NOTCH4或其抑制剂的医药用途的制作方法

本发明属于细胞生物学和医药领域，涉及notch4的医药用途或者notch4的抑制剂的医药用途。

背景技术：

巨核细胞(megakaryocyte，简称mk)是骨髓中生成血小板的血细胞，其主要功能是产生血小板，血小板在止血凝血、伤口愈合以及炎症反应等过程中有重要作用。临床上输注血小板和/或巨核细胞可用于：血小板减少症、肿瘤化疗后、手术、hiv感染以及外伤出血等。和其它血细胞一样，巨核细胞也是由造血干细胞(hscs)分化而来。造血干细胞在相关刺激作用下分化为巨核系-红系祖细胞(mep)，mep在细胞因子促血小板生成素(tpo)的作用下分化为巨核祖细胞(mkp)，巨核祖细胞通过有丝分裂进行增殖，随后巨核祖细胞通过核内有丝分裂不断变大，染色体数目不断加倍，最多形成128倍体的成熟巨核细胞。成熟巨核细胞的细胞膜上会形成很多突起的分支不断拉伸，伸进血窦的血管里，这些小的分支就是前血小板，随着这些分支不断拉伸逐渐脱离巨核细胞形成血小板。

目前捐赠血小板远不能满足临床需求，原因主要包括：(1)血小板体外保存困难，需要在血浆中20℃－24℃保存仅5天；(2)目前捐赠者有限，且不能多捐赠者混合使用；(3)多次输注他人的血小板容易产生同种异体的人类白细胞抗原(hla)抗体和人类血小板抗原(hpa)抗体，等等。因此，迫切需要开发新的制备血小板或者巨核细胞的技术手段。

利用干细胞再生巨核细胞可望满足巨大临床需求。国内进行的一期临床试验证实了体外产生的巨核细胞移植的安全性和有效性。然而目前最大的挑战是体外产生mk以及mk产生血小板的效率极低。目前国际上存在的较好的体外干细胞分化巨核细胞/血小板体系有：来自日本kojieto实验室，2014年他们通过外源性导入三个因子：c-myc，bcl-xl以及bmi1，产生可以冻存并长期传代的mk细胞，但由于有外源性导入基因(包括癌基因c-myc)的过程，有一定的安全风险。同期还有来自advancedcelltechnology公司的体系，其采用了该公司特有的培养基和大量细胞因子，但配方并未公开而且过程花费较贵。以上两种方法产率都很有限，如果要产生一个单位的血小板，需要100个100mm的培养皿的干细胞培养以及25l－50l的培养基，价格非常昂贵。此外，2016年，英国的一个实验室通过外源性导入gata1、fl11以及tal1，体外由多能干细胞生成巨核细胞mk。这比之前研究的mk生成率提高了12500倍，但时间长达3个月，而且mk产生血小板的效率依旧很低。

notch是一个约300kd的单次型跨膜受体蛋白，其胞外部分由不同数量的表皮生长因子样重复序列(egf-r)和三个富含半胱氨酸的lnr(lin/notchrepeats)重复序列组成，其中egf-r重复序列中的第11-12个重复是与配体结合的关键区域。其胞内区则包含了一个与csl(cbfl/suppresorofhairless/lag1)转录因子结合的ram(rbp-jkappaassociatedmolecular)结构域、6个锚蛋白(cdc10/ankyrin，ank)重复序列、2个核定位信号(nls)和1个与notch蛋白细胞内段降解有关的pest结构域。在哺乳动物中，notch受体可以分为四个类型：notch1、notch2、notch3和notch4。notch通路的四个配体存在明显的差异，例如notch1和notch2受体包含36个egf重复，而notch3及notch4分别包含34及29个egf重复；notch受体1－3包含有两个核定位信号(nls)，在notch4受体中含有一个核定位信号(nls)；另外，notch1受体的胞内区的转录激活结构域(tad)的活性较notch2强，但是在notch3和notch4中不存在tad。notch受体1－4在组织特异性上也存在差异，在血液系统、胰腺、肝、肺、心血管系统等中，notch通路4种受体蛋白分布及表达量不同。notch受体蛋白被合成加工后，与相邻细胞的notch配体结合，启动信号转导途径。目前发现人的notch配体有五种，分别为dll1、dll3、dll4、jag1和jag2。当配体结合到notch受体蛋白胞外区后，notch蛋白先后经过肿瘤坏死因子-α-转化酶(tnf-α-convertingenzyme，tace)和γ分泌酶(γ-secretase)两次酶切，释放notch胞内区(icn)进入细胞核与csl转录因子结合形成复合体，从而促进靶基因如hes的表达，进而发挥生物学作用。notch受体、notch配体、csl-dna结合蛋白组成完整的notch信号通路。notch信号通路广泛存在于细胞表面，介导细胞间信号传递，调控细胞的转录，影响细胞的增殖分化。在脊推动物和无脊稚动物的发育过程中，对细胞命运的决定起着重要作用。notch信号通路参与调控神经系统发育、器官发育、免疫系统的形成及肿瘤的形成；调节细胞分化和组织形成。另外，notch受体在造血前体细胞中高度表达，notch配体在骨髓基质细胞中高度表达，在造血干细胞/祖细胞的自我更新及分化中也起着极为重要的作用。

2008年cellstemcell文章揭示了notch4在巨核系-红系祖细胞中表达最高，对小鼠巨核细胞分化是正向调控作用(merchert,cornejomg,searsc,kindlert,mooresa,maillardi,pearws,asterjc,gillilanddg，notchsignalingspecifiesmegakaryocytedevelopmentfromhematopoieticstemcells，cellstemcell.2008sep11；3(3):314-26.)。

目前，亟需开发新的制备促进哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成或者促进血小板生成的技术手段。

技术实现要素：

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现了notch4蛋白或notch4基因抑制人巨核细胞分化生成的作用；并且本发明人还惊奇地发现，下调notch4基因表达水平，或者抑制notch通路，能够显著地促进体外巨核细胞生成，提高体外干细胞分化产生巨核细胞的比例，能够应用于促进体外巨核细胞或血小板再生。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及如下的(1)－(5)项中的任一项在制备调节(例如促进或抑制)哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成的药物、治疗巨核细胞发育障碍的药物或者调节(例如促进或抑制)血小板生成的药物中的用途：

