细胞外靶向药物缀合物的制作方法

本申请是国际申请日为2012年6月25日、国际专利申请号为pct/us2012/044029、中国专利申请号为201280039499.6、发明名称为“细胞外靶向药物缀合物”的分案申请。

背景

本发明提供了药物缀合物，其中靶向非na,k-atp酶的细胞外靶标的抗体或其它靶向试剂(例如靶向部分)通过接头连接至靶向na,k-atp酶的药物。这些缀合物可用于治疗疾病，也可用作评价生物系统的工具。本发明涉及生物学、化学、药物化学、医学、分子生物学和药理学的领域。

相关公开内容的描述

所有基础生物学过程(包括发育、免疫和肿瘤发生)都与不同组织和细胞类型中的基因的选择性和差异表达有关。例如，已经证实，许多恶性肿瘤的形成与某些特异性的细胞表面信号传导分子的产生和/或表达有关。现代分子医学的目标之一是，发现选择性地靶向药物以减少或消除药物的脱靶毒性效应的方式。已经研究了使用靶向部分(诸如抗体、肽或适体)将药物递送至患病细胞类型中特有的或以较高水平表达的特定靶标。还已经研究了将这些靶向部分直接地通过接头连接至药物或连接至纳米颗粒。

自1985年以来，已经集中研究了一种这样的药物靶向系统，其被称作“抗体药物缀合物”或简称为adc(参见，例如，美国专利公开号2009/0220529，通过引用并入本文)。这类靶向治疗剂的成员由对抗原特异性的抗体、在细胞内起作用的一种或多种药物和将抗体与药物连接的接头组成。尽管已经存在几个这样的例子：其中与非结合抗体连接的肽药物具有外部细胞活性，通常仅在通过来自缀合物的细胞外或细胞间药物释放而发生药物的某种程度的膜穿透的情况下才实现adc活性(美国专利号7,521,425)。

但是，近年来，已经出现了与adc技术有关的令人兴奋的新发展。在该方案中，经由不可切割的或其它稳定的接头将靶向部分(其可以是抗体)与药物连接(参见pct专利公开号2011/031870，通过引用并入本文)。该新类型的adc(被称作“细胞外靶向药物缀合物”或“edc”)包括edc，其中抗体或其它靶向部分靶向na,k-atp酶(包括α、β或γ亚基中的任一个，但是在许多实施方案中，靶向dysadherin、亚基γ5)并连接至结合na,k-atp酶的α亚基上的活性部位的药物，诸如强心苷类的一个成员。

仍然需要用于治疗疾病的新edc。本发明满足了该需要。还需要鉴别和评价na,k-atp酶和细胞表面上的细胞信号传导途径蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用的方法和试剂。本发明也满足了该需要。

技术实现要素：

本发明一般地涉及细胞外靶向药物缀合物(edc)，其包含通过不可切割的接头与治疗剂连接的靶向部分，其中所述靶向部分结合非na,k-atp酶的细胞外靶标，且其中所述治疗剂作用于na,k-atp酶。

本发明涉及下述发现：多种蛋白与na,k-atp酶相互作用以调控生化(例如细胞信号传导)途径。本发明也涉及下述发现：通过将edc靶向非na,k-atp酶的细胞外靶标(诸如与na,k-atp酶相互作用的细胞表面信号传导途径蛋白)，可以调控多种重要的细胞信号传导途径。根据本发明，提供了edc，其含有药物和靶向部分，所述药物结合na,k-atp酶(例如，在α亚基处或在na,k-atp酶上的另一个位点处，所述位点干扰或破坏na,k-atp酶和细胞表面信号传导途径蛋白之间的相互作用)，所述靶向部分靶向非na,k-atp酶的有关细胞外靶标(诸如细胞表面信号传导途径蛋白)。因而，本发明涉及na,k-atp酶的重要作用的新理解，并提供了选择性地递送调控na,k-atp酶的活性的治疗剂的新技术。因而，在一个方面，本发明提供了靶向特定细胞表面复合物(例如靶向抗原，其可以是蛋白上，其可以是受体)的edc，所述复合物含有非na,k-atp酶的细胞外靶标(诸如细胞表面信号传导途径蛋白)和na,k-atp酶。

本发明的edc也含有结合或以其它方式与na,k-atp酶相互作用的试剂。如果使用edc作为药物(这样的edc也可用作研究工具)，所述试剂可以是药物，例如治疗剂。如果使用edc进行诊断(例如，以确定特定患者是否可能对治疗做出应答，或具有顺从edc治疗的疾病或病症)或作为研究工具，所述试剂还可以是诊断剂，诸如标记的强心苷。在一个实施方案中，所述药物会与na,k-atp酶的α亚基相互作用，且缀合至这样的靶向部分：其结合与na,k-atp酶复合的蛋白(除了na,k-atp酶的α或另一个亚基以外)。因为na,k-atp酶是细胞外蛋白，不需要edc的内化，且靶向部分和治疗(或诊断)剂协同起作用以实现期望的治疗(或诊断)作用。

因而，在一个方面，本发明提供了一种edc，其中治疗剂通过稳定的(且，在某些实施方案中，不可切割的)接头与靶向部分(例如抗体)共价地连接，所述接头保持完整且是不可切割的，以使edc发挥它的最大治疗效果。edc的靶向部分(例如抗体)靶向非na,k-atp酶的且与na,k-atp酶复合的细胞外靶标，并且edc的试剂(例如药物或诊断剂)的靶标是na,k-atp酶，包括、但不限于α亚基。在某些实施方案中，所述试剂的靶标是在na,k-atp酶上的位点处，它通过该位点与非na,k-atp酶的细胞外靶标(诸如与na,k-atp酶形成复合物的细胞表面信号传导途径蛋白)结合。在这些实施方案中，所述试剂与蛋白的结合会调控(抑制或活化)蛋白与na,k-atp酶的相互作用。但是，在许多其它实施方案中，所述试剂靶向na,k-atp酶的α亚基。在许多这样的实施方案中，所述试剂是强心苷的糖苷配基。

在不同的实施方案中，靶向部分(例如抗体)的靶标位于包括na,k-atp酶的多蛋白复合物内。在不同的实施方案中，所述试剂的靶标和靶向部分的靶标是不同的，但是彼此紧密邻近(在疾病或其它目标状态)，使得edc仅在它的靶向部分和试剂同时与它们各自的靶标相互作用时发挥它的预期效应。因而，靶向部分的靶标不同于治疗(或诊断)剂的靶标，但是2种靶标紧密邻近地存在，使得靶向部分和试剂协调起作用或甚至彼此协同地起作用。因而，本发明的edc通常仅在靶向部分的靶标和试剂的靶标在所述治疗靶向的细胞、组织或器官上彼此紧密邻近时才是治疗上有效的。

在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体。在一个实施方案中，所述抗体是双抗体，其中一个fab连接至试剂，且另一个fab靶向与na,k-atp酶有关的蛋白(例如，通过与na,k-atp酶相互作用而调控生化途径)。在不同的实施方案中，所述试剂是抑制na,k-atp酶的活性的药物或其它试剂，包括、但不限于作为强心苷的糖苷配基的药物。在其它实施方案中，所述试剂是通过除了直接抑制以外的方式调控由na,k-atp酶介导的信号传导途径的药物或其它试剂，包括、但不限于药物诸如二甲基草酰基(oxallyl)甘氨酸、格列本脲、紫苏子醇、他汀类药物和黄体酮。

在一个实施方案中，本发明的edc中的接头是不可切割的接头，诸如由聚乙二醇(peg)和一个或多个糖苷构成的接头。在本发明的edc的一个实施方案中，单一试剂通过稳定的或不可切割的接头连接至单一靶向部分，且靶向部分和试剂结合它们的靶标和/或同时地或基本上同时地起作用。在不同的实施方案中，本发明提供了差别仅在于不可切割的接头的长度的edc集合。

在另一个方面，本发明提供了可用于治疗疾病的组合物，包括药物制剂和单位剂量形式和药物递送系统。在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的edc作为活性成分，或可替换地由其组成或基本上由其组成。在一个实施方案中，所述组合物是适合用于胃肠外(包括、但不限于静脉内)给药的药物制剂。在一个实施方案中，本发明提供了药物制剂，其包含与药学上可接受的媒介物、载体、稀释剂和/或赋形剂组合的本发明的edc，或可替换地由其组成或基本上由其组成。在其它实施方案中，本发明提供了组合物，其除了含有本发明的edc以外，还含有至少一种其它活性药物成分。

本发明的药物制剂可以在体内用于疾病或障碍的预防、改善和/或治愈目的。根据本发明的药物制剂可以应用的疾病或障碍的非限制性例子包括：癌症、转移灶、细胞的细胞凋亡障碍、变性疾病、组织缺血、病毒、细菌或真菌性质的感染性疾病、炎症障碍、糖尿病和病理性的新生血管生成。因而，根据本发明的方法，可以用药学有效量的根据本发明的化合物或组合物治疗受试者。在本发明的一个实施方案中，所述受试者是人受试者。在其它实施方案中，所述受试者是具有兽医或科学研究利益的非人哺乳动物。

在另一个方面，本发明提供了通过给需要治疗的患者施用治疗有效剂量的本发明的edc或其它化合物或药物组合物来治疗(或诊断或研究)疾病或其它医学病症的方法。对于要用作治疗剂的edc而言，仅当靶向部分和药物组分都结合它们各自的靶标时，edc才发挥它的最大治疗效果，且所述治疗效果源自调控细胞信号传导途径的edc，所述途径由与被edc靶向的其它蛋白(例如位于细胞表面上与na,k-atp酶复合的细胞信号传导途径蛋白)协同起作用的na,k-atp酶调控。这样的edc还可以用作诊断和/或研究工具，例如，得到的细胞信号传导途径的调控充当测定的读出。其它edc可用于诊断和研究中，包括这样的edc：其与na,k-atp酶和与其结合的蛋白形成复合物，但是不调控由所述结合调控的细胞信号传导途径。

因而，本发明的方法、化合物和组合物通常可用于医学病症的治疗(和诊断和研究)，其中施用对非na,k-atp酶的细胞外靶标特异性的治疗(或诊断)剂。在不同的实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防(和诊断和研究)障碍的方法，所述障碍选自：细胞增生和/或分化障碍、与骨代谢有关的障碍、免疫障碍、造血障碍、心血管病症、肝障碍、肾障碍、肌肉障碍、神经障碍、血液障碍、病毒感染、疼痛和代谢障碍。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的方法。

在另一个方面，本发明提供了可用于抗癌剂中且其本身可用作抗癌剂的新颖强心苷或其糖苷配基，本发明也提供了包含这些强心苷或其糖苷配基的edc，包含这些强心苷或其糖苷配基或含有它们的edc的药物组合物，和它们的制备和使用方法。

在另一个方面，本发明提供了用于制备本发明的化合物、edc和组合物的方法，以及可用于那些方法中的化合物。例如，本发明提供了可用于制备本发明的edc的药物-接头试剂。在某些实施方案中，这些药物-接头试剂包含强心苷的糖苷配基、包含peg和一个或多个糖苷的不可切割的接头、和适合用于偶联抗体的反应基团。本发明也提供了用于配制和制备生物产品、药学产品、化妆品、和农业产品的方法，和edc化合物和组合物在那些方法中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗疾病。

在另一个方面，本发明提供了在单一疗法中或与一种或多种其它治疗剂组合地(使得与任一种单独治疗剂的应用相比，所述组合起增强或放大一种或多种治疗效果的作用)使用本发明的edc治疗疾病的方法。

在另一个方面，本发明提供了用于检测na,k-atp酶与非na,k-atp酶的细胞外靶标(诸如共定位于与na,k-atp酶的复合物中的细胞表面信号传导途径蛋白)的相互作用的方法和试剂。通常，这些方法采用抗体-药物缀合物(adc)，其中所述抗体靶向目标细胞表面信号传导途径，且所述药物靶向na,k-atp酶，且二者通过稳定的或不可切割的接头连接。然后与适当的对照(抗体和药物)一起在体外和/或在体内试验该adc，以确定与单独的抗体或药物相比adc是否对一个或多个目标细胞类型发挥更有效的和/或更特异性的作用，诸如细胞毒性或细胞生长、增殖或分化的抑制。如果确定adc与单独的抗体或药物相比发挥更有效的或更特异性的作用，那么被抗体靶向的细胞外靶标(例如细胞表面蛋白)与这样的目标细胞类型中的na,k-atp酶形成复合物。

本发明的另一个方面是制品，其包含：edc；容器；和包装说明书或标签，其指示如何使用edc来治疗疾病或诊断病症或执行研究功能。

在另一个方面，本发明提供了结合非nak-atp酶的细胞外靶标的方法，所述方法包括：使表达靶标的细胞与本文中公开的edc接触。

在另一个方面，本发明提供了结合非nak-atp酶的细胞外靶标的方法，所述方法包括：给受试者施用有效地结合靶标的量的如本文中公开的edc。

在下面详细描述了本发明的这些和其它方面和实施方案。

具体实施方式

本发明提供了细胞外靶向药物缀合物或edc，其中所述试剂(药物或诊断剂)和靶向部分结合或作用于含有na,k-atp酶(由atp1家族的基因编码，包括、例如atp1a1、atp1a2、atp1a3和atp1a4基因)的复合物。edc可用于多种应用，特别是人疾病和其它医学病症的治疗。为了便利本发明的理解，将本详细描述分成多个部分。部分i提供了在本公开内容中使用的术语的定义。部分ii描述了na,k-atp酶和它在重要的细胞信号传导途径中的作用。部分iii描述了可用于本发明的edc中的抗体和其它靶向部分。部分iv描述了可用于本发明的edc中的接头。部分v描述了可用于本发明中的治疗剂。部分vi描述了本发明的edc的特定实施方案。部分vii描述了本发明的药物制剂和施用它们以治疗疾病和其它医学病症的方法。本发明的详细描述以后是一组例证本发明的有用方法和edc的实施例。

pct公开号2010/017480和2011/031870和2012年3月9日提交的pct申请号us2012/028585，以及从本文引用的科学文献得到的所有其它专利、专利申请和参考文献都特此通过引用整体并入本文。

i.定义

术语“醛标签(aldehydetag或ald-tag)”是含有源自硫酸酯酶基序的氨基酸序列的肽或肽拟似物，所述序列能够通过甲酰基甘氨酸产生酶(fge)的作用被转化或已经被转化成含有2-甲酰基甘氨酸残基(在本文中被称作“fgly”)。由fge产生的fgly残基在文献中经常被称作“甲酰基甘氨酸”，尽管这在技术上是不正确的。因而，本文中使用的“醛标签”可以表示包含“未转化的”硫酸酯酶基序(例如，硫酸酯酶基序，其中半胱氨酸或丝氨酸残基尚未被fge转化成fgly，但是能够被转化)的氨基酸序列，或表示包含“转化的”硫酸酯酶基序(例如，硫酸酯酶基序，其中半胱氨酸或丝氨酸残基已经通过fge的作用转化成fgly)的氨基酸序列。

