂肪干细胞中提取的，其中脂肪干细胞的培养方法如下：

将脂肪组织加入PBS溶液充分洗涤离心后获取上层脂肪组织，再加入I型胶原酶消化液，在37℃，震荡条件下进行消化；

将消化好的脂肪组织加入到成人脂肪间充质干细胞完全培养基(是在成人脂肪间充质干细胞基础培养基、1×10¹²个血小板的提取物/1L完全培养基、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺)，离心沉降细胞及组织团块；离心后，去除上层脂肪组织，加入红细胞裂解液溶解残存的的红细胞；再离心收集细胞，用干细胞完全培养基重悬细胞，通过100μm孔径的尼龙网去除未消化的组织；然后接种于培养瓶，置于37℃，饱和湿度为5％的CO₂培养箱中静止培养；培养2天后，将未贴壁的细胞倒掉，PBS洗涤后加入成人脂肪间充质干细胞完全培养基，待细胞克隆长至80％融合时，0.05％胰酶消化传代至新培养瓶中获得脂肪间充质干细胞；

所述的制品为溶液，其中包含有药理有效浓度的脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物、人血清、溶剂；

所述的制品还可以是凝胶，其中包含有药理有效浓度的脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物、人血清、明胶和溶剂；

本发明发现应用血小板提取物替代血清培养人脂肪干细胞，能获得与添加血清培养相同的效果，但避免了朊病毒和某些未知动物源性传染病传播的风险，并且避免了动物源性蛋白或肽对间充质干细胞免疫排斥的可能。与单纯的使用脂肪干细胞分泌的exosome及血小板提取物相比，脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清制剂能够更有效地促进正常小鼠皮肤损伤的修复，可用于皮肤创伤/烧伤、各种原发性及继发性皮肤溃疡的治疗。

附图说明

图1：P2代人脂肪间充质干细胞的培养。对照组为现有的含10％FBS的α-MEM细胞培养基培养的人脂肪间充质干细胞；实验组为应用血小板提取物培养的人脂肪间充质干细胞，可见细胞生长状态更加良好，可见大量成纤维细胞样细胞均匀分布，呈明显的漩涡状生长。

图2：小鼠背部皮肤损伤模型的建立。使用7mm环钻和组织剪刀剪去小鼠背部中央7mm区域内的皮肤，保留皮下筋膜及组织，将内径7mm的橡胶圈缝合固定于皮肤上防止皮肤挛缩，便于观察修复情况。

图3：小鼠背部皮肤损伤修复的大体观察情况。对照组为不含血清的凝胶制剂(脂肪干细胞分泌的exosome及血小板提取物凝胶)处理组，实验组为含血清的凝胶制剂(脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清凝胶)处理组，于建模后0、5、7和9天分别照相，观察并各组小鼠的皮肤损伤修复的情况。

图4：小鼠背部皮肤损伤修复的统计结果。在损伤后修复的第5、7、9天，与使用不含血清的凝胶制剂的对照组(脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物凝胶)相比，外源性添加脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清的联合使用能更有效促进正常小鼠皮肤的损伤修复。

具体实施方式

申请人对脂肪干细胞的培养方法进行了改进，即在培养过程中不添加胎牛血清及人血清，而是采用血小板提取物替代培养，从而使提取的exosome克服了目前存在的问题；同时添加人血清凝胶，使制成的制剂对皮肤的损伤修复效果明显改善，从而促成了本发明。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：血小板提取物的制备

取EDTA抗凝的血浆，1600转离心10分钟；从上方取3/4血浆，注意不要取到白细胞和红细胞，将血浆转移到10ml锥形试管中；添加EDTA/PBS缓冲液补足至10ml体积，3000转离心5分钟；移除上清，使用2ml EDTA/PBS缓冲液重悬血小板，添加EDTA/PBS缓冲液补足至10ml体积，3000转离心5分钟；移除上清，使用适量的PBS缓冲液重悬血小板，调整浓度为1×10¹²/ml。置于-80℃冰箱内冻存过夜，次日将其从冰箱内取出，迅速置于37℃水浴锅内快速解冻，反复冻融5次，使血小板充分裂解并释放生长因子，然后置于冷冻离心机中，4℃3000转离心30分钟，取上清液经0.22um无菌滤器过滤即得到血小板提取物。

以1：1000的浓度添加到脂肪间充质干细胞培养基中，以1：1000的浓度添加到含有脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清的制剂中。

实施例2：从脂肪干细胞中提取exosome

申请人在研究中发现，按照现有的方法从脂肪干细胞中提取的上清液，在用于治疗皮肤损伤时，存在着产生红斑和轻度水肿的现象，因此，申请人对脂肪干细胞的培养方法和exosome的提纯方法进行了改进，从而使制备的exosome有效的克服了上述的问题。