(1)notch4蛋白；

(2)notch4基因；

(3)核酸构建体，其含有用于完全敲除或者部分敲除notch4基因的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸为sirna例如shrna，或者为用于crispr/cas9系统的guiderna；优选地，所述guiderna的序列如seqidno:3和/或seqidno:4所示。

优选地，所述核酸构建体为重组载体，优选为重组表达载体，更优选为重组慢病毒表达载体；

(4)宿主细胞，其中的notch4基因完全敲除或部分敲除；优选地，其含有第(3)项所述的核酸构建体；

(5)一种组合物，其含有前面(1)－(4)项中的任一项。

本发明的另一方面涉及如下的①－④项中的任一项在制备促进哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成的药物、治疗巨核细胞发育障碍的药物或者促进血小板生成的药物中的用途：

①抑制或降低notch4基因表达的药物；

②抑制或阻断notch4蛋白活性的药物；

③对notch4基因进行完全敲除或者部分敲除的药物；

④notch通路抑制剂例如肿瘤坏死因子-α-转化酶抑制剂或γ分泌酶抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述哺乳动物为灵长类，例如人。

在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述γ分泌酶抑制剂选自ro4929097、l-685458、ly411575、pf-03084014、yo-01027、dapt和fli-06中的任意一种或者多种。

在本发明的一个具体的实施方式中，本发明人利用干细胞体外分化体系，筛选notch通路的抑制剂，包括γ分泌酶抑制剂以及notch4的抗体等，γ分泌酶抑制剂(ro4929097、l685458、dapt等等)以及notch4抗体能够显著地促进体外巨核祖细胞和/或成熟巨核细胞的生成。

在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述抑制或阻断notch4蛋白活性的药物为抗notch4蛋白的抗体；优选地，所述抗体为单克隆抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述对notch4基因进行完全敲除或者部分敲除的药物用于完全敲除或者部分敲除notch4基因的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸为sirna例如shrna，或者为用于crispr/cas9系统的guiderna；优选地，所述guiderna的序列如seqidno:3和/或seqidno:4所示。

本发明还涉及一种重组载体，其含有用于完全敲除或者部分敲除notch4基因的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸为sirna例如shrna，或者为用于crispr/cas9系统的guiderna；优选地，所述重组载体为重组慢病毒载体；优选地，所述guiderna的序列如seqidno:3和/或seqidno:4所示。

在本发明的一个实施方案中，所述的重组载体，其用于调节(例如促进或抑制)哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成，治疗巨核细胞发育障碍，调节(例如促进或抑制)血小板生成，在体外制备巨核细胞和/或巨核祖细胞，在体外制备血小板，或用于筛选调节(例如促进或抑制)哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成的药物、治疗巨核细胞发育障碍的药物或者调节(例如促进或抑制)血小板生成的药物。

本发明还涉及一种宿主细胞，其含有本发明的重组载体，或者其中的notch4基因被完全敲除或部分敲除；

优选地，所述宿主细胞为胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞；

优选地，所述诱导性多潜能干细胞为重组的bc1细胞或重组的aicas9细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述的宿主细胞，其用于调节(例如促进或抑制)哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成，治疗巨核细胞发育障碍，调节(例如促进或抑制)血小板生成，在体外制备巨核细胞和/或巨核祖细胞，在体外制备血小板，或用于筛选调节(例如促进或抑制)哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成的药物、治疗巨核细胞发育障碍的药物或者调节(例如促进或抑制)血小板生成的药物。本发明还涉及一种组合物，其包括：

本发明的宿主细胞，以及细胞培养液。

本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包括独立包装的胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞，以及选自如下的1)－3)项中的任一项的药物或者试剂：

1)抑制或降低notch4基因表达的药物；

2)抑制或阻断notch4蛋白活性的药物；

3)对notch4基因进行完全敲除或者部分敲除的药物；

4)notch通路抑制剂例如肿瘤坏死因子-α-转化酶抑制剂或γ分泌酶抑制剂；

优选地，所述诱导性多潜能干细胞为重组的bc1细胞或重组的aicas9细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述γ分泌酶抑制剂选自ro4929097、l-685458、ly411575、pf-03084014、yo-01027、dapt和fli-06中的任意一种或者多种。

在本发明的一个实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述抑制或阻断notch4蛋白活性的药物为抗notch4蛋白的抗体；优选地，所述抗体为单克隆抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述对notch4基因进行完全敲除或者部分敲除的药物用于完全敲除或者部分敲除notch4基因的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸为sirna例如shrna，或者为用于crispr/cas9系统的guiderna；优选地，所述guiderna的序列如seqidno:3和/或seqidno:4所示。

在本发明的一个实施方案中，所述的试剂盒，其用于调节(例如促进或抑制)哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成，治疗巨核细胞发育障碍，调节(例如促进或抑制)血小板生成，在体外制备巨核细胞和/或巨核祖细胞，在体外制备血小板，或用于筛选调节(例如促进或抑制)哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成的药物、治疗巨核细胞发育障碍的药物或者调节(例如促进或抑制)血小板生成的药物。

本发明的再一方面涉及一种在体外制备巨核细胞和/或巨核祖细胞的方法，包括：

抑制或降低胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4基因表达的步骤；或者

抑制或阻断胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4蛋白活性的步骤。

在本发明的一个实施方案中，所述的“抑制或降低胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4基因表达”或者“抑制或阻断胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4蛋白活性”，通过使用有效量的本发明的组合物或者本发明的试剂盒实现；或者通过加入有效量的选自如下的①－④项中的任一项实现：