术语“氨基酸”表示天然存在的和非天然的氨基酸、以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及非由遗传密码编码的那些氨基酸，和作为编码的氨基酸的修饰形式的那些，例如，β-丙氨酸、d-丝氨酸、羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如，与氢、羧基、氨基或构成非天然存在的氨基酸(例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)的不同r基团结合的碳。这样的类似物具有经修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的主链，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，例如β氨基酸、处于d构象的氨基酸。氨基酸模拟物表示这样的化学化合物：其具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能。

术语“抗体”表示，特异性地结合和识别抗原表位的蛋白或蛋白混合物，其包含由免疫球蛋白基因或其片段(包括由基因工程产生的其非天然存在形式)编码的一个或多个肽链。被识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因、以及众多免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，它们又分别定义了免疫球蛋白类别igg、igm、iga、igd和ige。通常，抗体的抗原结合区在结合的特异性和亲和力中是最关键的。抗体包含igg(包括igg1、igg2、igg3和igg4)、iga(包括iga1和iga2)、igd、ige或igm和igy。本文中使用的术语“抗体”意在包括完整抗体，包括单链抗体和其抗原结合片段。抗体还可以是结合抗原的抗体片段，且包括、但不限于：fab、fab'和f(ab')2、fd、单链fvs(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fvs(sdfv)、双体、三体、四体、微体和包含vl或vh结构域的片段、和纳米抗体(nanobodies)(参见pct公开号wo94/04678和naturemedicine,v9(1)第129-134页,2003)。抗体可以得自任何动物来源，包括禽类和哺乳动物。通常，在商业或研究应用中的抗体是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼科(例如，骆驼、骆马)、马或鸡抗体。本文中使用的“抗体”包括单克隆的、免疫吸附的多克隆的、嵌合的和人源化的抗体、以及完整抗体和分离的抗体。抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更大多特异性的。

术语“抗体药物缀合物”或“adc”表示，与治疗剂(在本文中有时被称作试剂、药物或活性药物成分)或试剂连接的抗体。

术语“抗原”表示，抗体或靶向部分结合的物质或靶标。抗原的特征在于，它的被抗体或靶向部分“结合”的能力。抗原还可以是指，通过用抗原免疫引起靶向部分产生(诸如抗原特异性抗体产生)的物质。在许多实施方案中，抗原是蛋白，包括、但不限于受体。

术语“抗原结合位点”或“表位”表示，靶向部分(诸如抗体)结合的抗原部分。

术语“适体”表示这样的dna、rna或寡核苷酸模拟物：其是靶向部分，且可以是抗体的功能等效物，且特异性地结合和识别抗原表位。

术语“特异性地结合”表示，靶向部分以与它对非靶标的结合相比更大的亲和力结合细胞外靶标的能力。在某些实施方案中，特异性结合表示，以比对非靶标的亲和力大至少10、50、100、250、500或1000倍的亲和力结合细胞外靶标。

术语“结合亲和力”表示，随它的结合和解离常数而变化的抗体(或其它靶向部分或药物或其它试剂)和它的抗原(或靶标)之间的相互作用的强度。较高的亲和力通常意味着，靶向部分具有快速的结合速率(结合)和缓慢的解离速率(解离)。结合亲合力可以在不同的生理条件下变化，这归因于抗原或抗体/靶向部分在那些条件下发生的变化。当连接治疗剂和/或接头时，靶向部分的结合亲合力也可以变化。当抗原发生轻微变化(诸如抗原的氨基酸序列或糖基化的变化)时，结合亲合力也可以变化。

术语“癌症”表示具有以下特征的许多疾病中的任一种：失控的异常细胞增殖，受影响的细胞局部地扩散或穿过血流和淋巴系统扩散至身体的其它部分(例如，转移)的能力，以及许多特有的结构特征和/或分子特征中的任一种。“癌性细胞”或“癌细胞”被理解为具有特定结构性质的细胞，其可以缺乏分化，且能够侵袭和转移。癌症的例子是乳房、肺、脑、骨、肝、肾、结肠和前列腺癌(参见devita,v.等人(编),2005,cancerprinciplesandpracticeofoncology,第6版,lippincottwilliams&wilkins,philadelphia,pa，其通过引用整体并入本文用于所有目的)。

术语“嵌合抗体”表示这样的抗体：其中使用重组dna技术，用得自另一个物种(通常是人)的抗体的fc区替换得自一个物种(通常是小鼠)的单克隆抗体的fc恒定区。例如，用限制性酶(其经过特别选择以除去编码fc恒定区的序列)消化编码鼠单克隆抗体的cdna，并置换编码人fc恒定区的cdna的等效部分。cdr移植抗体是这样的抗体：其中所谓的“受体”抗体的至少一个cdr被得自具有合乎需要的抗原特异性的所谓的“供体”抗体的cdr“移植物”替换。一般而言，供体和受体抗体是得自不同物种的单克隆抗体；通常，受体抗体是人抗体(以使它在人类中的抗原性最小化)，在该情况下，得到的cdr移植抗体被称作“人源化的”抗体。所述移植物可以是在单个vh或vl受体抗体内的单个cdr(或甚至单个cdr的一部分)，或者可以是在vh和vl之一或二者内的多个cdr(或其部分)。queen等人.美国专利号5,585,089、美国专利号5,693,761和美国专利号5,693,762；和winter美国专利号5,225,539(它们通过引用并入本文)教导了用于产生cdr移植抗体和人源化抗体的方法。

术语“循环结构”表示哺乳动物的体液、间隙液、淋巴液和血液，包括循环系统的组织。

术语“紧密邻近”表示在物理上靠近的2个靶标x和y，以致于例如当靶向部分(针对x)和治疗剂(针对y)通过接头缀合时，x和y结合它们各自的靶标，所述缀合物会诱导不同于且优于由单独的x或y诱导的期望生物学或医学应答。在一个实施方案中，实现的生物学或医学应答大于用单独的靶向部分或治疗剂观察到的应答。在另一个实施方案中，实现的生物学或医学应答大于通过靶向部分和治疗剂的累加效应观察到的应答。例如，当x和y位于不同的分子上、但是所述分子存在于相同的多分子复合物中时，所述靶标处于本文中定义的“紧密邻近”。在另一个实施例中，当x和y是在相同细胞上彼此相距200埃或更小埃且协同地起作用以传递信号或以其它方式产生生化应答时，所述靶标处于本文中定义的彼此“紧密邻近”。当x和y是在不同的细胞上(和/或不会彼此相互作用)时，它们没有处于本文中定义的“紧密邻近”。

术语“有效量”表示这样的edc的量：其单独地或作为药物组合物的一部分，当施用给受试者时，能够对疾病状态或病症的任何征状、方面、参数或特征具有任何可检测的积极治疗效果。这样的效果不需要是绝对有益的。

术语“表位”表示，在抗原表面处的分子(诸如氨基酸残基或糖侧链)的分型，所述分子经常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征，且能够被单克隆抗体特异性地结合。

术语“细胞外的”和“细胞表面”表示，位于细胞膜的外部部分上或位于循环结构的流体中(例如，血管紧张素转换酶是一种细胞外蛋白)的蛋白、抗原或表位。

术语“细胞外靶标”表示非na,k-atp酶的靶标，诸如位于细胞膜上或位于循环结构流体中的蛋白、神经节苷脂、抗原和/或表位。例如，但不限于，以下是细胞外靶标：细胞表面受体、细胞表面离子通道、cd(分化或命名的簇)缩短的蛋白。更具体地，且但不限于，以下是细胞外靶标：cd147、cd44、cd98、cd87、cd230、cd56、cd71、mcts、α-klotho、pe-nmt、成纤维细胞生长因子受体、mmp、c-met、atp-敏感的钾通道和谷氨酸转运蛋白。通常，本发明的edc的靶向部分和治疗剂的靶标都是在细胞膜的外表面上的细胞外靶标。但是，在某些实施方案中，所述治疗剂可以结合嵌入(例如离子通道阻滞剂)细胞膜中的靶标。不是通常认为的细胞外靶标的靶标包括，例如，染色体dna、mrna、trna、mtor激酶、dna和rna聚合酶、转录因子、微管蛋白和肌动蛋白。

术语“细胞外靶向药物缀合物”或“edc”表示本发明的药物缀合物，其中靶向细胞外靶标的抗体或其它靶向部分经由稳定的或不可切割的接头连接至结合细胞外靶标的药物或其它试剂。

术语“fxyd5”、“dysadherin”、“atp酶亚基γ5”或“γ5”在本文中可互换地使用，且表示na,k-atp酶离子泵复合物的γ亚基5。

术语“杂双功能的接头”表示，在任一个末端处具有不同反应基团的接头，其能够实现蛋白和其它分子中的2个不同官能团之间的相继缀合。

术语“完整抗体”包含通过二硫键互联的至少2个重(h)链和2个轻(l)链。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域ch1、ch2和ch3。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为lcvr^x或vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域cl。vh和vl区域可以进一步细分成被称作互补性决定区(cdr)的高变异性区域，后者中散布有被称作框架区(fr)的更保守的区域。每个vh和vl由3个cdr和4个fr组成，从氨基端至羧基端以下述次序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统(例如，效应细胞)的不同细胞和经典补体系统的第一组分(clq)。结合片段的例子包括：(i)fab片段，即由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，即包含通过铰链区的二硫键连接的2个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体的单个臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)dab片段(ward等人,nature341:544-546,1989)，其由vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(cdr)。

术语“接头”表示，共价地连接2个或更多个分子(诸如靶向部分和药物)的化学部分或键。

术语“接头间隔基团”和“间隔臂”表示，在接头中提供由该接头连接的2个分子之间的间隔的原子。

术语“修饰的抗体”表示抗体，诸如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，其已经通过例如删除、添加或置换抗体的某些部分而进行了修饰。例如，可以如下修饰抗体：删除恒定区和用意图增加抗体的半衰期(例如，血清半衰期)、稳定性或亲和力的恒定区替代它。多个治疗剂分子或多个不同的试剂可以偶联至一个抗体分子。例如，不同的部分可以经由同一个接头偶联至抗体分子，或者可以使用提供多个连接位点的多个接头(例如，树枝状聚合物)。

术语“调控”表示edc与细胞外靶标和na,k-atp酶的相互作用，从而直接地或间接地改变细胞信号传导途径，包括、例如，限制或减少(例如，抑制)或增加细胞信号传导途径的活性。

术语“单克隆抗体”表示单一分子组成的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。术语“人单克隆抗体”表示，具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)的、表现出单一结合特异性的抗体。人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化的细胞融合的、得自转基因的非人动物(例如，转基因小鼠)的b细胞，所述b细胞具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组，尽管术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”表示，源自单个克隆(包括任意真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，不论生产它的方法。使用本领域已知的多种技术，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术，可以制备单克隆抗体。

术语“不可切割的接头”表示这样的稳定接头：其在相同生理条件下具有比治疗剂或靶向部分在体内更稳定的性质。不可切割的接头的例子包括这样的含有聚乙二醇链或聚乙烯链的接头：其不是酸或碱敏感的(诸如含有腙的接头)，不是对还原剂或氧化剂敏感的(诸如含有二硫键的那些)，且不是对可能存在于细胞或循环系统中的酶敏感的。不可切割的接头的具体例子包括smcc接头(美国专利申请公开号us20090202536)。为了例证目的，可切割的接头的例子包括含有未受阻碍的谷胱甘肽敏感的二硫键、酯、对诸如组织蛋白酶或纤溶酶等肽酶敏感的肽序列、ph敏感的腙的接头[参见bioconjugatechem.,2010,21(1),第5-13页]。可切割的接头的具体例子包括未受阻碍的二硫键接头spp(us20090202536)。在不同的实施方案中，不可切割的接头具有可以通过实验容易地表征的下述性质中的一种或多种：(1)不可切割的接头保持相对完整，从而在生理条件下保持治疗剂与靶向部分连接延长的时间段(例如，至少约2-8小时、或至少1-5天、或至少5至约30天)；(2)不可切割的接头是对酶(例如在循环结构中的酶)稳定的；(3)不可切割的接头允许edc维持活性，甚至在它已经作用于细胞上的靶标以后；(4)不可切割的接头不会消极地干扰靶向部分的结合活性或特异性；和/或(5)不可切割的接头不会消极地干扰治疗剂的活性。稳定的或不可切割的接头的连接可以对治疗剂具有影响；例如，接头连接可以降低细胞毒性剂的细胞毒性(但是，在本发明的edc中，没有消除)。但是，由接头连接造成的活性的任何降低超过包含接头和试剂的edc的增加的治疗效果的偏移。因而，经由不可切割的或稳定的接头连接至靶向部分的试剂表现出胜过单独试剂的益处。这样的益处可以包括可溶性、较低的毒性、改善的药代动力学和/或增加的治疗效果。

术语“未切割的”和“不可切割的”表示，其中在任意时间点大部分(例如，>50％、>60％、>70％或>80％)存在的edc组分是完整的edc组合物，例如，用于将试剂连接至靶向部分的接头尚未被切割。

术语“非内化靶向部分”或“非内化抗体”分别表示这样的靶向部分或抗体：其具有在生理条件下(在37℃和ph7)在体内或在体外与在细胞外、在循环结构内或在细胞表面上的抗原反应(结合)的性质，且其当与它的靶抗原结合时，不会进入细胞中和变得在溶酶体中被降解(参见cancerres2009；69(6)2358-64)。在该背景下，“内化”表示物质经由溶酶体隔室进入细胞中的过程。在一个实施方案中，所述靶向部分或抗体当结合它的靶抗原时不会进入细胞中且变得在核内体中内化。“非内化靶向部分”或“非内化抗体”的靶标在本文中被称作“非内化靶标”，其为不会由于与靶向部分或抗体的结合而被内化进溶酶体中的靶标。但是，非内化靶标可以在其它生物学过程中变得内化进细胞中。非内化靶标的例子包括、但不限于：cd20、cd21和cd72。为了例证目的，“内化靶标”包括，例如，但不限于，cd79和cd22。