提取exosome的步骤如下：

一、制备脂肪间充质干细胞

1)将吸脂手术吸取的脂肪组织，转移至50mL离心管中，加入PBS充分洗涤1500转/分离心5分钟，获取上层脂肪组织。按照脂肪组织：胶原酶＝1:1的比例将脂肪组织加入I型胶原酶消化液(0.2％I型胶原酶消化液)中，置于37℃摇床中，250转/分剧烈振荡60分钟；

2)将消化好的脂肪组织立刻加入成人脂肪间充质干细胞完全培养基(98％赛业生物科技有限公司的成人脂肪间充质干细胞基础培养基、1:1000稀释的血小板提取物、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺)，1500转/分离心10分钟，沉降细胞及组织团块。

3)离心后，将上层脂肪组织小心倒掉，加入红细胞裂解液，室温放置2分钟，溶解残存的的红细胞。

4)1000转/分离心5分钟收集细胞，用干细胞完全培养基重悬细胞，通过100μm孔径的尼龙网去除未消化的组织。

5)计数，按照1.0×10⁶/mL的细胞密度接种于培养瓶，置于37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中静止培养。

6)2天后，将未贴壁的细胞倒掉，PBS轻轻洗一遍，加入干细胞完全培养基，待细胞克隆长至80％融合时，0.05％胰酶消化传代至新培养瓶中获得脂肪间充质干细胞。

与现有的含10％FBS的α-MEM细胞培养基培养人脂肪间充质干细胞相比，应用血小板提取物培养的人脂肪间充质干细胞生长状态更加良好，细胞传至P2代时，即可见大量成纤维细胞样细胞均匀分布，呈明显的漩涡状生长(图1)。

取培养的P3代细胞，用PBS洗两次，用胰酶消化成单细胞悬液，1500rpm/min,离心5min。收集细胞沉淀，PBS重悬漂洗两次，细胞计数并稀释至1Χ10⁶个/ml，加入鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105和HLA-DR单克隆抗体，孵育30min，PBS漂洗三次，弃去上清，200ulPBS重悬，应用流式细胞仪检测细胞表面标记物的表达。应用添加血小板提取物的无血清完全培养基条件下，分离培养的脂肪间充质干细胞符合细胞表面标记的鉴定标准，即高表达特异性的CD29(98.58％±3.29％)、CD44(99.36％±8.13％)、CD73(98.71％±0.65％)、CD105(99.72％±0.16％)，而CD34(1.99％±1.08％)、CD45(0.61％±0.479％)和HLA-DR(1.32％±0.05％)表达很低。

应用SBI公司的ExoQuick TC exosome precipitation solution提取细胞培养上清中的exosome,具体步骤如下：收集生物液体，并于3000g离心15分钟去除细胞或细胞碎片；将上清转移至另一干净的灭菌管中，加入适量的ExoQuick TC试剂(体积配比为样品体积：ExoQuick TC体积＝5:1)；上下颠倒离心管，混匀，4℃孵育过夜(至少12小时)；4℃1500g离心30min，管底可见沉淀；去除上清；1500g离心5min，小心去除上层的液体组分；用100-200ul磷酸盐缓冲液重悬沉淀获得exosome，并用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量检测。按照本实施例方法从脂肪干细胞中提取的exosome，不存在动物源性蛋白及肽残留的可能，并且也没有动物源性传染病传播的风险；在用于治疗皮肤损伤时，均未出现红斑和轻度水肿的现象。

实施例3：外源性添加脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清凝胶对正常小鼠皮肤损伤修复的影响

1.脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清凝胶的制备

将实施例2制备的exosome提取物、实施例1制备的血小板提取物、人血清及明胶进行混合，得到exosome、血小板提取物及人血清的凝胶制剂，具体方式为，在超净工作台中，先将4g明胶和10g人血清混合，用玻璃棒充分搅拌，得到明胶血清溶液，取1ml明胶血清溶液，加入1mg exosome，充分搅拌混匀，即得到exosome及血清的凝胶制剂，再加入1×10⁹个血小板的提取物，即得到exosome、血小板提取物及人血清的凝胶。

2.外源性添加脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清凝胶对正常小鼠皮肤损伤修复的影响

将12只C57BL/6小鼠(6-8周龄)随机分为对照组和实验组，使用7mm环钻和组织剪刀剪去小鼠背部中央7mm区域内的皮肤，保留皮下筋膜及组织(图2)，同时对照组小鼠背部创伤处涂抹不含血清的凝胶制剂(脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物凝胶)(3次/天)，实验组小鼠背部创伤处涂抹含血清的凝胶制剂(脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清凝胶)(3次/天)，于建模后0、5、7和9天分别照相，观察并计算各组小鼠的皮肤损伤修复的情况。涂抹含血清的凝胶制剂的实验组(脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清凝胶)小鼠的背部皮肤损伤修复的速度明显较涂抹不含人血清凝胶的制剂对照组快(图3)；统计分析表明，与使用不含血清的凝胶制剂的对照组(脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物凝胶)相比，外源性添加脂肪干细胞分泌的exosome、血小板提取物及人血清的联合使用能更有效促进正常小鼠皮肤的损伤修复(图4)。