①抑制或降低notch4基因表达的药物；

②抑制或阻断notch4蛋白活性的药物；

③对notch4基因进行完全敲除或者部分敲除的药物；

④notch通路抑制剂例如肿瘤坏死因子-α-转化酶抑制剂或γ分泌酶抑制剂。

本发明的再一方面涉及一种在体外制备血小板的方法，包括：

抑制或降低胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4基因表达的步骤；或者

抑制或阻断胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4蛋白活性的步骤。

在本发明的一个实施方案中，所述的“抑制或降低胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4基因表达”或者“抑制或阻断胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4蛋白活性”，通过使用有效量的本发明的组合物或者本发明的试剂盒实现；或者通过加入有效量的选自如下的①－④项中的任一项实现：

①抑制或降低notch4基因表达的药物；

②抑制或阻断notch4蛋白活性的药物；

③对notch4基因进行完全敲除或者部分敲除的药物；

④notch通路抑制剂例如肿瘤坏死因子-α-转化酶抑制剂或γ分泌酶抑制剂。

本发明的再一方面涉及一种筛选调节(例如促进或抑制)哺乳动物巨核细胞和/或巨核祖细胞生成的药物、治疗巨核细胞发育障碍的药物或者调节(例如促进或抑制)血小板生成的药物的方法，其包括：

检测待测药物的抑制或降低胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4基因表达水平的步骤；或者

检测待测药物的抑制或阻断胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中notch4蛋白活性水平的步骤。

如果该待测药物能够抑制或降低notch4基因表达水平，或者抑制或阻断notch4蛋白活性水平，则可以作为候选药物。

在本发明的一个实施方案中，将待测药物加入到分离的胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞中，以不加待测药物的细胞作为对照。

在本发明的一个实施方案中，将待测药物施与哺乳动物例如人或小鼠，观察或者检测目标症状或者指标是否有改善。

本发明还涉及一种治疗和/或预防巨核细胞发育障碍或者治疗和/或预防血小板异常相关疾病(例如血小板减少症)的方法，包括给予受试者有效量的本发明的宿主细胞、组合物或者试剂盒的步骤，或者包括给予受试者有效量的选自如下的①－④项中的任一项的步骤：

①抑制或降低notch4基因表达的药物；

②抑制或阻断notch4蛋白活性的药物；

③对notch4基因进行完全敲除或者部分敲除的药物；

④notch通路抑制剂例如肿瘤坏死因子-α-转化酶抑制剂或γ分泌酶抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，所述的方法，其中，所述γ分泌酶抑制剂选自ro4929097、l-685458、ly411575、pf-03084014、yo-01027、dapt和fli-06中的任意一种或者多种。

在本发明的一个实施方案中，所述的方法，其中，所述抑制或阻断notch4蛋白活性的药物为抗notch4蛋白的抗体；优选地，所述抗体为单克隆抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述的方法，其中，所述对notch4基因进行完全敲除或者部分敲除的药物用于完全敲除或者部分敲除notch4基因的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸为sirna例如shrna，或者为用于crispr/cas9系统的guiderna；优选地，所述guiderna的序列如seqidno:3和/或seqidno:4所示。

抑制受试者的notch4蛋白活性的水平或者下调受试者的notch4基因表达的水平，取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。本领域通常的做法是，从低于为得到所需治疗效果和/或预防效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明中，

术语“巨核细胞分化”是指，本专利主要指的是体外的巨核细胞分化，具体过程是从具有多向分化能力的胚胎干细胞/诱导性多潜能干细胞，在多种细胞因子组合下，使多能干细胞向造血干细胞分化，进而在细胞因子促血小板生成素(tpo)的作用下分化为巨核祖细胞(mkp)以及成熟巨核细胞。

在本发明中，当提及notch4蛋白或notch4受体的氨基酸序列时，其包括notch4蛋白的全长，还包括其融合蛋白。然而，本领域技术人员理解，在notch4蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。在本发明的一个实施方案中，notch4蛋白为人notch4蛋白。

人notch4蛋白的氨基酸序列如下：(2003aa)

mqppslllllllllllcvsvvrprgllcgsfpepcanggtclslslgqgtcqcapgflgetcqfpdpcqnaqlcqnggscqallpaplglpsspspltpsflctclpgftgercqakledpcppsfcskrgrchiqasgrpqcscmpgwtgeqcqlrdfcsanpcvnggvclatypqiqchcppgfeghacerdvnecfqdpgpcpkgtschntlgsfqclcpvgqegprcelragpcpprgcsnggtcqlmpekdstfhlclcppgfigpdcevnpdncvshqcqnggtcqdgldtytclcpetwtgwdcsedvdecetqgpphcrnggtcqnsagsfhcvcvsgwggtsceenlddciaatcapgstcidrvgsfsclcppgrtgllchledmclsqpchgdaqcstnpltgstlclcqpgysgptchqdldeclmaqqgpspcehggsclntpgsfnclcppgytgsrceadhneclsqpchpgstcldllatfhclcppglegqlcevetnecasapclnhadchdllngfqciclpgfsgtrceedidecrsspcanggqcqdqpgafhckclpgfegprcqtevdeclsdpcpvgascldlpgaffclcpsgftgqlcevplcapnlcqpkqickdqkdkanclcpdgspgcappednctchhghcqrsscvcdvgwtgpeceaelggcisapcahggtcypqpsgynctcptgytgptcseemtachsgpclnggscnpspggyyctcppshtgpqcqtstdycvsapcfnggtcvnrpgtfsclcamgfqgprcegklrpscadspcrnratcqdspqgprclcptgytggscqtlmdlcaqkpcprnshclqtgpsfhclclqgwtgplcnlplsscqkaalsqgidvsslchngglcvdsgpsyfchcppgfqgslcqdhvnpcesrpcqngatcmaqpsgylcqcapgydgqncskeldacqsqpchnhgtctpkpggfhcacppgfvglrcegdvdecldqpchptgtaachslanafycqclpghtgqwceveidpchsqpcfhggtceatagsplgfichcpkgfegptcshrapscgfhhchhgglclpspkpgfpprcaclsgyggpdcltppapkgcgppspclyngscsettglggpgfrcscphsspgprcqkpgakgcegrsgdgacdagcsgpggnwdggdcslgvpdpwkgcpshsrcwllfrdgqchpqcdseeclfdgydcetppactpaydqychdhfhnghcekgcntaecgwdggdcrpedgdpewgpslallvvlsppaldqqlfalarvlsltlrvglwvrkdrdgrdmvypypgaraeeklggtrdptyqeraapqtqplgketdslsagfvvvmgvdlsrcgpdhpasrcpwdpglllrflaamaavgalepllpgpllavhphagtappanqlpwpvlcspvagvillalgallvlqlirrrrrehgalwlppgftrrprtqsaphrrrpplgedsiglkalkpkaevdedgvvmcsgpeegeevgqaeetgppstcqlwslsggcgalpqaamltppqesemeapdldtrgpdgvtplmsavccgevqsgtfqgawlgcpepweplldggacpqahtvgtgetplhlaarfsrptaarrlleaganpnqpdragrtplhaavaadarevcqlllrsrqtavdartedgttplmlaarlavedlveeliaaqadvgardkwgktalhwaaavnnaraarsllqagadkdaqdnreqtplflaaregavevaqlllglgaarelrdqaglapadvahqrnhwdlltllegagppearhkatpgreagpfprartvsvsvpphgggalprcrtlsagagprgggaclqartwsvdlaargggayshcrslsgvgagggptprgrrfsagmrgprpnpaimrgrygvaagrggrvstddwpcdwvalgacgsasnipipppcltpspergspqldcgppalqempinqggegkk(seqidno:1)