术语“非内化治疗剂”表示这样的治疗剂(药物)：其具有在生理条件下(在37℃和ph7)在体内或在体外反应的性质，并且它的靶标(通常，通过与它的受体结合)没有被内化进细胞中。

术语“肽”、“多肽”、肽拟似物和“蛋白”在一定程度上可互换地用于表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于：其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。这些术语也包括术语“抗体”。“肽”经常用于表示比“多肽”或“蛋白”更少的氨基酸残基的聚合物。蛋白可以含有2个或更多个多肽，其可以彼此相同或不同。

在递送的药物的量的背景下，术语“药学有效量”和“有效量”表示，可以在组织、系统、动物或人中诱导期望的生物学或医学应答的药物的量。

术语“多克隆抗体”表示超过一种(2种或更多种)不同的针对抗原的抗体的制品。这样的制品包括结合许多不同的抗原结合位点的抗体。

术语“受体”表示，嵌入细胞的质膜或细胞质中的细胞外靶蛋白分子，一种或多种特定种类的信号传导分子可以与其结合。每个细胞通常具有属于许多不同种类的许多受体。

术语“在循环结构中稳定的”表示化合物(诸如edc)耐受降解的性质，且意味着，例如，在循环血液中在约37℃在至少约2小时内小于约50％、或小于约20％、或通常小于约2％的化合物被降解或切割。

术语“稳定的接头”表示这样的接头：在缀合物已经被递送或运输至靶位(稳定接头保持与它所连接的2个分子共价地连接)之前，所述接头在生理条件下(在37℃和ph7)在体内或体外保持稳定和完整足以允许edc到达靶标和与靶标结合的时间段。因而，稳定接头在循环结构内通常是稳定的(通常意味着在至少2小时时段以后，和在某些实施方案中，至少4、8、16或24小时时段以后，低于5％降解)。稳定接头可以被细胞、组织或器官内的酶或生理条件(诸如不同的ph)切割。“稳定”接头的例子包括不可切割的接头，但是稳定接头可以是可切割的，只要在edc到达和结合它的靶标之前它们通常不会在体内被切割即可。例如，稳定接头可以含有受阻碍的谷胱甘肽敏感的二硫键、对诸如组织蛋白酶等肽酶敏感的肽序列、或ph敏感的腙[参见bioconjugatechem.,2010,21(1)，第5-13页和clin.cancerres.200511(2pt1):843-52]。因而，稳定接头可以是可切割的接头，但是在含有这样的接头的edc到达它的靶标之前所述接头未被切割。例如，组织蛋白酶可切割的接头是稳定接头，因为组织蛋白酶仅存在于细胞内的溶酶体中。不稳定接头的例子是含有酯键或酰基腙键的接头。

术语“基本上同时地”表示，在同时或在相对狭窄的时间范围内发生的2个或更多个事件。在不同的实施方案中，基本上同时地表示彼此在约60、约40秒、约30秒、约20秒、约10秒、约5秒、约2秒或约1秒内或小于约1秒内发生的2个或更多个事件。例如，本发明的edc具有使得靶向部分结合和试剂(药物)作用基本上同时发生的性质。

术语“协同地”表示，当联合使用时2种或更多种试剂的作用大于两种试剂当单独使用时的作用的总和。例如，在本发明的edc中，当通过接头连接时，靶向部分和试剂(药物)的相互作用的组合治疗效果大于靶向部分和试剂当单独使用时组合的单独作用。“作用”可以表示结合、治疗效果和/或特异性。

术语“靶标”表示，靶向部分所结合的蛋白、糖蛋白、抗原、碳水化合物或核酸，也表示治疗剂所结合的蛋白、糖蛋白、抗原、碳水化合物或核酸。试剂和靶向部分可以结合“靶标复合物”中的不同靶标，其中“靶标复合物”表示，在体内彼此物理上紧密靠近的2个或更多个分子，诸如多亚基蛋白的不同亚基或多蛋白复合物中的2个不同蛋白。

术语“靶细胞”表示这样的细胞：其涉入病理学且因此是治疗活性的优选靶标。靶细胞可以是，例如，但不限于，下述组的细胞中的一种或多种：原代或继发肿瘤细胞(转移灶)、原代或继发肿瘤的间质细胞、肿瘤或肿瘤转移灶的新生血管形成性内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、多形核白细胞和淋巴细胞、以及浸润肿瘤和肿瘤转移灶的多核试剂。

可互换的术语“靶向部分”和“靶向试剂”表示，特异性地结合靶标的抗体、适体、肽或其它物质。靶向部分可以是抗体靶向部分(例如抗体或其片段)或非抗体靶向部分(例如适体、肽或特异性地结合靶标的其它物质)。

术语“靶组织”表示靶细胞(例如，肿瘤细胞)和在靶细胞环境中的细胞。

术语“治疗剂”和“药物”和“试剂”在本文中互换地用于表示这样的化合物：其当以治疗有效量存在时，在结合作用部位后，会产生治疗效果，且其作用部位位于或其作用将施加于表面或靶细胞内。作为例子，治疗剂可以是化学试剂，诸如抗生素或抗癌剂、多肽、蛋白或核酸。

术语“治疗效果”表示受试者中的疾病、疾病的征状、或疾病的副作用的减少、消除和/或预防。

术语“增加半衰期”是指，与参考化合物相比，增加化合物(通常是治疗剂)在血液中的平均停留时间，或降低血液或血浆清除率。

术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”互换地用于表示，将治疗剂或组合物施用给具有疾病或障碍(例如，癌症或转移性癌症)、疾病或障碍的征状、或朝向疾病或障碍的倾向的患者，其目的是治愈、愈合、缓解、减轻、改变、补救、改善、改良或影响疾病或障碍、疾病或障碍的征状、或朝向疾病的倾向。癌症或转移性癌症的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”表示治疗或改善或预防癌症，包括任何客观或主观参数，诸如缓解；减轻；征状减少或使患者更耐受疾病状况；减慢变性或衰退的速率；或使最终的变性点不太虚弱。征状的治疗或改善可以基于客观或主观参数，包括医师的检查结果。因此，术语“治疗”包括施用治疗剂以预防或延迟、减轻或阻止或抑制与疾病(包括、但不限于肿瘤疾病)有关的征状或病症的发展。

术语“肿瘤特异性的抗原”表示这样的蛋白或其它分子：其为肿瘤特有的，或至少与正常细胞相比在肿瘤细胞上更丰富。

ii.na,k-atp酶和细胞信号传导途径

na,k-atp酶作为离子通道和信号转导蛋白起作用。na,k-atp酶是完整跨膜蛋白酶，其最初仅被认为靠浓度梯度输入钾离子和输出钠离子，但是最近已经证实其也跨细胞膜传递信号。该酶由3个亚基组成：α亚基，其是催化核心和甾体类化合物的主要靶标；β亚基，其被认为将α亚基运输至特定细胞表面位置且是α亚基活性所必需的；和γ亚基，其是辅助亚基，且其存在于多种细胞类型特异性的同种型中。心脏(作用于心脏的)糖苷与na,k-atp酶的主要结合位点位于由跨膜螺旋m1、m2、m4、m5和m6形成的腔中[proc.natl.acad.sci.,2009,106,13742-13747]。

已经报道，强心苷与na,k-atp酶的结合会触发针对多种不同疾病的许多活性。例如，已经报道该结合事件会抑制hif-1α合成、白介素8(il-8)生产和缺氧诱导因子nf-kb，以及具有与慢性心脏和肾功能衰竭、心脏肥大和心律失常、动脉粥样硬化、糖尿病、神经学疾病和癌症的发病机制和治疗有关的活性[currentmedicinalchemistry,2011,18,872-885]。除了目前批准的强心苷用途(例如心房颤动、心房扑动和心力衰竭)以外，许多强心苷和含有强心苷的提取物已经或者当前正在针对诸如囊性纤维化、癌症、血压和类风湿性关节炎等适应症的临床试验测试中[各自的http://clinicaltrials.gov/命名：nct00782288,nct00837239,nct00852787,nct01355354]。

靶向药物(包括甾体类药物)在疾病的治疗中具有益处。例如，在得自具有许多炎症性肺疾病(包括急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病和哮喘)的患者的临床样品中通常检测出il-8(一种有效的嗜中性粒细胞招募和活化因子)。这已经导致临床医师认为，il-8的拮抗作用可能是疾病控制的可行治疗策略[americanjrespiratorymedicine.1(1),19-25(2002)]。具体地，在囊性纤维化的情况下，表征该疾病的深肺部炎症主要归因于il-8在肺中的过度产生。已经证实强心苷na,k-atp酶结合会通过调控il-8受体(通过改变膜流动性和微粘度)而抑制不同细胞类型中il-8介导的生物应答[j.cellphysiol.207,195–207(2006)]。另外，低浓度的强心苷会触发下游信号传导级联，后者阻止细胞死亡和诱导增殖，它们在缺血性中风的背景下是相关的[proc.natlacad.sci.usa103,10461-10466(2006)]。还已经在与神经变性疾病(诸如脊髓延髓肌萎缩和其它聚谷氨酰胺相关的疾病)有关的细胞信号传导途径的背景下研究了该结合事件[hum.mol.genet.13,437-446(2004)]。

但是，使用na,k-atp酶导向的治疗剂存在一些重大担忧。首先，na,k-atp酶存在于所有细胞上，且靶向它们的药物具有引起宽范围的生物学过程的潜力。例如，升高的内源糖苷水平与高血压和血压升高有关[proc.natl.acad.sci.usa102,15723-15724(2005)和proc.natlacad.sci.usa102,15845-15850(2005)]。其次，在表现出抗癌效力所需的水平，迄今为止试验的大多数靶向na,k-atp酶的药物已经被证实过高的毒性。该毒性可以包括心脏毒性和/或神经中毒。第三，强心苷的治疗窗较小。实际上，被批准的强心苷(例如地高辛或海葱次苷)可以造成比被批准施用的水平高2-3倍的患者死亡。anesthprog.2007spring；54(1):19–24。这些担忧极大地限制了作用于na,k-atp酶的药物的应用。

另外，难以解释以前报道的作用于na,k-atp酶的药物的效应。例如，尽管已经提出，na,k-atp酶可以调节胆固醇[thejournalofbiologicalchemistry,2009,284,14881-14890]、与klotho(一种在老化过程中涉及的跨膜蛋白)相互作用[febslett.2011jun23；585(12):1759-64]、与正甲基转移酶形成复合物[bmcstructbiol.2010年5月25日；10:12]和与cd147结合[thejournalofneuroscience,2007,27(45):12331-12340]，但是这些相互作用的原因和结果没有被理解，且尚未被开发用于治疗或其它有用的目的。

本发明部分地源自下述发现：na,k-atp酶会与其它细胞表面蛋白紧密结合(形成复合物)并与它们协同作用以调控细胞信号传导途径，并且靶向这样的复合物的edc具有惊人的治疗活性，特别是在癌症的治疗中。本发明的edc如下克服了与靶向na,k-atp酶的药物有关的先前问题：确保所述药物仅作用于与edc的靶向部分的靶标形成复合物的na,k-atp酶，而不作用于所有na,k-atp酶。该惊人成就源自这样的靶向部分的应用：所述靶向部分引导作用于na,k-atp酶的药物仅作用于与靶向部分的特定靶标(在调控目标细胞信号传导途径中涉及的细胞表面蛋白)结合的na,k-atp酶。在以下部分中描述了在本发明的edc中有用的靶向部分。

iii.抗体和其它靶向部分

本发明提供了edc，其包含通过稳定的或不可切割的接头(例如，其必须为完整的或未切割的接头，使得edc发挥它的最大治疗效果)与治疗剂连接的靶向部分。这些edc作用于na,k-atp酶和与所述na,k-atp酶结合的蛋白的复合物。本发明的edc更选择性地将治疗剂递送至靶细胞和组织。在许多实施方案中，所述edc含有靶向部分，其结合(例如，特异性地结合)非na,k-atp酶的细胞外靶标，且其与na,k-atp酶结合以调控细胞信号传导途径，且含有结合经由稳定的或不可切割的接头与靶向部分连接的na,k-atp酶(或结合阻断与na,k-atp酶的相互作用的蛋白结合位点)的试剂。因而，在大多数实施方案中，靶向部分和治疗剂结合或作用于不同的细胞外靶标，例如，所述靶向部分靶向与na,k-atp酶结合的细胞外靶标，且所述试剂靶向na,k-atp酶。在许多实施方案中，所述靶向部分结合与调控细胞信号传导途径的na,k-atp酶紧密邻近的靶标，例如，它是位于细胞表面上的信号传导途径蛋白，且所述治疗(或诊断)剂作用于或结合na,k-atp酶。

本发明的edc的靶向部分将edc导向含有靶向部分的靶标和治疗剂的靶标(例如，在许多实施方案中，na,k-atp酶)的靶细胞或组织。因而，在某些实施方案中，所述治疗剂不仅产生期望的治疗效果，而且增强edc的靶向性质。在某些实施方案中，所述靶向部分和所述试剂协同地起作用将edc导向一个或多个靶标。在某些实施方案中，所述靶向部分也具有治疗效果。在所有实施方案中，稳定的或不可切割的接头在生理条件下维持靶向部分与治疗剂的连接足以使edc结合和发挥治疗效果的时间段。

本发明的edc的3个部分因而可以包含以下部分、基本上由其组成或由其组成：(1)靶向部分，其结合非na,k-atp酶的细胞外靶标，且其与疾病或其它目标病症中的na,k-atp酶结合和紧密邻近；(2)稳定的或不可切割的接头，其将所述靶向部分连接至治疗剂且在edc结合它的靶标所需的时间内保持完整(不可切割)；和(3)治疗(或诊断)剂，其作用于或结合na,k-atp酶(或结合控制与na,k-atp酶的结合的有关蛋白上的位点)。