编码人notch4蛋白的核酸序列(6012bp)

atgcagcccccttcactgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctatgtgtctcagtggtcagacccagagggctgctgtgtgggagtttcccagaaccctgtgccaatggaggcacctgcctgagcctgtctctgggacaagggacctgccagtgtgcccctggcttcctgggtgagacgtgccagtttcctgacccctgccagaacgcccagctctgccaaaatggaggcagctgccaagccctgcttcccgctcccctagggctccccagctctccctctccattgacacccagcttcttgtgcacttgcctccctggcttcactggtgagagatgccaggccaagcttgaagacccttgtcctccctccttctgttccaaaaggggccgctgccacatccaggcctcgggccgcccacagtgctcctgcatgcctggatggacaggtgagcagtgccagcttcgggacttctgttcagccaacccatgtgttaatggaggggtgtgtctggccacatacccccagatccagtgccactgcccaccgggcttcgagggccatgcctgtgaacgtgatgtcaacgagtgcttccaggacccaggaccctgccccaaaggcacctcctgccataacaccctgggctccttccagtgcctctgccctgtggggcaggagggtccacgttgtgagctgcgggcaggaccctgccctcctaggggctgttcgaatgggggcacctgccagctgatgccagagaaagactccacctttcacctctgcctctgtcccccaggtttcataggcccagactgtgaggtgaatccagacaactgtgtcagccaccagtgtcagaatgggggcacttgccaggatgggctggacacctacacctgcctctgcccagaaacctggacaggctgggactgctccgaagatgtggatgagtgtgagacccagggtccccctcactgcagaaacgggggcacctgccagaactctgctggtagctttcactgcgtgtgtgtgagtggctggggcggcacaagctgtgaggagaacctggatgactgtattgctgccacctgtgccccgggatccacctgcattgaccgggtgggctctttctcctgcctctgcccacctggacgcacaggactcctgtgccacttggaagacatgtgtctgagccagccgtgccatggggatgcccaatgcagcaccaaccccctcacaggctccacactctgcctgtgtcagcctggctattcggggcccacctgccaccaggacctggacgagtgtctgatggcccagcaaggcccaagtccctgtgaacatggcggttcctgcctcaacactcctggctccttcaactgcctctgtccacctggctacacaggctcccgttgtgaggctgatcacaatgagtgcctctcccagccctgccacccaggaagcacctgtctggacctacttgccaccttccactgcctctgcccgccaggcttagaagggcagctctgtgaggtggagaccaacgagtgtgcctcagctccctgcctgaaccacgcggattgccatgacctgctcaacggcttccagtgcatctgcctgcctggattctccggcacccgatgtgaggaggatatcgatgagtgcagaagctctccctgtgccaatggtgggcagtgccaggaccagcctggagccttccactgcaagtgtctcccaggctttgaagggccacgctgtcaaacagaggtggatgagtgcctgagtgacccatgtcccgttggagccagctgccttgatcttccaggagccttcttttgcctctgcccctctggtttcacaggccagctctgtgaggttcccctgtgtgctcccaacctgtgccagcccaagcagatatgtaaggaccagaaagacaaggccaactgcctctgtcctgatggaagccctggctgtgccccacctgaggacaactgcacctgccaccacgggcactgccagagatcctcatgtgtgtgtgacgtgggttggacggggccagagtgtgaggcagagctagggggctgcatctctgcaccctgtgcccatggggggacctgctacccccagccctctggctacaactgcacctgccctacaggctacacaggacccacctgtagtgaggagatgacagcttgtcactcagggccatgtctcaatggcggctcctgcaaccctagccctggaggctactactgcacctgccctccaagccacacagggccccagtgccaaaccagcactgactactgtgtgtctgccccgtgcttcaatgggggtacctgtgtgaacaggcctggcaccttctcctgcctctgtgccatgggcttccagggcccgcgctgtgagggaaagctccgccccagctgtgcagacagcccctgtaggaatagggcaacctgccaggacagccctcagggtccccgctgcctctgccccactggctacaccggaggcagctgccagactctgatggacttatgtgcccagaagccctgcccacgcaattcccactgcctccagactgggccctccttccactgcttgtgcctccagggatggaccgggcctctctgcaaccttccactgtcctcctgccagaaggctgcactgagccaaggcatagacgtctcttccctttgccacaatggaggcctctgtgtcgacagcggcccctcctatttctgccactgcccccctggattccaaggcagcctgtgccaggatcacgtgaacccatgtgagtccaggccttgccagaacggggccacctgcatggcccagcccagtgggtatctctgccagtgtgccccaggctacgatggacagaactgctcaaaggaactcgatgcttgtcagtcccaaccctgtcacaaccatggaacctgtactcccaaacctggaggattccactgtgcctgccctccaggctttgtggggctacgctgtgagggagacgtggacgagtgtctggaccagccctgccaccccacaggcactgcagcctgccactctctggccaatgccttctactgccagtgtctgcctggacacacaggccagtggtgtgaggtggagatagacccctgccacagccaaccctgctttcatggagggacctgtgaggccacagcaggatcacccctgggtttcatctgccactgccccaagggttttgaaggccccacctgcagccacagggccccttcctgcggcttccatcactgccaccacggaggcctgtgtctgccctcccctaagccaggcttcccaccacgctgtgcctgcctcagtggctatgggggtcctgactgcctgaccccaccagctcctaaaggctgtggccctccctccccatgcctatacaatggcagctgctcagagaccacgggcttggggggcccaggctttcgatgctcctgccctcacagctctccagggccccggtgtcagaaacccggagccaaggggtgtgagggcagaagtggagatggggcctgcgatgctggctgcagtggcccgggaggaaactgggatggaggggactgctctctgggagtcccagacccctggaagggctgcccctcccactctcggtgctggcttctcttccgggacgggcagtgccacccacagtgtgactctgaagagtgtctgtttgatggctacgactgtgagacccctccagcctgcactccagcctatgaccagtactgccatgatcacttccacaacgggcactgtgagaaaggctgcaacactgcagagtgtggctgggatggaggtgactgcaggcctgaagatggggacccagagtgggggccctccctggccctgctggtggtactgagccccccagccctagaccagcagctgtttgccctggcccgggtgctgtccctgactctgagggtaggactctgggtaaggaaggatcgtgatggcagggacatggtgtacccctatcctggggcccgggctgaagaaaagctaggaggaactcgggaccccacctatcaggagagagcagcccctcaaacgcagcccctgggcaaggagaccgactccctcagtgctgggtttgtggtggtcatgggtgtggatttgtcccgctgtggccctgaccacccggcatcccgctgtccctgggaccctgggcttctactccgcttccttgctgcgatggctgcagtgggagccctggagcccctgctgcctggaccactgctggctgtccaccctcatgcagggaccgcaccccctgccaaccagcttccctggcctgtgctgtgctccccagtggccggggtgattctcctggccctaggggctcttctcgtcctccagctcatccggcgtcgacgccgagagcatggagctctctggctgccccctggtttcactcgacggcctcggactcagtcagctccccaccgacgccggcccccactaggcgaggacagcattggtctcaaggcactgaagccaaaggcagaagttgatgaggatggagttgtgatgtgctcaggccctgaggagggagaggaggtgggccaggctgaagaaacaggcccaccctccacgtgccagctctggtctctgagtggtggctgtggggcgctccctcaggcagccatgctaactcctccccaggaatctgagatggaagcccctgacctggacacccgtggacctgatggggtgacacccctgatgtcagcagtttgctgtggggaagtacagtccgggaccttccaaggggcatggttgggatgtcctgagccctgggaacctctgctggatggaggggcctgtccccaggctcacaccgtgggcactggggagacccccctgcacctggctgcccgattctcccggccaaccgctgcccgccgcctccttgaggctggagccaaccccaaccagccagaccgggcagggcgcacaccccttcatgctgctgtggctgctgatgctcgggaggtctgccagcttctgctccgtagcagacaaactgcagtggacgctcgcacagaggacgggaccacacccttgatgctggctgccaggctggcggtggaagacctggttgaagaactgattgcagcccaagcagacgtgggggccagagataaatgggggaaaactgcgctgcactgggctgctgccgtgaacaacgcccgagccgcccgctcgcttctccaggccggagccgataaagatgcccaggacaacagggagcagacgccgctattcctggcggcgcgggaaggagcggtggaagtagcccagctactgctggggctgggggcagcccgagagctgcgggaccaggctgggctagcgccggcggacgtcgctcaccaacgtaaccactgggatctgctgacgctgctggaaggggctgggccaccagaggcccgtcacaaagccacgccgggccgcgaggctgggcccttcccgcgcgcacggacggtgtcagtaagcgtgcccccgcatgggggcggggctctgccgcgctgccggacgctgtcagccggagcaggccctcgtgggggcggagcttgtctgcaggctcggacttggtccgtagacttggctgcgcgggggggcggggcctattctcattgccggagcctctcgggagtaggagcaggaggaggcccgacccctcgcggccgtaggttttctgcaggcatgcgcgggcctcggcccaaccctgcgataatgcgaggaagatacggagtggctgccgggcgcggaggcagggtctcaacggatgactggccctgtgattgggtggccctgggagcttgcggttctgcctccaacattccgatcccgcctccttgccttactccgtccccggagcggggatcacctcaacttgactgtggtcccccagccctccaagaaatgcccataaaccaaggaggagagggtaaaaaatag(seqidno:2)