在本发明的edc的许多实施方案中。所述靶向部分是人抗体，其在靶标结合以后不会诱导内化，且因而在结合它的细胞外靶标以后不会被内化进溶酶体中。

已经做出大量努力来利用抗体将高毒性的净荷负载至被感染的细胞或癌细胞，以将药物携带至细胞内部和释放药物，从而象前药一样起作用。“抗体-药物缀合物”或“adc”方案是一个这样的例子。利用抗体的药代动力学或动力学的其它努力已经导致具有差药物性质(例如短血清半衰期或降解)的药物与抗体的连接。在该后一种情况下，所述药物的活性不需要抗体释放，且所述抗体不将药物靶向特定抗原。在某些情况下，将治疗剂缀合至抗体的靶结合位点，从而消除抗体的靶标结合能力。

与adc方案有关的第一个困难是必须处理细胞穿透。为了产生治疗效果，完整的adc或至少adc的药物部分必须进入靶细胞。使完整adc进入细胞的方案包括：靶向会内化adc的受体，或使用肽介导的膜穿透将抗体递送至它们的细胞内靶蛋白(参见美国专利申请公开号us20080063633)。已经发现在抗体结合以后在一个细胞类型中变得内化的许多这样的受体不可在另一个细胞类型中内化，从而限制了该方案的通用性[参见cancerres2009；69(6):2358-64]。另外，如下面讨论的，内化通常意图从抗体释放试剂。该释放然后允许游离药物运输出细胞和与在患病细胞附近的正常细胞相互作用，从而产生不希望的毒性。该现象被称作“旁观者效应”。另外，内化必须继之以药物-抗体分离(它是一个低效的过程)，因而adc的药物部分需要极端毒性的药物(carter等人2008thecancerjournal14(3)154-169)。本发明的edc不需要内化且通常不会被内化，这会减轻与adc方案有关的许多问题。

与adc方案有关的第二个困难是，在进入细胞以活化药物或者允许它进入细胞中之前或之后，adc的药物必须从抗体释放。允许选择性释放的方案已经包括：掺入被细胞特异性的肽酶切割(参见美国专利申请公开号us20090220529)或含有环境敏感键的特定肽序列，使得释放或活化发生在细胞膜附近、在细胞膜内、或在细胞胞质溶胶或胞内体隔室内。已经发现某些细胞类型会将adc内化进隔室中，所述隔室不会释放活性形式的药物，从而限制特定adc的范围[cancerres2009；69(6):2358-64]。本发明的edc不要求edc的药物从靶向部分释放，这会减轻与要求药物-抗体分离的adc方案有关的许多问题。

与adc方案有关的第三个困难是，adc是前药，因此adc的药物部分当进入靶细胞或者与靶细胞发生紧密邻近时必须被活化。为了确保治疗剂从抗体的释放或adc的试剂部分的活化不会发生在adc与它们的靶标的相互作用之前(否则会导致增加的毒性)，该要求是重要的。为了维持adc的效力(当未结合它的靶细胞时)和为了保持未缀合的抗体掩蔽得自活性adc的靶位，保持药物与抗体缀合也是重要的。关于adc方案的大多数出版物讨论了解决这些问题的方法。本发明的edc不要求活化即可是有效的(它们不是前药)，这会减轻与要求药物-抗体分离(药物活化)的adc方案有关的许多问题。

与adc方案有关的第四个困难是，因为所述试剂当被内化进靶细胞中时从靶向部分释放，所述试剂能够从它的来源母体缓慢地扩散出细胞，并在邻近的抗原阴性细胞上诱导强烈的旁观者活性。因此，adc的游离试剂变得对靶细胞附近的其它正常的(脱靶)细胞有毒，该现象被称作旁观者效应。这会限制可以施用adc的剂量。本发明的edc不要求试剂(药物)从edc释放即为有效的，这会减轻与旁观者效应有关的问题和增加特异性。

与adc方案有关的第五个困难是缺乏特异性：抗体和试剂之一(而不是二者)可能对细胞外靶标是特异性的。因此，得到的adc的特异性可能不符合需要。adc仅象抗体的靶标一样具有特异性。许多抗体不可用于制备安全的和有效的adc，因为抗体的靶标也以足够高的水平存在于正常细胞上。本发明的edc需要2种不同的靶标进行结合，并且这些靶标需要紧密邻近，这不太经常地发生，从而使edc更特异性。

与以前的方案不同，本发明提供了高度特异性的edc，其不需要细胞的内化，不会对接头产生技术上困难的约束，且是更特异性的，减少旁观者效应，和通过将试剂定位在它的靶位附近而增加治疗剂的活性。因此，本发明的edc不要求靶向部分促进内化，且不依赖于抗体的非靶向生物学特性。本发明的edc可以利用除了抗体以外的靶向部分，包括、但不限于适体。本发明的edc要求，所述试剂和所述抗体保持完整才具有最大特异性和活性。因为本发明的抗体或靶向部分靶向细胞外抗原，且对于效力而言不需要内化，不需要溶酶体酶促降解。因为在本发明的edc中使用的接头是稳定的或甚至不可切割的，药物从edc的过早释放会被最小化，且接头设计是更灵活的和复杂性更低的。因为本发明的接头和治疗剂可以连接至与na,k-atp酶紧密邻近的多种不同靶标的靶向部分，新edc的构建的复杂性更低。

本发明的edc具有比它们所含的药物更高的选择性和/或更低的毒性。在本发明的edc中，在靶向部分结合它的靶标之前，靶向部分和/或接头可以有效地阻止或急剧地减少药物的治疗(和从而减少毒性的、脱靶)效应。鉴于下述发现，这是本发明的一个特别重要的方面：na,k-atp酶会与无数的其它信号传导蛋白相互作用，从而产生显著的不希望的“脱靶”效应的潜力。因而，本发明的edc主要仅在下述情况下是有活性的：当靶向部分结合它的靶标且与治疗剂的靶标紧密邻近时，和当edc是完整的时。总之，这些特征会实现更特异性的和更低毒性的edc，因为仅当抗体结合它的靶标时作用于na,k-atp酶的潜力是显著较高的。本发明的edc是更选择性的，因为试剂和抗体靶位需要存在且彼此紧密邻近，使得edc发挥治疗效果。本发明的edc是更少毒性的，因为所述试剂通过稳定接头连接至会选择性地结合它的靶标的靶向部分，从而保持所述试剂紧密邻近且因而仅能够作用于紧密邻近的na,k-atp酶。因而，当靶向部分未结合它的靶标时和当na,k-atp酶未与靶向部分的靶标紧密邻近时，本发明的edc是在很大程度上无活性的。因而，当靶向部分结合它的靶标但是靶向部分的靶标没有与na,k-atp酶紧密邻近时，本发明的edc也在很大程度上是无活性的。实际上，所述接头会阻止药物到达na,k-atp酶，除非它与靶向部分的靶标紧密邻近。

本发明靶抗原的靶向部分与na,k-atp酶结合以调控细胞信号传导途径。考虑到本公开内容，本领域技术人员现在会明白，存在众多已知与na,k-atp酶结合的抗体可接近的细胞外抗原。这些中的许多是疾病细胞选择性的。这些抗原中的许多存在于细胞表面上。许多经批准的药物作用于细胞表面上的细胞外靶标。这样的靶标(其可以通过本发明用作治疗剂的靶向部分(例如抗体)的靶标)的示例性例子包括：cd147(basigin)、cd44(hcell)、cd98(lat1)、cd87(upar)、cd230(prp或朊病毒相关的蛋白)、cd56(ncam)、c-met、rank(nf-kb的受体活化因子)、cd71(tfr1)、cd166、eaats、epcam、fgfr(成纤维细胞生长因子受体)、血管紧张素受体、asct2、calveolin、整联蛋白家族的蛋白、gabaa受体、glur2、5-ht1a受体、igf-1、insp3r、胰岛素受体、α-klotho、mct1-4、mtnfα(跨膜)、opg/rankl、pe-nmt(n-甲基转移酶)、pla2(pc-磷脂酶a2)、rs1(视网膜劈裂蛋白)、sel-1,5-羟色胺转运蛋白、t-细胞受体和tlr4。

在本发明的edc中有用的靶向部分的一个例子是，特异性地识别和结合cd147的靶向部分。cd147是在胚胎发育、视网膜功能和t-细胞成熟中起作用的多效分子。已经证实它为亲环蛋白的细胞-表面受体。它在组织重塑区域中表达：肿瘤、子宫内膜、胎盘、皮肤和发生血管生成的区域(参见iacono等人.2007.expmol.path.83:283-295)，并刺激基质金属蛋白酶(mmp)和vegf产生。cd147在单核细胞分化后受到诱导，且在人粥样斑中表达(majortc,liangl,lux,roseburyw,bocantm.2002.arteriosclerthrombvascbiol.22:1200-1207)。已经证实，cd147会通过肿瘤旁间质细胞对mmp和尿激酶型纤溶酶原活化剂系统的诱导而促进不同肿瘤类型的侵袭和转移。cd147也涉入血管生成、失巢凋亡抗性、乳酸盐流出、多药抗药性、和癌细胞中的细胞增殖。cd147过表达和/或功能已经与其它病理过程相关联，诸如炎症应答、肺纤维化、类风湿性关节炎、红斑狼疮、心力衰竭、阿尔茨海默氏病、以及人免疫缺陷病毒和冠状病毒在淋巴细胞中的侵染性循环(参见ruiz等人,j.biol.chem.,第283卷,(9),5554-5566,2008)。另外，cd147的切割和cd147片段的脱落可能涉入cd147调节或活性片段的释放(egawa等人.2006jbiolchem281(49):37576-85)。

已经报道了抗-cd147抗体。在类固醇难治的急性移植物抗宿主病中试验了鼠抗体igmmab、cbl1(billings等人.hybridoma1:303-311,1982,美国专利号5,330,896和5,643,740)(heslop等人.thelancet346:805-806；deeg等人.2001blood98:2052-8)。还开发了人等效mab，其结合与cbl1(akaabx-cbl)重叠的表位，在ecd的跨膜结构域附近(us2007048305a1)。koch等人(internatimmunol11(5)777-786,1999)描绘了与t-和b-细胞活化有关的cd147表位，报道称针对cd147制备的一组抗体中仅最高亲和力单克隆抗体(mem-m6/6)可有效地预防抗cd3的mab(okt3)对人t-细胞的活化和增殖。抗肿瘤细胞衍生的人cd147的鼠抗体eiif4(ellis,1989cancerres49:3385-91；biswas等人.cancerresearch55,434-439,1995)表现出阻断得自人成纤维细胞的肺癌cd147诱导的胶原酶(基质金属蛋白酶-1或mmp-1)活性的能力。证实了eiif4抗体与cd147的结合在制备缺失n-端ig结构域的突变体ecd时被消除(biswas,c.等人,cancerres55,434-439,1995)。ku等人(scanjimmunol65(5)435-443,2007)鉴别出了被描述为cd147有关的mmp轴的抑制剂的mab，并且通过使用截短的cd147序列，鉴别出了在n-端处对于cd147mmp诱导活性而言的关键残基。

因而，尽管已知cd147的某些抗体和其它拮抗剂，但是尚未彻底阐明包括2个免疫球蛋白结构域的蛋白的复杂性质如何影响众多生物活性。结构域特异性的拮抗剂可以证实是用于治疗各种与cd147在不同组织上的展示和/或活化有关的病理学的有用治疗候选物。例如，能够阻断由cd147诱导的生产mmp或vegf活性的治疗剂在癌症治疗中可以是有利的。因此，需要提供靶向人cd147的治疗剂用于治疗中以减少或消除cd147依赖性疾病的征状、以及胜过已知抗体或其片段的改善。

在一个实施方案中，所述edc的靶向部分是特异性地结合bsg基因在人类中编码的cd147和/或emmprin(细胞外基质金属蛋白酶诱导物；参见美国专利申请公开号us20070048305和us20060104974和pct公开号2010/036460)的细胞外结构域的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合emmprin的细胞外结构域并抑制过表达emmprin的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体可以是，例如，人源化形式的抗-cd147。在一个实施方案中，所述人源化抗体可以是abx-cbl(鼠免疫球蛋白m(igm)单克隆抗体，其识别在细胞表面上的cd147)。在一个实施方案中，所述抗体可以是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合cd147。

实施例2(也参见实施例8)描述了靶向cd147的本发明的不同示例性的edc。下面的实施例中的数据表明，对cd147特异性的抗体可以用于生产本发明的edc。数据表明，如在实施例2中所述制备的每种edc比在它们的表面上表达cd147的细胞系上的对照更有活性。确定了edc2.1平均具有1.2个药物/抗体，而含有对cd147特异性的靶向部分的其它edc平均含有5.9-8.6个药物/抗体。edc2.1的活性是试验的4种edc中最低活性的。除了edc2.1以外，实施例2的所有edc表现出亚纳摩尔活性，而阴性对照(含有平均7.4个药物/抗体的抗体-药物缀合物)对试验的所有细胞系表现出高纳摩尔活性。试验的癌细胞包括大细胞肺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、小细胞肺癌、黑素瘤和骨髓瘤。

可用于制备本发明的edc的靶向部分的另一个例子是，特异性地识别和结合cd44的靶向部分。cd44是由4个功能结构域组成的单链糖蛋白：保守的n端细胞外结构域、非保守的膜近端区域、保守的跨膜结构域和保守的细胞质尾巴。cd44的分子量范围是80-90kda，且可以通过差别选择性剪接产生接近800种变体异形体(cichy,j.等人,(2003)journalofcellbiology,161:5,839-843)。cd44的最常见的异形体(其被命名为标准cd44(cd44s))由9个标准外显子编码，且具有大约90kda的分子量(spring等人.1988immunology64(1):37–43)。cd44的变体形式(cd44v)含有额外外显子，其被称作变体外显子(在人类中为v2-v10)，其产生在蛋白的细胞外和膜近端区域中的额外蛋白序列。癌症会表达cd44的变体异形体。cd44在许多细胞类型(包括白细胞、成纤维细胞、上皮细胞、角质形成细胞和一些内皮细胞)上普遍存在地表达，其中cd44s是最丰富地表达的异形体。