本发明中，

术语“胚胎干细胞(escs)”是指从早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。

术语“诱导性多潜能干细胞(ipscs)”，2006年日本京都大学shinyayamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把oct3/4,sox2、c-myc和klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的ips细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。随后世界各地不同科学家陆续发现其它方法，用特定的基因组合与转染也可以将已分化的体细胞诱导重编程为多潜能干细胞。

术语“造血干细胞(hsc)”是指血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。

本优选地，发明涉及的胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或造血干细胞源自哺乳动物例如人的细胞。

术语“核酸构建体”，在文中定义为单链或双链核酸分子，优选是指人工构建的核酸分子。可选地，所述核酸构建体还包含有可操作地连接的1个或多个调控序列。

在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。所述“可操作地连接”可以通过基因重组的手段实现。

在本发明中，术语“载体”指的是，可将抑制某蛋白的多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件。

在本发明中，术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞、cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞、hek293细胞，或动物细胞例如人细胞。

术语“有效量”，当对象为个体时，是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。当对象为细胞时，是指产生目标效果或者发挥目标作用的剂量，例如细胞中的加药量为1μm－100μm、5μm－50μm、5μm－30μm、5μm－25μm、5μm－20μm、5μm－15μm、5μm－10μm、10μm－25μm、10μm－15μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、50μm或100μm，或者1μg/ml或2μg/ml等。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