已知cd44参与多种细胞功能，包括细胞-细胞聚集、细胞外周基质的保留、基质-细胞和细胞-基质信号传导、受体介导的透明质烷内化/降解和细胞迁移。cd44的各种功能取决于与透明质烷的粘连相互作用。cd44是糖氨基聚糖透明质烷(ha)的细胞表面糖蛋白受体。造血细胞e-选择蛋白/l-选择蛋白配体(hcell)是含有heca-452反应性的唾液酸化的、岩藻糖基化的n-聚糖的cd44糖型。hcell是l-选择蛋白和e-选择蛋白的配体(dimitroff等人.proc.natl.acad.sci.usa,97(25):13841-46,2000；dimitroff等人,j.cellbiol.,153(6):1277-1286,2001)。一些cd44功能受cd44蛋白中的翻译后修饰(诸如硫酸化和/或糖基化)影响或诱导。已经制备了以高亲和力和特异性结合人cd44的特定变体的抗-cd44抗体(美国专利申请公开号us20050214283)。cd44糖蛋白的变体会给肿瘤赋予转移性质，而标准的cd44不会。因而，cd44的变体给肿瘤赋予通过淋巴隙转移的能力(gunthert等人,cell65:13-24,1991)。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合cd44基因在人类中编码的cd44分子(印度血型)的抗体或其它靶向部分(参见美国专利号5,916,561和美国专利申请公开号us20030103985)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合cd44分子的变体的抗体或其它靶向部分(wang等人.2009laryngoscope119(8):1518–30和griffith等人.2010fertil.steril.93(6):1745–9)。在一个实施方案中，本发明的edc中的靶向部分是特异性地结合标准形式的cd44分子的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合cd44的细胞外结构域并抑制过表达cd44的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体可以是比伐珠单抗(针对cd44v6的人源化单克隆抗体)。在一个实施方案中，所述抗体可以是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合cd44。在一个实施方案中，本发明涉及针对由变体外显子v4、v5、v6和/或v9或其部分编码的表位的抗体的用途。

实施例3(也参见实施例8)描述了靶向cd44的本发明的不同示例性edc。实施例中的数据表明，对cd44特异性的抗体可以用于制备本发明的edc，后者比在它们的表面上表达cd44的细胞系上的对照缀合物更有活性。确定了edc3.1平均具有5.5个药物/抗体，而edc3.2平均含有2.7个药物/抗体。cd44特异性的edc3.1对非小细胞肺癌和胰腺癌细胞最有活性。两种edc表现出比对照缀合物(含有平均7.4个药物/抗体)更好的活性。试验的癌细胞包括结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌和小细胞肺癌。

可用于制备本发明的edc的靶向部分的另一个例子是这样的靶向部分：其特异性地识别和结合cd98(4f2hc)、它的异源二聚体配偶体或它们形成的复合物(例如lat1、lat2、glut1)。cd98是由529个氨基酸残基组成的约80kda的ii型跨膜糖蛋白链，已知其在不同类型的癌细胞中高度表达。还发现cd98会与不同的营养物转运蛋白(如lat1、lat2和葡萄糖转运蛋白1(glut1))形成复合物(ohno等人.amjphysiolcellphysiol300:c1047–c1054,2011)。已知被认为结合cd98的6类氨基酸转运蛋白。尽管cd98被鉴别为淋巴细胞活化抗原，认为它参与大量生物学功能，诸如细胞生长信号传导、整联蛋白活化、细胞融合等(haynes等人,j.immunol.,(1981),126,1409-1414,lindsten等人,mol.cellbiol.,(1988),8,3820-3826,teixeira等人,eur.j.biochem.,(1991),202,819-826,diazjr.等人,jbiolregulhomeostagents,(1998)12,25-32)。

lat1/cd98异源二聚体复合物参与大型中性必需氨基酸穿过质膜的运输的主要途径，且在许多癌症中过表达。lat1是具有氨基酸转运蛋白活性(经由二硫键)的约40kda蛋白，且在细胞膜上表达。癌细胞具有多种机制以确保生长优势。例如，癌细胞过表达中性氨基酸转运蛋白以胜过周围细胞优先摄取生长所需的必需氨基酸。已经克隆了l-型氨基酸转运蛋白1(lat1)，即在癌细胞中特异性地和高度地表达的氨基酸转运蛋白(kanai等人,j.biol.chem.(1998),273,23629-23632)。lat1会与cd98形成复合物和以独立于钠离子的方式运输具有大侧链的中性氨基酸，诸如亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸等。另外，已知的是，lat1在除了脑、胎盘、骨髓和睾丸以外的大多数正常组织中较差表达或不表达，但是它在人恶性肿瘤(诸如结直肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、喉头癌、食管癌、肺癌等)的组织中的表达与cd98一起增加(yanagida等人,biochem.biophys.acta,(2001),1514,291-302)。已经报道，当减少lat1的表达以抑制氨基酸摄取时，在移植了癌症的小鼠模型中的肿瘤生长受到抑制(日本专利公开号2000-157286)，且因而lat1活性的抑制被视作癌症治疗的有前途的方案。已经证实了当在癌细胞的细胞膜上表达时对cd98具有特异性结合能力的人抗体(或人抗体的功能片段)(美国专利7,943,745)。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合cd98的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合lat1的细胞外结构域并抑制过表达lat1的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是结合lat2的抗体。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是结合glut1的抗体。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体可以是，例如，人源化形式的抗-cd98。在一个实施方案中，本发明的edc构建自在美国专利7,943,745中公开的人源化抗体重链和轻链可变序列，且其识别在细胞表面上的cd98。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合cd98。

实施例4(也参见实施例8)描述了靶向cd98的本发明的一种示例性edc。实施例中的数据表明，对cd98特异性的抗体可以用于生产本发明的edc，后者比在它们的表面上表达cd98的细胞系上的对照缀合物更有活性。确定了edc4.1平均具有3.4个药物/抗体。cd98特异性的edc对非小细胞肺癌细胞最有活性。试验的癌细胞包括非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、小细胞肺癌和骨髓瘤。

可用于制备本发明的edc的靶向部分的另一个例子是这样的靶向部分：其特异性地识别和结合cd87。cd87是尿激酶纤溶酶原活化剂(upa)的广泛表达的受体，且在细胞-表面纤溶酶原活化的调节中起关键作用。越来越多的证据表明，cd87参与不同的生理和病理过程的调节，包括细胞粘附、细胞能动性、血管生成、肿瘤侵袭和肿瘤转移(yimin和elghetany,laboratoryhematology,2003,9:67-71)。纯化的人cd87是一种单链的、高度糖基化的、细胞外蛋白，其具有50-60kd的异质分子质量。尿激酶纤溶酶原活化剂系统包含丝氨酸蛋白酶尿激酶(upa)、尿激酶细胞表面受体(upar或cd87)和纤溶酶原活化剂抑制剂-1(pai-1)。尿激酶纤溶酶原活化剂系统是负责许多实体瘤的新生血管形成、侵袭和转移的因素之一(dano等人,adv.cancerres.,1985,44:139-266)。upar在肿瘤细胞和血管生成性内皮细胞对细胞外基质的受调节的降解和重塑中起重要作用(图1)。upa-upar依赖性的级联也会导致前基质金属蛋白酶-9的活化以及生长因子和血管生成性因子(包括hgf、vegf和tgfβ)的活化和释放。

upar通常不以可检测的水平在静止细胞上表达，且因此在启动系统的活性之前必须被增量调节。upar表达在体外受以下因素刺激：诸如佛波醇酯等试剂(lund等人,j.biol.chem.1991,266:5177-5181)，上皮细胞和多种生长因子和细胞因子诸如vegf、bfgf、hgf、il-1、tnfα(在内皮细胞中)和gm-csf(在巨噬细胞中)的转化(mignatti等人,j.cellbiol.1991,113:1193-1201；mandriota等人,j.biol.chem.270:9709-9716；yoshida等人,inflammation1996,20:319-326)。upar表达具有增加细胞能动性、侵袭和附着力的功能后果(mandriota等人,出处同上)。更重要的是，upar似乎在迄今为止检查的大多数人癌中在体内被增量调节，具体地，在肿瘤细胞本身中，在经历血管生成的肿瘤相关的内皮细胞中，和在巨噬细胞中(pyke等人,cancerres.1993,53:1911-15)，其可能参与肿瘤血管生成的诱导(lewis等人,j.leukoc.biol.1995,57:747-751)。癌症患者中的upar表达存在于晚期疾病中，且已经与众多人癌的预后不良相关联(hofmann等人,cancer1996,78:487-92；heiss等人,naturemed.1995,1:1035-39)。此外，upar没有在肿瘤中均匀地表达，而是倾向于与侵袭边缘关联，且被视作代表人胃癌中的转移的表型标志物。因此，upar是肿瘤细胞和血管生成性内皮细胞对细胞外基质的受调节的降解和重塑所必需的。upa-upar在肿瘤生长中的重要作用和它在肿瘤内的丰富表达(但是在正常组织中不会)使得该系统成为有吸引力的诊断和治疗靶标。

已经证实，多克隆尿激酶受体抗体可以减小肿瘤体积和检测体内潜隐肿瘤转移灶的存在(rabbani和gladu,cancerres.62:2390-72002)。已经制备了靶向cd87的高亲和力肽(ploug等人,biochemistry2001,40,12157-12168)。已经在几种动物模型中证实，针对cd87的肽可有效地抑制癌细胞的层粘连蛋白降解和限制转移(kobayashi等人,intjcancer.1994；57:727-733)，且在某些实施方案中，其被用作本发明的edc的靶向基团部分。已经将upa的氨基端片段和源自假单胞菌属外毒素的毒素的几种融合蛋白描述为在低浓度对几种肿瘤细胞具有细胞毒性(rajagopal和kreitman,jbiolchem.2000；275:7566-7573)。腺病毒介导的upa-atf的递送(li等人,genetherapy51105-11131998；humangenetherapy16:1157-11672005)、upa-atf的稳定转染(zhu等人,dnacellbiol20:297-3052001)、反义upar(mohan等人,cancerres59:3369-33731999)或组合的反义upar/upa(gondi等人,oncogene22:5967-59752003)会导致upar活性的阻断或损失以及体外侵袭和体内肿瘤生长和侵袭的抑制。另外，源自尿激酶纤溶酶原活化剂(upa)的非受体结合区域的肽会抑制肿瘤进展和血管生成，并诱导体内肿瘤细胞死亡(guo等人,fasebj.14:1400-14102000)。已经构建了特异性地结合尿激酶型纤溶酶原活化剂受体(upar)和抑制尿激酶型纤溶酶原活化剂(upa)与upar的结合的单克隆抗体(参见美国专利申请20120108797和20080199476和20080152587和美国专利8,026,344)。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合cd87的抗体或其它靶向部分，诸如upa的肽或氨基端片段。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合cd87的细胞外结构域并对表达cd87的细胞产生作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体可以由抗-cd87重链和轻链可变序列构成。在一个实施方案中，所述抗体可以是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合cd87。

实施例5(也参见实施例8)描述了靶向cd87的本发明的一种示例性edc。实施例中的数据表明，对cd87特异性的抗体可以用于生产本发明的edc，后者比在它们的表面上表达cd87的细胞系上的对照缀合物更有活性。确定了edc5.1平均具有2.8个药物/抗体。cd87特异性的edc对黑素瘤细胞系lox是最有活性的。试验的癌细胞包括大细胞肺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、小细胞肺癌、骨髓瘤和骨髓瘤。试验的在细胞表面上表达cd87的唯一细胞系是lox细胞，从而证实了从cd87特异性的靶向部分产生的edc可以是癌症类型特异性的。但是，在采用的试验条件下，所述细胞没有活化以表达cd87，并且一旦用如上讨论的试剂预活化cd87阴性系以后预见到cd87表达。因此，靶向cd87-na,k-atp酶复合物的本发明的edc通常可用于治疗在活化条件下表达这样的复合物的癌症。

可用于制备本发明的edc的靶向部分的另一个例子是这样的靶向部分：其特异性地识别和结合被朊病毒感染的细胞，如在朊病毒疾病和朊病毒相关的疾病中所发生的。朊病毒疾病是独特的、可传播的神经变性疾病。朊病毒仅由宿主编码的正常朊病毒蛋白prp(其在没有核酸存在下复制)的替代构象异形体组成。认为复制通过prp的传染性构象的诱导而发生。prp的不同稳定构象或“构象异构体”已经开拓了神经变性疾病内的蛋白构象疾病的概念，叙称错误折叠的或错误加工的蛋白是疾病的发病机制中的成因(prusiner等人,2001n.engl.j.med.344,1516-1526和taylor等人,2002science296,1991-5)。

最近，证实了在脑中天然地产生的正常朊病毒蛋白会与淀粉样蛋白-β肽相互作用。阻断该相互作用会停止由淀粉样蛋白-β肽的积累(阿尔茨海默氏病的标志)造成的神经学缺陷(lauren等人,2009nature457,1128-1132)。因而，在一个实施方案中，靶向cd230的本发明的edc可用于治疗阿尔茨海默氏病。

尽管由于许多错误折叠的蛋白的不溶解性，结构分析已经是困难的，对错误折叠的蛋白特异性的配体的制备已经成为在它们的细胞环境中分析这些蛋白构象的关键(leliveld,sr等人.2007j.neurosci.res.85,2285-97)。可溶性的可替换地折叠的构象异构体或蛋白寡聚体(而不是不溶性蛋白沉着物)在疾病过程中起作用的观点，已经集中努力来开发构象异构体或寡聚体特异性的配体。已经针对prp的病理学上错误折叠的构象制备了构象特异性的单克隆抗体(mab)，从而能够检测蛋白群体内的蛋白的单一构象异构体(korth等人,1997nature389,74-77和paramithiotis等人,2003nat.med.9,893-9和thackray等人,2003biochem.j.370,81-90)。这些试剂已经被用于检测这些疾病相关的构象异构体在组织或体液中的存在，作为鉴别处于发展朊病毒疾病或相关疾病状况的风险中的无症状或早期个体的方法。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合由基因prnp在人类中编码的朊病毒相关蛋白(cd230,朊病毒相关蛋白,prp,主要朊病毒蛋白)的抗体或其它靶向部分。通过免疫组织化学染色发现，与非转移性胃癌相比，prp在转移性胃癌中高度表达。prpc显著促进胃癌细胞系的粘着性的、侵袭性的和体内转移性的能力[thefasebjournal.2006；20:1886-1888]。通过免疫组织化学在胃癌患者中检测到prp表达，且胃癌中的prp表达显著高于正常胃组织中[worldjgastroenterol.2011年9月21日；17(35):3986-3993]。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合cd230的细胞外结构域且对表达cd230的细胞产生作用的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合prp的不同稳定构象或“构象异构体”的构象特异性的单克隆抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是抗-异常型朊病毒特异性的单克隆抗体，其结合异常型朊病毒，但是基本上不与正常型朊病毒反应。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体抗-cd230克隆3f4(brjhaematol.1999dec；107(4):804-14.)。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合cd230。

实施例6(也参见实施例8)描述了靶向cd230的本发明的一种示例性edc。实施例中的数据表明，对cd230特异性的抗体可以用于生产本发明的edc。确定了edc6.1平均具有7.2个药物/抗体。cd230特异性的edc对a549非小-肺癌细胞最有活性。试验的癌细胞包括非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌和黑素瘤。通过cd230荧光染色确定，试验的所有细胞系在它们的表面上表达cd230，而edc6.1活性远远低于上面讨论的其它edc的活性。这可能是由于差结合亲和力、使用的抗体的特异性、或所述复合物主要形成在脑组织细胞中。靶向朊病毒蛋白的患病有关构象的靶向部分可以用作edc靶向部分，且得到的edc可以用于治疗朊病毒相关的疾病。

可用于制备本发明的edc的靶向部分的另一个例子是，识别和结合cd56或cd56的特定异形体的靶向部分。cd56(ncam)是在小细胞肺癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、脑肿瘤、多发性骨髓瘤和急性髓性白血病上表达的肿瘤相关抗原。ncam由含有至少25个外显子的单个基因编码。由于前体mrna的选择性剪接，可以生产多种成熟的mrna物质和由此生产ncam的蛋白异形体。通过分别决定ncam与质膜的连接模式和细胞内ncam结构域的大小的外显子15和18的选择性剪接，制备了3种主要的(共6种)ncam异形体。在神经系统中，糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定的120kda异形体在神经胶质细胞表面上表达，跨膜140kda异形体在神经元和神经胶质细胞上表达，且跨膜180kda异形体主要存在于神经元表面上。在侵袭性的cd56-阳性的恶性肿瘤中，140kda异形体是主要的(如果不是唯一的话)表达的cd56异形体(gattenlohner等人,2009ajpv174,第4期.1160-1171)。ncam的细胞外部分包含5个ig-样同源性模块(ig1、ig2、ig3、ig4和ig5)和2个纤连蛋白iii型模块(f3,1和f3,2)(berezin等人,2000)。ncam携带非常规碳水化合物聚合物聚-α2,8-唾液酸(psa)。psa是α2,8连接的带负电荷的n-乙酰基神经氨酸(唾液酸)残基的聚合物。ncam敲除的小鼠的研究(cremer等人,nature,1994,367,455-457)指示，ncam是psa的主要载体(如果不是唯一载体的话)。许多具有神经和内分泌特征的肿瘤表达psa-ncam。例如，已经在神经母细胞瘤和髓母细胞瘤(figarella-branger等人,cancerres.,1990,50,6364-6370)、小细胞肺癌(patel等人,int.j.cancer,1989,44,573-578)和横纹肌肉瘤中检测到psa-ncam，且可能与这些肿瘤的侵袭和转移潜力有关(rougon等人,polysialicacid,1993b)。近年来，神经氨酸酶向裸鼠转移模型中的注射表明，原发肿瘤上的psa的除去会延迟转移(daniel等人,oncogene,2001,20,997-1004)。因而，分子psa-ncam和碳水化合物psa代表用于治疗癌症和预防转移的本发明的edc的靶向部分的合适靶标。

ncam不是能够实现机械细胞粘附的简单分子锚，而是介导细胞内下游信号传导的重要功能受体(crnic等人,cancerres.64(2004)8630–8638)。doherty和walsh(1999)描述称，ncam、n-钙粘着蛋白和l1会通过活化神经元中的成纤维细胞生长因子受体(fgfr)而刺激轴突生长。cd56会经由核因子(nf)-kb/bcl2途径诱导急性髓性白血病(aml)中增加的增殖和减少的细胞凋亡(gattenloehner等人,blood2007,110:2027–2033)。

ncam(或cd56)表达与形态形成事件相关，从而提示ncam在发育过程中是重要的(edelman,1990coldspringharborlaboratorypress,1990:303-318)。因而，认为ncam对于神经系统(daston等人,1996journalofneuroscience1996；16:5488-5497)和多种器官的发育而言是重要的，所述器官包括肾(lackie等人,1990development1990；110:933-947)、肝(knittel等人,1996americanjournalofpathology1996；149:449-462)、肠(romanska等人,1996,journalofpediatricgastroenterologyandnutrition1996；22:351-358)、心脏(gaardsvoll等人,1993europeanjournalofcellbiology1993；61:100-107)、性腺(moller等人,anatomyandembryology1991；184:541-548)、胰腺(moller等人,molecularendocrinology1992；6:1332-1342)和肌肉(landmesser等人,neutrone1990；4-655-667)。因此，能够影响ncam功能的治疗剂(诸如本发明的靶向ncam的edc)通过诱导靶细胞的适当分化而可用于这些器官的受损发育病症。在脑中，ncam的作用已经得到敲除的小鼠的支持，所述小鼠具有改变的某些脑区域(包括嗅觉系统、海马、小脑和视网膜)的发育(cremer等人,molecular&cellularneurosciences1997；8:323-335)。

培养的细胞中的ncam表达的增量调节是粘着连接损失的直接结果，且e-钙粘着蛋白表达可以诱导增量调节的ncam基因的表达。结果，在脂质中的ncam簇与p59fyn一起运输，从而导致fak磷酸化和粘着斑装配，细胞能动性和emt所需的活动(lehembre等人,embo(2008)27,2603-2615)。ncam的消融会导致肿瘤细胞的降低的致肿瘤性(kren等人,(2007)emboj26:2832-2842)。因此，诸如靶向ncam的本发明的edc等治疗剂可用于治疗癌症。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合cd56(也被称作神经细胞粘附分子和ncam)的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合cd56的细胞外结构域并对表达cd56的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是排它地结合cd56的140kda异形体的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述靶向部分结合cd56的细胞外结构域，并对表达cd56的细胞发挥作用。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合ncam上的psa的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体由抗-cd56重链和轻链可变序列构成。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合cd56。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是抗体n901或n901的人形式(参见例如，griffin等人,j.immunol.130:2947-2951(1983)和美国专利号5,639,641)。

实施例7(也参见实施例8)描述了靶向cd56的本发明的一种示例性edc。实施例中的数据表明，对cd56特异性的抗体可以用于生产本发明的edc，后者比在它们的表面上表达cd56的细胞系上的对照缀合物更有活性。确定了edc7.1平均具有4.6个药物/抗体，而edc7.2平均含有6.9个药物/抗体。cd56特异性的edc仅对表达cd56的细胞系(小细胞肺癌细胞系h69)最有活性。在那些细胞上，试验的两种edc表现出比平均含有7.4个药物/抗体的对照缀合物更大的活性。试验的癌细胞包括大细胞肺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、小细胞肺癌、黑素瘤和骨髓瘤。因此，本发明的edc可用于治疗表达cd56的癌症，包括淋巴母细胞和髓样白血病(all/aml)、恶性黑素瘤和众多癌，诸如小细胞肺癌。

靶向部分的其它靶标可以用于生产本发明的edc和用于治疗多种疾病。乳酸的跨质膜运输对于所有哺乳动物细胞而言具有根本重要性。糖酵解细胞(例如白肌纤维和在缺氧条件下的所有细胞)必须快速地输出乳酸；其它组织输入乳酸以给呼吸(脑、心脏和红肌)或糖原异生(肝和肾)供给燃料。运输由质子连接的单羧酸酯转运蛋白(mct)家族介导，该家族也负责其它代谢上重要的单羧酸酯(包括酮体)的运输。mct家族具有14个成员，其中的6个已经在功能上得到表征。在这些中，仅mct1-mct4催化质子偶联的乳酸盐运输。已经发现，乳酸盐运输对于某些实体瘤生长而言是关键性的，所述实体瘤需要乳酸盐来供给癌细胞中的线粒体氧化代谢(martinez-outschoorn等人,2010cellcycle9:17,3515-3533)。mct1在大多数细胞中表达，而mct4仅在必须输出大量乳酸的糖酵解组织(例如白肌)中以高水平表达。mct2在大多数人组织中缺失，而mct3表达在很大程度上限于视网膜色素上皮。mct1、mct3和mct4在质膜处的表达需要辅助糖蛋白(gp70(embigin)或者更经常是cd147(basigin))。mct2不会结合cd147，但是它的功能性表达需要gp70。mct保持结合质膜中的basigin或embigin，且该相互作用对于它们的活性而言是重要的。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合单羧酸酯转运蛋白的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合上皮细胞粘附分子mct1的抗体或其它靶向部分。所述mct1在人类中由溶质载体家族16成员1(单羧酸转运蛋白1)(slc16a1)基因编码。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合mct1的细胞外结构域并抑制过表达mct1的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体是，例如，人源化形式的抗-mct1。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合mct1。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合mct4的细胞外结构域并抑制过表达mct4的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体是，例如，人源化形式的抗-mct4。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合mct4。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合谷氨酸受体离子型ampa2(glur2；glurb；hbgr2)的抗体或其它靶向部分，所述ampa2是在人类中由gria2基因编码的蛋白。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合glur2的细胞外结构域并对表达glur2的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合glur2。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合asct2的抗体或其它靶向部分，所述asct2在人类中由溶质载体家族1(中性氨基酸转运蛋白)成员5(slc1a5)基因编码(参见美国专利申请公开号us20100196392和us20110135570)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合asct2的细胞外结构域并抑制过表达asct2的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体是，例如，人源化形式的抗-asct2。在一个实施方案中，所述人源化抗体由在美国专利申请公开号us20100196392中公开的重链和轻链可变序列构成，其识别细胞表面上的cd98。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合asct2。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合上皮细胞粘附分子epcam(cd326)的抗体或其它靶向部分，所述epcam在人类中由epcam基因编码(参见美国专利申请公开号us20070258978)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合epcam的细胞外结构域并抑制过表达epcam的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体是，例如，人源化形式的抗-epcam。在一个实施方案中，所述人源化抗体是mab17-1a，即针对细胞-表面糖蛋白epcam的嵌合小鼠/人单克隆抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体是mab17-1a阿德木单抗(mt201)，即结合细胞-表面糖蛋白epcam的重组人单克隆抗体(currentopinioninmoleculartherapeutics20079:190-196)。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合epcam。