本发明中，对于dna或rna的敲低包括但不限于，完全敲除和部分敲除。完全敲除是指将目标dna或目标rna的水平或其表达的蛋白的水平降低至几乎检测不到的水平(事实上，一般而言，很难将目标dna或目标rna100％地敲除掉)。部分敲除是指敲除的程度大于零，小于完全敲除的情况。

本发明中，如果没有特别说明，浓度单位μm表示μmol/l，mm表示mmol/l，nm表示nmol/l。

本发明中，提到细胞中的加药量时，如果没有特别说明，一般是指加药后药物的终浓度。

发明的有益效果

下调notch4基因表达水平，或者抑制notch通路能够显著地促进体外巨核细胞产生，有利于提高体外巨核细胞的产率，降低成本。本发明人还发现，notch通路抑制剂主要是促进了巨核祖细胞以及成熟巨核细胞生成。本发明为干细胞临床转化、体外产生巨核细胞用于临床移植、用于治疗血小板异常的相关疾病，提供新的解决方案。

附图说明

图1：倒置显微镜拍摄的细胞图片。放大倍数：4倍。其中，图1a的样品是正常对照(aicas9)；图1b的样品是部分敲除notch4的ipscs(notch4heter)；图1c的样品是完全敲除notch4的ipscs(notch4homo)图1a－图1c中，中间黑色的球是类胚体(eb)，周围的单细胞为造血细胞。

图2：流式细胞术检测图。其中，图2a－图2c分别代表的是正常对照aicas9的造血干细胞hsc(cd34⁺cd45⁺)、巨核祖细胞mkp(cd34⁺cd41⁺)以及成熟巨核细胞mk(cd41⁺cd42⁺)细胞群体的检测结果；图2d－图2f分别代表的是notch4heter的hsc、mkp以及mk细胞群体的检测结果；图2g－图2i分别代表的是notch4homo的hsc、mkp以及mk细胞群体的检测结果。

图3：流式细胞术检测结果的统计图。其中，纵坐标表示阳性细胞群占总细胞数的百分比。与正常对照(aicas9)相比，部分敲除notch4的ipscs(notch4heter)和完全敲除notch4的ipscs(notch4homo)分化成hsc(cd34⁺cd45⁺)、mkp(cd34⁺cd41⁺)以及mk(cd41⁺cd42⁺)之间的比较。

图4：第0天加入ro4929097(10μm)后，流式细胞术检测结果的统计图。其中，纵坐标表示阳性细胞群占总细胞数的百分比。

图5：在正常ipsc细胞bc1体外巨核谱系分化体系中不同的时间点加入各个浓度的不同notch通路抑制剂后，流式细胞术检测结果的统计图。图5a，5b，5c分别为hsc(cd34⁺cd45⁺)、mkp(cd34⁺cd41⁺)以及mk(cd41⁺cd42⁺)细胞群体的百分比。*，p<0.05。

图6：在正常ipsc细胞bc1体外巨核谱系分化体系中不同的时间点加入抑制剂ro4929097，l-685458以及dapt后，流式细胞术检测结果的统计图。其中，纵坐标表示加了不同的抑制剂以后，不同的细胞群体比对照组增加或减少的倍数；对照组加入dmso，设为1。图6a，在分化第2天分别加入10μm的ro4929097，10μml-685458，10μm的dapt；图6b，在分化第5天分别加入10μm的ro4929097，10μml-685458，10μm的dapt。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

图7：在脐血来源的cd34+细胞中加入不同的notch通路抑制剂后，流式细胞术检测结果的统计图。其中，纵坐标表示加了不同的抑制剂以后，不同的细胞群体比对照组增加的倍数；对照组加入dmso，设为1。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明中，下列缩写的含义是：

bfgf：basicfibroblastgrowthfactor，碱性成纤维细胞生长因子。

bmp4：bonemorphogeneticprotein4，骨形态发生蛋白4。

scf：stemcellfactor，干细胞因子。

vegf：vascularendothelialgrowthfactor，血管内皮生长因子。

实施例1：从诱导性多潜能干细胞(ipscs)体外分化获得包含造血干细胞、巨核祖细胞以及成熟巨核细胞的细胞体系

1.实验材料和试剂

正常人的ipscs细胞系bc1：来自美国约翰霍普金斯大学程临钊实验室。bc1细胞系是程临钊实验室自己建立的ipscs细胞系，来源于正常成人自愿者的骨髓cd34+细胞，通过episomal质粒转染进行重编程形成的ipscs细胞系。具体制备步骤亦可参见：doweysn,huangx,choubk,yez,chengl,generationofintegration-freehumaninducedpluripotentstemcellsfrompostnatalbloodmononuclearcellsbyplasmidvectorexpression,natprotoc.2012nov；7(11):2013-21.

e8培养基、imdm以及ham’sf12：均购自thermofisherscientific。

流式检测所用抗体：购自ebioscience。

2.实验方法

将bc1细胞系用e8培养基培养，培养条件为37℃，5％的co2，每3－4天根据细胞浓度按(1：5)－(1：10)传代，用0.5mmedta，室温孵育2分钟，然后用e8培养基吹打均匀，传到提前1小时铺vitronectin(玻璃粘连蛋白)的培养皿上。

分化时，采用spin-embryoidbody(spin-eb)法(nges,davisr,stanleyeg,elefantyag,aprotocoldescribingtheuseofarecombinantprotein-based,animalproduct-freemedium(apel)forhumanembryonicstemcelldifferentiationasspinembryoidbodies,natprotoc.2008；3(5):768-76.)。分化第0天(d0)，当ipscs汇合度达85％以上(汇合度是指所有细胞聚集起来占整个皿底面的百分比)，accutase消化37℃3分钟，用sfm培养基(50％imdm，50％ham’sf12，以及添加试剂和因子包括：人血白蛋白,monothioglycerol，glutamax，chemicallydefinedlipidconcentrate，l-ascorbicacid2-phosphatesesquimagnesiumsalthydrate，its-x)中和吹打，计数，离心。然后用sfm重悬，加入细胞因子10μmrockinhibitor(rho相关蛋白激酶抑制剂)，10ng/mlbfgf,10ng/mlbmp4。细胞种于圆底的96孔板中，每个孔种3000或5000cells/50μl(每孔种3000或5000个细胞，并且每孔50μl体积)。第2天，每孔加入50μlsfm培养基+10ng/mlbfgf+10ng/mlbmp4+100ng/mlscf+20ng/mlvegf。第5、第8、第11天每孔加入50μlsfm培养基+10ng/mlbfgf+10ng/mlbmp4+50ng/mlscf+10ng/mlvegf。其中，第8天先吸去100μl旧的培养基，第11天每孔再添加10ng/ml血小板生成素(thrombopoietin，tpo)。