多种整联蛋白在肿瘤血管生成中起重要作用。整联蛋白是细胞外基质(ecm)和基膜蛋白的跨膜受体，其由2个非共价地结合的亚基α和β组成。整联蛋白αvβ3和αvβ5结合ecm分子。已经报道了靶向整联蛋白的具有药理作用的试剂会阻断肿瘤和视网膜血管生成(maubant等人,blood,2006；108,(9)3035-3045)。因此，识别整联蛋白的靶向部分可用于本发明的edc中。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合β3整联蛋白的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合α5整联蛋白的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合α1整联蛋白的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc中的靶向部分是在byron等人,jcellscience2009；122,4009-4011中描述的抗-整联蛋白抗体。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合活化的白细胞细胞粘附分子(cd166)的抗体或其它靶向部分，所述cd166在人类中由alcam基因编码。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合cd166的细胞外结构域并抑制过表达cd166的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合cd166。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合转铁蛋白受体(cd71、p90、tfr1)的抗体或其它靶向部分，所述转铁蛋白受体在人类中由tfrc基因编码(参见美国专利号7,736,647和美国专利申请公开号us20060039907)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合cd71的细胞外结构域并抑制过表达cd71的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体由识别细胞表面上的cd71的重链和轻链可变序列(参见美国专利号7,736,647)构成。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合cd71。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合lin-12-样的sel-1阻遏物(漂亮新小杆线虫)(sel1l1,ibd2)的抗体或其它靶向部分，所述sel-1阻遏物在人类中由sel1l基因编码。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合sel1l1的细胞外结构域并抑制过表达sel1l1的肿瘤细胞的生长的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合sel1l1。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合视网膜劈裂蛋白1(视网膜劈裂蛋白,rs,xlrs2)的抗体或其它靶向部分，所述视网膜劈裂蛋白1在人类中由rs1基因编码(参见美国专利申请公开号us20100047779)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合视网膜劈裂蛋白的细胞外结构域并对表达视网膜劈裂蛋白的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合视网膜劈裂蛋白。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合toll-样受体4(cd284,tlr4,toll)的抗体或其它靶向部分，所述toll-样受体4在人类中由tlr4基因编码(参见美国专利申请公开号us20100183619和us20100266619)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合tlr4的细胞外结构域并对表达tlr4的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体由识别细胞表面上的tlr4的重链和轻链可变序列(参见us20100183619)构成。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合tlr4。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合肌醇1,4,5-三磷酸受体1型(ip3r1,insp3r1)的抗体或其它靶向部分，所述ip3r1在人类中由itpr1基因编码。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合ip3r1的细胞外结构域并对表达ip3r1的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合ip3r1。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合成纤维细胞生长因子受体家族的成员的抗体或其它靶向部分(参见美国专利申请号us20110135657和us20100247531)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合fgfr1的细胞外结构域(cd331)并对表达fgfr1的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在另一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合fgfr2的细胞外结构域(cd332)并对表达fgfr2的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在另一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合fgfr3的细胞外结构域(cd333)并对表达fgfr3的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在另一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合fgfr4的细胞外结构域(cd334)并对表达fgfr4的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合fgfr1。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合fgfr2。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合fgfr3。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合fgfr4。在一个实施方案中，所述人源化抗体可以是imc-a1(一种识别细胞表面上的fgfr1c的全人单克隆抗体，参见amjphysiolendocrinolmetab292:e964-e976,2007)。在一个实施方案中，所述人源化抗体是r3mab(一种识别细胞表面上的fgfr3的全人单克隆抗体,参见j.clin.invest.119(5)2009年5月)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合成纤维细胞生长因子受体家族的成员的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述靶向部分是重组形式的成纤维细胞生长因子诸如fgf1、fgf2、fgf3或fgf7。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合klothoβ(β-klotho,bkl)的抗体或其它靶向部分，所述klothoβ在人类中由基因klb编码(参见美国专利申请公开号us20110135657)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合klothoβ的细胞外结构域并对表达klothoβ的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体由识别细胞表面上的klothoβ的重链和轻链可变序列(参见us20110135657)构成。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合klothoβ。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合t细胞受体(tcr)复合物的蛋白的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合cd3的细胞外结构域并对表达cd3的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合tcrαvα7.2区段(参见martin等人(2009)stepwisedevelopmentofmaitcellsinmouseandhuman.plosbiol7(3):e1000054.doi:10.1371/journal.pbio.1000054)。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合t细胞受体(tcr)vβ5.2/5.3(eurjneurol.2002年3月；9(2):153-64.)。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述小鼠单克隆抗体是识别细胞表面上的t细胞受体(tcr)va7.2的3c10抗-tcrava7.2。在一个实施方案中，所述人源化抗体是识别细胞表面上的t细胞受体(tcr)vβ5.2/5.3的atm-027(annneurol.2002年4月；51(4):467-74)。在一个实施方案中，所述人源化抗体是结合某些活化的t细胞上的cd3受体的维西珠单抗。在一个实施方案中，所述抗体是结合t细胞上的cd3受体的小鼠mab莫罗单抗-cd3。在一个实施方案中，所述抗体是靶向cd3的嵌合的/人源化的mab奥昔珠单抗，也被称作txr4。在一个实施方案中，所述抗体是靶向cd3的人源化的mab替利珠单抗，也被称作mga031。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合tcr复合物上的蛋白。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合胰岛素-样生长因子1受体(igfr,cd221,igf1r)蛋白的抗体或其它靶向部分，所述胰岛素-样生长因子1受体在人类中由igf1r基因编码(currentopinionindrugdiscoveryanddevelopment200811:178-185,combinatorialchemistry&highthroughputscreening,第11卷,第1期,2008年1月,第62-69(8)页)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合igfr的细胞外结构域并对表达igfr的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体是amg479，即一种识别细胞表面上的igf1r的全人单克隆抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体是芬妥木单抗(cp-751,871)，即一种识别细胞表面上的igf1r的全人单克隆抗体(clinicallungcancer,第10卷,第4期/2009年7月)。在一个实施方案中，所述单克隆抗体是sch717454(罗妥木单抗)，即一种识别细胞表面上的igf1r的全人单克隆抗体(molcancerther2010；9:410-418)。在一个实施方案中，所述单克隆抗体是imc-a12(西妥木单抗)，即一种识别细胞表面上的igf1r的全人单克隆抗体(clincancerres2007；13:5549s-5555s)。在另一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合胰岛素样生长因子1受体的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合igf1r。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合肿瘤坏死因子α(tnf-α)的抗体或其它靶向部分，所述肿瘤坏死因子α是在人类中由tnf基因编码的蛋白(immunol.cellbiol.74(5):465–72)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合跨膜形式的tnf-α的细胞外结构域并对表达tnf-α的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体是英夫利昔单抗(inn；商品名类克)，它是对肿瘤坏死因子α特异性的小鼠/人嵌合单克隆抗体(gastroenterology第124卷，第7期，第1774-1785页，2003年7月)。在一个实施方案中，所述单克隆抗体是阿达木单抗(humira,d2e7)，即一种识别肿瘤坏死因子α的全人单克隆抗体(参见美国专利号6,090,382)。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合tnf-α。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合膜-相关的磷脂酶a2(pla2)的抗体或其它靶向部分(amjphysiol.1998feb；274(2pt1):c447-54.pmid:9486135)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合膜相关的pla2的细胞外结构域并对表达pla2的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体由识别pla2的重链和轻链可变序列(参见美国专利申请公开号us20050058649)构成。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合pla2。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合磷脂酰乙醇胺n-甲基转移酶(pe-nmt,pemt,pempt)蛋白的抗体或其它靶向部分，所述pemt在人类中由pemt基因编码(参见biochimbiophysacta.1999年1月4日；1436(3):405-12和morrill等人.bmcstructuralbiology2010,10:12)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合pemt的细胞外结构域并对表达pemt的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合pemt。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合血管紧张素ii受体1型(agtr1a,at2r1)蛋白的抗体或其它靶向部分，所述agtr1a在人类中由agtr1基因编码(参见美国专利号6,805,864和jphysiol586.22(2008)第5337-5348页,amjphysiolrenalphysiol294:f990–f1000,2008)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合agtr1a的细胞外结构域并对表达agtr1a的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体是在美国专利号6,805,864(参见权利要求2)中描述的单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合agtr1a。

在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合溶质载体家族6(神经递质转运蛋白,5-羟色胺)成员4(slc6a4；htt；5-htt；5htt；ocd1；sert；hsert)的抗体或其它靶向部分，所述slc6a4是在人类中由slc6a4基因编码的蛋白(j.phar.exp.ther.285:835-843,1998)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合sert的细胞外结构域并对表达sert的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合sert。

rank(核因子κb受体活化因子)也被称作trance受体，在间质细胞、成骨细胞和t细胞的表面上表达。还已经在得自人起源的癌细胞系(诸如骨肉瘤、乳腺癌和前列腺癌)中发现了rank表达(santini等人,2011plosone6(4):e19234)。rankl(cd254)是结合rank的配体。rankl也是表面结合的分子。rankl对于适当的骨代谢而言是关键性的，且rankl的过度产生涉入多种变性骨疾病，诸如类风湿性关节炎和银屑病关节炎。靶向rank或rankl的本发明的edc可用于治疗变性骨疾病，诸如类风湿性关节炎和银屑病关节炎。

因此，在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是特异性地结合肿瘤坏死因子(配体)超家族成员11(tnfsf11；odf；cd254；opgl；rankl；trance；hrankl2；sodf)蛋白的抗体或其它靶向部分，所述tnfsf11在人类中由tnfsf11基因编码(参见美国专利申请公开号us20070134245和us20020086826；和美国专利号7,411,050)。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合rankl的细胞外结构域并对表达rankl的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在不同的实施方案中，所述edc的靶向部分是抗体，所述抗体可以是，例如，单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体由在us20070134245中描述的抗-rankl重链和轻链可变序列构成。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如fab片段。在一个实施方案中，所述edc的抗体特异性地结合rankl。

在另一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合rank的细胞外结构域并对表达rank的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。在一个实施方案中，所述edc中的靶向部分是结合rankl的细胞外结构域并对表达rank的细胞发挥作用的抗体或其它靶向部分。

在本发明的edc中的抗体靶向部分通常保留它们的天然的未缀合的相应物的抗原结合能力。因而，在本发明的edc中有用的抗体能够特异性地结合抗原，同时通过稳定的(且，在某些实施方案中，不可切割的)接头共价地连接至作用于na,k-atp酶(例如海葱苷宁)的试剂。这样的抗原包括在为了治疗干预(或诊断)而靶向的细胞或组织中与na,k-atp酶结合且紧密邻近的蛋白或靶标。

已经开发了多种方法来生产单克隆抗体(mab)，且这些方法适用于生产用在本发明的edc中的抗体，所以在下面简要地评述。杂交瘤技术(其表示生产单一类型的抗体的克隆细胞系)使用不同物种的细胞，包括小鼠(鼠)、仓鼠、大鼠和人类。制备mab(包括嵌合的和人源化的抗体)的其它方法采用基因工程，例如重组dna技术。

通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射有关的抗原和佐剂，可以在动物中产生多克隆抗体。从一群基本上同质的抗体(例如，除了可能以微小量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的)得到单克隆抗体。

还已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(kozbor,(1984)j.immunol.,133:3001,和brodeur等人,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,第51-63页(marceldekker,inc.,newyork,1987))。测定了在其中培养杂交瘤细胞的培养基中的针对抗原的单克隆抗体的产生。通过免疫沉淀或通过体外结合测定，诸如放射免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa)，可以确定由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性。例如，通过munson等人(1980)analyt.biochem.107:220的scatchard分析，可以确定单克隆抗体的结合亲和力。

使用常规操作(例如，通过使用能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可容易地分离编码单克隆抗体的dna并测序。杂交瘤细胞充当这样的dna的来源。分离后，可以将dna放入表达载体中，然后将其转染进否则不会生产抗体蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞，以得到单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成(参见美国专利申请公开号us20050048572和us20040229310)。关于编码抗体的dna在细菌中的重组表达的综述文章包括：skerra等人(1993)curr.opinioninimmunol.5:256-262和pluckthun(1992)immunol.revs.130:151-188。

在另一个实施方案中，可以从使用在以下文献中描述的技术制备的抗体噬菌体文库中分离出单克隆抗体或抗体片段：mccafferty等人(1990)nature348:552-554；clackson等人(1991)nature352:624-628；和marks等人(1991)j.mol.biol.,222:581-597，分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。以后的出版物描述了通过链改组(marks等人(1992)bio/technology10:779-783)、以及组合感染和体内重组生产高亲和力(nm范围)人抗体作为构建非常大噬菌体文库的策略(waterhouse等人(1993)nuc.acids.res.21:2265-2266)。因而，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。

还可以修饰dna，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列置换同源鼠序列(美国专利号4,816,567)；和morrison等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa81:6851)，或者通过将免疫球蛋白编码序列共价地连接至非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列。

通常，用这样的非免疫球蛋白多肽置换抗体的恒定结构域，或者用它们置换抗体的抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合的二价抗体，所述二价抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。

作为人源化的替代方案，可以制备人抗体。例如，现在可能生产转基因的动物(例如，小鼠)，其在免疫接种以后能够在没有内源免疫球蛋白产生存在下生产人抗体的完整库(jakobovits等人,(1993)proc.natl.acad.sci.usa,90:2551；jakobovits等人,(1993)nature362:255-258；bruggermann等人,(1993)yearinimmuno.7:33；和美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807)。

可替换地，可以使用噬菌体展示技术(mccafferty等人,(1990)nature348:552-553)从得自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(v)结构域基因库在体外生产人抗体和抗体片段(johnson等人,(1993)curr.opin.structuralbiol.3:564-571)。可以构建得自未免疫的人供体的v基因库，且可以基本上分离针对不同抗原(包括自体抗原)阵列的抗体(marks等人,(1991)j.mol.biol.222:581-597；griffith等人,(1993)emboj.12:725-734；美国专利号5,565,332和5,573,905)。体外活化的b细胞也可以产生人抗体(美国专利号5,567,610和5,229,275)。已经描述了人抗-erbb2抗体(美国专利号5,772,997和pct公开号wo97/00271)。

已经开发了用于生产抗体片段的不同技术。传统上，通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生出这些片段(参见morimoto等人,(1992)j.biochem.biophys.methods24:107-117；和brennan等人,(1985)science229:81)。还可以由上面讨论的重组宿主细胞和抗体噬菌体文库直接生产抗体片段。可以从大肠杆菌直接回收fab'-sh片段，并化学偶联以形成f(ab')2片段(carter等人(1992)bio/technology10:163-167)。根据另一个方案，可以从重组宿主细胞培养物直接分离f(ab')2片段。熟练的从业人员会明白用于生产抗体片段的其它技术。在其它实施方案中，选择的抗体是单链fv片段(v(sfv)二聚体(gruber等人,(1994)j.immunol.152:5368)。还已经描述了用于从抗体片段制备双特异性抗体的技术，诸如使用化学连接，其中将完整抗体蛋白水解地裂解以产生f(ab')2片段(brennan等人,(1985)science229:81)。可以从大肠杆菌回收fab'-sh片段，并化学偶联以形成双特异性抗体(shalaby等人,(1992)j.exp.med.175:217-225)。“双体”技术提供了一种用于制备双特异性抗体片段的替代方法(hollinger等人,(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。

具有超过2个化合价的抗体可以用在本发明的edc的不同实施方案中。通过编码抗体的多肽链的核酸的重组表达，可以容易地生产具有3个或更多个抗原结合位点和2个或更多个可变结构域的多价“章鱼”抗体(美国专利申请公开号us20020004586和pct公开号wo01/77342)。例如，可以制备三特异性抗体(tutt等人,(1991)j.immunol.147:60)。

本发明预见到抗体的氨基酸序列修饰。例如，预见到结合肿瘤相关抗原或其它抗原的抗体的突变体和不同异形体会提高抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性和/或实现接头和/或治疗剂与抗体的位点特异性缀合。通过将适当的核苷酸变化引入编码抗体的核酸中或通过肽合成，制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，在抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。做出缺失、插入和置换的任意组合，以获得最终的构建体，前提条件是，最终的构建体具有期望的特征。氨基酸变化也可能改变抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

一种用于鉴别作为优选诱变位置的抗体的某些残基或区域的有用方法是“丙氨酸扫描诱变”(cunningham和wells(1989)science244:1081-1085)，其中鉴别一个氨基酸残基或靶残基组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(诸如丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以优化氨基酸与抗原的相互作用。氨基酸序列插入包括长度范围从1个残基至含有100个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合体以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。

通过改变基础核酸序列，通常会改变抗体的氨基酸序列。通过本领域已知的多种方法，制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括、但不限于：从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)，或通过早前制备的抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸介导的(或定位)诱变、pcr诱变和盒式诱变来制备。置换诱变的最大兴趣位点包括高变区，但是也预见到fr改变。

通过选择置换来实现抗体的生物学特性的重大改进，所述置换具有显著不同的以下方面的作用：维持(a)置换区域中的多肽主链的结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)在靶位处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。基于共同的侧链性质，将天然存在的残基分组：(1)疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水的：cys、ser、thr；(3)酸性的：asp、glu；(4)碱性的：asn、gln、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳族的：trp、tyr、phe。非保守置换会实现用这些种类之一的成员交换另一类的成员。

还可以通常用丝氨酸置换未参与维持抗体的适当构象的任意半胱氨酸残基，以提高分子的氧化稳定性和阻止异常交联。相反，可能将半胱氨酸键添加至抗体以提高它的稳定性(特别是在抗体是抗体片段诸如fv片段的情况下)。

为了增加抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位掺入例如在美国专利号5,739,277中描述的抗体(特别是抗体片段)中。本文中使用的术语“补救受体结合表位”表示igg分子(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)的fc区的表位，其负责增加igg分子的体内血清半衰期(参见美国专利申请公开号us20030190311和美国专利号6,821,505、6,165,745、5,834,597、5,648,260和5,624,821)。还可以使用聚乙二醇化来增加本发明的edc的半衰期。