第14天(d14)，收集类胚体(embryoidbody，eb)周围的单细胞(悬浮细胞)。用于下面的流式检测：

取收集的细胞，通过流式细胞仪检测细胞表面标记(cd34、cd45、cd41、cd42)。检测方法如下：

分为四管进行检测：第一管为阴性管，未标记任何流式抗体，第二管标记了两种抗体cd34-apc和cd45-pe；第三管标记了cd34-apc和cd41-pe；第四管标记了cd41-pe和cd42-apc。其中cd34⁺cd45⁺表示造血干细胞群体(hsc)，cd34⁺cd41⁺表示巨核祖细胞群体(mkp)，cd41⁺cd42⁺表示成熟巨核细胞群体(mk)。

流式检测结果表明，收集的细胞包含了造血干细胞、巨核祖细胞以及成熟巨核细胞。

实施例2：crispr/cas9敲除实验验证notch4基因在体外巨核分化中的作用

1.实验材料

bc1细胞系改良的可诱导表达cas9蛋白的ipscs细胞系aicas9：来自美国约翰霍普金斯大学程临钊实验室。aicas9细胞系是程临钊实验室自己建立的ipscs细胞系，将强力霉素doxycycline(dox)调控诱导的cas9基因转染入bc1细胞系，基因插入到aavs1基因座。具体制备步骤亦可参见：gonzálezf,zhuz,shizd,lellik,verman,liqv,huangfud，anicrisprplatformforrapid,multiplexable,andinduciblegenomeeditinginhumanpluripotentstemcells,cellstemcell.2014aug7；15(2):215-26.

plko慢病毒表达载体，购自addgene。

质粒提取采用无内毒素质粒中提试剂盒，购自康为试剂。

电转试剂是购自lonza公司的humanstemcellkit1。

2.实验方法

(1)plko-grna表达载体的构建

采用plko慢病毒表达载体。

根据notch4基因序列(seqidno:2)，寻找x20ngg特征序列，比对分析排除脱靶的序列，确定其中2个grna为：

notch4-grna1:1305-1327:ccctgccagaacgcccagctctg(seqidno:3)；和

notch4-grna2:2837-2859:cccaccgggcttcgagggccatg(seqidno:4)。

分别合成上述grna序列及其互补的序列，退火后连接到经bfuai酶切的plko载体上，构建plko-grna表达载体(notch4-grna1-plko和notch4-grna2-plko)，转化，铺菌板，挑克隆，测序确认。

(2)notch4完全敲除的ipsc细胞系(notch4homo)和notch4部分敲除的ipsc细胞系(notch4heter)的构建

提取前面构建的notch4-grna1-plko质粒和notch4-grna2-plko质粒。同时电转notch4-grna1-plko和notch4-grna2-plko质粒于aicas9细胞系，以提高敲除的效率。电转前一天开始添加强力霉素，诱导cas9蛋白的表达。电转后e8培养基中培养3天，培养条件是37℃，5％的co2，同时添加强力霉素。流式细胞仪分选gfp⁺单细胞至96孔板中培养，长出单克隆后，传代、扩增，冻存细胞保种，同时裂解细胞进行基因型鉴定。

在notch4-grna1和notch4-grna2切割位点的5’端和3’端设计pcr引物：

notch4-f：gaaggagcccagggtgttatg(seqidno:5)；

notch4-r：taggaagagggaccagtgatgt(seqidno:6)。

裂解细胞后，分别用f+r引物对进行pcr，对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测以及桑格法测序检测。如果f+rpcr产物有1732bp和199bp两个条带，且1732bp条带经桑格法测序鉴定为wt，199bp条带经桑格法测序鉴定在两个切割位点发生大片段删除，则该细胞克隆为notch4heterogenousipsc；如果f+rpcr产物只有199bp的条带则为homogenousipsc，并对pcr产物进行桑格法测序确认。成功建立了notch4完全敲除的ipsc细胞系以及部分敲除的ipscs细胞系。

(3)对比正常对照ipscs细胞系(aicas9)、notch4部分敲除的ipscs细胞系以及notch4完全敲除的ipscs细胞系，在体外分化成造血干祖细胞、巨核祖细胞以及成熟巨核细胞的能力。其中体外分化的操作步骤参考前面的实施例1。结果如图1a－1c所示。

(4)收集造血细胞进行流式检测，操作步骤亦参考前面的实施例1。结果如图2a－2i所示。

重复上述实验，并将得到的流式结果进行统计。结果如图3所示。

3.实验结果

如图1a－1c所示，中间黑色的球是类胚体(eb)，周围的单细胞为造血细胞。

流式检测结果如图2a－2i所示。并且如图3的统计结果所示：部分敲除(notch4heter)以及完全敲除notch4的细胞系(notch4homo)在体外生成巨核祖细胞的能力均明显比对照组强。部分敲除notch4后，巨核祖细胞形成比例比对照组提高了95％(*，p<0.05)，而完全敲除notch4后，巨核祖细胞形成比例提高了35％(*，p<0.05)。

上述结果表明，notch4基因有抑制人体外巨核分化的作用。而部分敲除notch4和完全敲除notch4后产生的造血干细胞以及成熟巨核细胞与对照组相比，亦有所升高。

实施例3：notch通路抑制剂可以促进体外干细胞的巨核细胞生成

1.实验材料

notch通路抑制剂：ro4929097、ly411575、pf-03084014、yo-01027、l-685458、dapt和fli-06，均购自selleck公司。其中，fli-06主要抑制notch运输和处理；ro4929097、ly411575、pf-03084014、yo-01027、l-685458、dapt均为γ分泌酶抑制剂。结构式如下：

notch4antibody(e-12)购自santa-cruz公司。

2.实验方法

(1)使用与实施例1相同的bc1细胞系，分为3组，每组做2个96孔板,每个孔种5000cells/50μl。参照实施例1中的步骤进行体外分化操作，其中加药步骤分别按照如下的i－iii组操作进行：

i.在分化第0天加入10μm的ro4929097,对照孔加入dmso。

ii.在分化第2天分别加入10μm或15μm的ro4929097，10μm或15μm的ly411575，5μm或10μm的l-685458，5μm或10μm的pf-03084014，10μm的yo-01027，5μm或10μm的fli-06，1μg/ml或2μg/ml的notch4抗体。

iii.在分化第2天分别加入10μm的ro4929097，10μml-685458，10μm的dapt；另外，在分化第5天分别加入10μm的ro4929097，10μml-685458，10μm的dapt。对比观察。

(2)收集细胞进行流式检测，操作步骤亦参考前面的实施例1。

3.实验结果

分别如图4、图5a－5c以及图6a－6b所示。

(1)如图4所示，第0天加入ro4929097(10μm)后，无法形成造血类胚体eb；hsc(cd34⁺cd45⁺)、mkp(cd34⁺cd41⁺)以及mk(cd41⁺cd42⁺)的比例均接近于0。

(2)如图5a－5c所示，与对照dmso组对比，第2天加入ro4929097(10μm)以后，提高巨核祖细胞mkp(cd34⁺cd41⁺)生成比例67％以及提高成熟巨核细胞mk(cd41⁺cd42⁺)生成比例64％(p<0.05)。第2天加入抑制剂l-685458(5μm)也提高了成熟巨核细胞生成比例21％(p<0.05)。而15μmro4929097在促进mkp和mk生成方面也有一定的效果，但不如10μmro4929097的作用明显。

(3)如图6a所示，在第2天加入ro4929097(10μm)，降低了造血干细胞hsc(cd34+cd45+)的比例40％，但提高巨核祖细胞mkp(cd34⁺cd41⁺)生成比例约1.4倍，提高成熟巨核细胞mk(cd41⁺cd42⁺)生成比例约2.5倍(p<0.01)；在第2天加入l-685458(10μm)，降低了hsc的比例27％(p<0.05)，但提高mkp生成比例约1.5倍(p<0.01)，提高成熟巨核细胞mk生成比例约2.3倍(p<0.001)；在第2天加入dapt(10μm)，降低了hsc的比例35％(p<0.01)，但提高mkp生成比例约1.5倍(p<0.01)，提高成熟巨核细胞mk生成比例约2.4倍(p<0.001)。并且加入抑制剂以后，形成的总的造血细胞的数量比对照组提高了近两倍。

如图6b所示，在第5天加入抑制剂，效果比第2天更好。在第5天加入ro4929097(10μm)，总体造血细胞数量没有明显改变，hsc的比例降低11％，成熟巨核细胞mk生成比例提高约2.6倍；在第5天加入l-685458(10μm)，形成的总的造血细胞的数量比对照组提高了2.3倍，hsc的生成比例提高约1.5倍，mkp生成比例提高约1.2倍，成熟巨核细胞mk生成比例提高约3.8倍；在第5天加入dapt(10μm)，总的造血细胞的数量比对照组提高了2.8倍，且hsc的生成比例提高约1.5倍，mkp生成比例提高约1.5倍，成熟巨核细胞mk生成比例提高约4.1倍。

(4)通过对比发现，10μm的dapt在体外分化d5天开始作用，促进巨核细胞生成方面效果最好，可促进巨核祖细胞生成4倍，促进成熟巨核细胞生成可接近12倍。

实施例4：notch通路抑制剂可以促进体外cd34+细胞的巨核细胞生成

1.实验材料

脐血来自正常健康的足月新生儿，通过了新生儿家长的知情同意。

ficoll-paqueplus购自gehealthcarelifesciences公司。cd34microbeadkit购自miltenyibiotec公司。

stemspan^tmsfemii购自stemcelltechnologies公司。

2.实验方法

(1)脐血中的cd34+细胞通过ficoll-paqueplus密度梯度离心以及通过cd34microbeadkit磁珠分选获得，具体步骤可参考(gehealthcarelifesciences,http://www.gelifesciences.com)，(miltenyibiotec,http://www.miltenyibiotec.com.cn)。

(2)脐血cd34+细胞向巨核细胞分化：脐血cd34+细胞计数，按1*10⁶细胞种于4mlstemspan^tmsfemii+50ng/mlscf+50ng/mltpo+50ng/mlil-6+20ng/mlil-3，种于12孔板，每孔1ml培养基，总共四个孔，分别加入10μm的ro4929097，10μml-685458，10μm的dapt，以及同体积的dmso对照，记为d0。每3天一换液，培养条件是37℃，5％的co2，培养6天后，细胞密度很高，将每孔细胞分到两个12孔板的孔，每孔2ml培养基，加入抑制剂，浓度同前。d14天收细胞，计数，通过流式细胞仪检测细胞表面标记(cd41、cd42、cd61)。

3.实验结果

如图7所示：

(1)脐血cd34+细胞向成熟巨核细胞分化(cd41+cd42+)过程中，与对照组相比，notch通路抑制剂dapt使成熟巨核细胞mk生成比例提高了4.1倍，ro4929097使成熟巨核细胞mk生成比例提高了4.5倍，l-685458使成熟巨核细胞mk生成比例提高了2.3倍；

(2)与对照组相比，notch通路抑制剂dapt使成熟巨核细胞标记cd61比例提高了2.5倍，ro4929097使成熟巨核细胞标记cd61比例提高了3.1倍，l-685458使成熟巨核细胞标记cd61比例提高了2.4倍。cd61是整合素β3，是一种细胞表面蛋白，参与细胞粘附和信号传导，cd61的比例代表了成熟巨核细胞和血小板的比例。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

sequencelisting

<110>中国科学院北京基因组研究所

<120>notch4或其抑制剂的医药用途

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