抗体的糖基化变体是其中改变了抗体的糖基化模式的变体。改变是指：删除在所述抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分，向所述抗体添加一个或多个碳水化合物部分，改变糖基化的组成(糖基化模式)或糖基化的程度。抗体可以在它们的恒定区中在保守位置(n-连接的或o-连接的)处被糖基化(hse等人,(1997)j.biol.chem.272:9062-9070；jefferis和lund,(1997)chem.immunol.65:111-128；wright和morrison,(1997)tibtech15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链会影响蛋白的功能(boyd等人,(1996)mol.immunol.32:1311-1318；wittwe和howard,(1990)biochem.29:4175-4180)和糖蛋白的多个部分之间的分子内相互作用，后者可以影响糖蛋白的构象和呈现的三维表面(hefferis和lund,出处同上；wyss和wagner(1996)currentopin.biotech.7:409-416)。寡糖也可以起将给定的糖蛋白靶向基于特定识别结构的某些分子的作用(malhotra等人,(1995)naturemed.1:237-243；umana等人,(1999)naturebiotech.17:176-180)。寡糖的除去可以优化抗体的抗原结合和其它性质(boyd等人,(1996)mol.immunol.32:1311-1318)。

在抗体的重组生产过程中影响糖基化的因素包括：生长模式、培养基配方、培养物密度、氧合、ph、纯化方案等(美国专利号5,047,335、5,278,299和5,510,261)。可以从糖蛋白酶促地除去糖基化或某些类型的糖基化，例如使用内切糖苷酶h(endoh)。另外，可以遗传工程改造重组宿主细胞，例如产生加工某些类型的多糖的缺陷。这些和类似的技术是本领域众所周知的。

通过常规的碳水化合物分析技术，包括凝集素色谱法、nmr、质谱法、hplc、gpc、单糖组成分析、连续酶消化和hpaec-pad(其使用高ph阴离子交换色谱法基于电荷来分离寡糖)，可以容易地分析抗体的糖基化结构。用于分析目的的释放寡糖的方法也是已知的，且包括、但不限于，酶处理(通常使用肽-n-糖苷酶f/内切-β-半乳糖苷酶进行)，使用苛刻的碱性环境主要释放o-连接的结构的消除，和使用无水肼释放n-和o-连接的寡糖的化学方法。

本发明的edc的抗体或其它靶向部分的这些靶标中的一些具有多个决定它们在细胞内或表面上的位置的亚基、异形体和/或糖基化模式。它们的呈现可以取决于细胞类型、在细胞上的位置、细胞的位置和/或生理学和病理学状况。例如，异常的糖基化是癌症的一种标志，且包括糖蛋白、糖脂和糖胺聚糖的碳水化合物含量的改变(参见anticanceragentsmedchem2008；8(1):2-21，通过引用并入本文)。具体地，存在大量证据表明，n-聚糖的β-1,6-glcnac-分支会直接促进癌症进展(参见biochimbiophysacta1999；1473(1):21-34，通过引用并入本文)。作为另一个例子，在na/k-atp酶复合物中存在的β亚基的类型(1相对于2)和它的糖基化模式随细胞类型不同而变化(参见proteomics2008；8(16):3236-56,和amjphysiol1997；272(1pt1):l85-94，通过引用并入本文)。认为na/k-atp酶膜结合的离子泵的糖基化模式已经进化以服务细胞特异性的调节要求，且已经在许多癌细胞中鉴别出异常的糖基化模式。另外，na/k-atp酶膜结合的离子泵复合物的γ亚基异形体5也是糖基化的膜蛋白(也称为dysadherin或fxyd5)，其已经被证实会促进实验性的癌症转移，且是许多不同类型的人癌症的转移和存活的独立预后指标[参见nam等人.cancerlett.255(2)161-9(2007)]。另外，许多细胞外靶标在患病组织中或在患病组织周围的循环结构中是稍微不同的或过度表达。因此，本发明的edc的靶向部分可以靶向由异常或罕见糖基化或改变的抗原表达引起的任一种靶抗原。

分子伴侣cosmc中的体细胞突变可以导致新糖肽表位的产生，可以制备针对所述表位的用于本发明的edc中的癌症特异性抗体(参见schietinger等人,science314(5797)304-8(2006)，通过引用并入本文)。已经制备了识别糖基化中的这些差异的抗体。2篇论文描述了如何生产针对异常地糖基化的细胞表面聚糖的特异性抗体(参见cancerimmunolimmunother2006；55(11):1337-47,和cancerres2009；69(5):2018-25)。但是，制备针对单独糖的高亲和力抗体可以是困难的。为了克服对肿瘤-相关的碳水化合物抗原的免疫耐受性的问题，可以将非天然存在的抗原糖饲喂给细胞，从而产生新糖基化基序，可以产生针对所述基序的高亲和力抗体(参见bioorg.med.chem.15(2007)7561-7567)。针对这些非天然存在的糖产生的抗体与它们修饰的蛋白一起产生非常特异性的疾病靶向抗体，且可用在本发明的edc的不同实施方案中。

还已经制备针对在患病组织中过表达的靶标的抗体，且当针对与na,k-atp酶结合的蛋白时，这样的抗体可用于本发明的edc中。对于癌症而言，这些抗原通常被称作肿瘤相关的抗原，且代表一组正常的非突变体分子。例如，已经制备了针对在转移性癌细胞上过表达的靶标的抗体，且如果那些靶标与na,k-atp酶结合，这样的抗体可用在本发明的edc中。转移性细胞具有迁移至其它组织或器官从而扩散癌症的能力。

除了靶向方面以外，本发明的edc的靶向基团部分可以具有其它优点。例如，所述靶向部分可以促进跨血脑屏障的运输(例如，抗体可以促进该运输[scitranslmed3,84ra43(2011)和scitranslmed3,84ra44(2011)])；所述靶向部分可以增加治疗剂的体内半衰期(3个igg亚类在人类中具有约20天的半衰期)；和/或所述靶向部分可以增加所述试剂在水溶液(诸如循环结构或药物稀释剂)中的溶解度。

在本发明的edc的不同实施方案中，本发明的edc上的靶向部分可以起如下作用：(i)长时间地(取决于它的结合亲和力)保持本发明的试剂在靶标附近或表面上，(ii)阻止或延迟溶酶体酶的降解，因为非内化靶向部分不会通过受体/抗原类型的胞吞被内化进细胞中，且这样不会到达溶酶体系统，和(iii)以线性地依赖于它的细胞外浓度的方式阻止通过流体相胞吞的细胞内摄取。本领域技术人员可以通过实验确定靶向部分的非内化特征。作为例子，非内化抗体是与存在于靶组织细胞外组分(诸如细胞外基质的那些)的表面处的抗原和表位相互作用的那些，且不会进入可以在其中降解它们的溶酶体。

本发明的edc中的抗体可以包括如在上面提供的定义中描述的不同的单克隆抗体、多克隆抗体、修饰的抗体、嵌合抗体或改进的抗体。例如，现代替代策略现在允许生产全人源化抗体以降低抗体的免疫原性。另外，可以工程改造较小的抗体片段，包括结合抗原的fabs、fvs、scfv和微体，且还可以增强抗体以增加抗体的亲和力、稳定性和表达水平(参见natmed.2003年1月；9(1):129-34)。

在本发明的一个替代实施方案中，本发明的edc的靶向部分不是抗体，而是作为抗体的功能等效物(在靶向方面)的肽或蛋白或肽拟似物。例如，但不限于，使用组合蛋白设计方法，可以用许多小型且稳健的非免疫球蛋白“支架”中的任一种替代抗体，所述“支架”可以具有规定的结合功能。这样的支架描述在不同的综述中(参见，例如“engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics”，见curropinchembiol.2009年6月；13(3):245-55和“engineeredaffinityproteinsfortumour-targetingapplications”，见biotechnolapplbiochem.2009年5月；53(pt1):1-29)。

在本发明的另一个替代实施方案中，本发明的edc的靶向部分不是抗体，而是作为抗体的功能等效物(在靶向方面)的dna、rna或寡核苷酸模拟物。例如，可以使用selex方法来鉴别具有规定的结合功能的dna或rna或其修饰形式。适体是rna或dna寡核苷酸或其修饰形式的聚合物，其通过配体的系统进化如指数富集selex过程而分离(参见hicke和stephens,2000,“escortaptamers:adeliveryservicefordiagnosisandtherapy,”j.clin.invest.,106(8),第923–928页)。

通常，在用于形成本发明的edc之前，将靶向部分(或其它结合或靶向部分)纯化至大于95重量％(例如，通过lowry方法确定)，且经常纯化至超过99重量％。通常，通过至少一个纯化步骤来制备靶向部分。一旦得到目标靶向部分，可以通过如在以下部分中讨论的多种接头和接头技术中的任一种将它连接至治疗剂。

本发明的edc的示例性靶向部分包括针对cd147的抗体，诸如加维莫单抗或齐拉木单抗。本发明的edc的其它靶向部分包括：对epcam特异性的抗体诸如阿德木单抗、泊西他珠单抗或卡妥索单抗，对cd44特异性的抗体诸如比伐珠单抗美登素，对rankl特异性的抗体诸如地舒单抗，对igf-1受体特异性的抗体诸如芬妥木单抗或罗妥木单抗，整联蛋白诸如medi-522(也被称作vitaxin、reopro、tysabri和ambegrin)，和对细胞外靶标(其与na,k-atp酶复合)的细胞外表位具有高亲和力的其它抗体。

因而，存在多种可以用于制备本发明的edc的靶标和靶向部分。特别感兴趣的靶向部分是靶向疾病特异性的细胞外靶标(其位置与na,k-atp酶紧密邻近)的那些。本发明的edc包括这样的含有靶向试剂(抗体和/或药物)的edc：所述靶向试剂作为单一的或独立的试剂不具有足以用于治疗目的特异性。这样的试剂现在被用于本发明的edc的治疗用途中。

这些靶标中的许多的抗体靶向部分已经存在，或者本领域普通技术人员在考虑到本文中的公开内容以后可以制备。如本文证实的，具有抗体靶向受体诸如cd147(edc2)、cd44(edc3)、cd98(edc4)、cd87、cd230和cd56的edc可以用作肿瘤学中的抗癌剂，且存在适合用于本发明的edc的众多其它靶标(和对应的抗体)(例如，cd29、cd71、cd166和epcam，例如)。对于炎症，适合用于本发明的edc的靶标(和对应的抗体)包括cd28、pla2和t-细胞受体。对于糖尿病，适合用于本发明的edc的靶标(和对应的抗体)包括pe-nmt、胰岛素受体(cd220)和血管紧张素。此外，这些适应症仅仅是本发明的edc为其提供重要的新治疗剂的不同适应症的示例。

因而，本发明的edc可以利用多种靶向部分中的任一种，所述靶向部分结合与na,k-atp酶紧密邻近的靶标。

iv.接头

为了形成本发明的edc，经由稳定接头将治疗剂偶联至靶向部分。在不同的实施方案中，所述接头包括至少一个糖苷(糖)残基，所述残基通常连接至edc的药物。接头(如果概念表述为单独实体，而不是edc的一部分)是可以用于将一个或多个药物连接至抗体以形成edc的单功能或多功能部分。使用具有用于结合药物和抗体的反应官能团的接头，可以方便地制备edc。例如，半胱氨酸硫醇或胺，例如抗体的n-端或氨基酸侧链诸如赖氨酸可以与接头试剂或药物-接头试剂(由药物和接头组成)的官能团形成键。

用于本发明的方法优选的edc中的接头通常包含聚乙二醇(peg)和一个或多个糖苷。在不同的实施方案中，所述接头的peg部分含有2-36个二醇单元。在不同的实施方案中，所述接头的peg部分含有24个二醇单元。在不同的实施方案中，所述接头含有单个糖苷。在不同的实施方案中，最初将糖苷连接至试剂上的不同位点处，并试验这些试剂-糖苷的活性。在不同的实施方案中，所述接头的糖苷部分含有3-氨基-核苷、4-氨基-核苷、3-氨基-木糖苷和/或4-氨基-木糖苷。在不同的实施方案中，所述edc的最大活性需要接头的糖苷部分。在不同的实施方案中，经由糖苷将所述试剂连接至接头，且所述糖苷选自3-氨基-核苷、4-氨基-核苷、3-氨基-木糖苷和4-氨基-木糖苷，并且所述接头的peg部分连接至糖苷的氨基。通常，在根据本发明的制备方法制备edc时，首先形成药物-接头试剂，然后将药物-接头试剂共价地偶联至抗体以形成edc。当所述试剂是地高辛配基、黄体酮或海葱苷宁时，所述糖苷是4-氨基-核苷或4-氨基-木糖苷。当所述试剂是毒毛花苷g时，所述糖苷是3-氨基-核苷或3-氨基-木糖苷。

在本发明的edc中采用的接头是稳定的。施用后，edc是稳定的，且保持完整，例如靶向部分保持经由接头连接至试剂。所述接头在靶细胞外面是稳定的，且保持不可切割以实现效力。有效的接头将：(i)维持抗体的特异性结合性质；(ii)允许递送缀合物或试剂；(iii)保持稳定和完整，例如不被切割，只要抗体和/或试剂保持稳定和完整；和(iv)维持所述试剂的细胞毒性的细胞杀死效应或细胞生长抑制效应，同时edc是完整的。作为例子，稳定接头是这样的：当在本发明的edc中时，当在循环结构中、在靶组织表面处、在靶细胞表面处或在细胞外基质中存在至少4-8小时或更长的时段(诸如8-24小时或1-10天或更久)时，其表现出微小的(例如，小于10％)切割；不可切割的接头在这些条件下稳定较长的时段，包括长至20天或更久的时段(durcy,l.等人.bioconjugatechem.2010,21,5-13)。

可以在2个阶段中方便地生产在本发明的edc中采用的接头。在第一阶段中，将含有活性亲核体(诸如游离伯胺)的糖苷连接至甾体类试剂诸如洋地黄毒苷配基或海葱苷宁。在第二阶段中，将双功能的peg接头连接至糖苷的胺。该方法是有利的，因为它允许接连地添加糖苷和不同接头长度的不同组合。另外，已经证实糖苷当用在本发明的接头部分中时具有某些优点。

稳定接头会在治疗剂和靶向部分之间形成共价键，使得当连接时，试剂和靶向部分可以结合和作用于它们各自的靶标。尽管稳定接头可以简单地为在靶向部分和试剂上的反应部位之间形成的共价键，本发明的稳定接头通常包括接头间隔基团，例如，乙二醇单元和氨基-糖苷的重复系列。为了通过接头将靶向部分连接至试剂，可以利用互补的反应基团。例如，在靶向部分上的可接近的巯基可以与有活性的马来酰亚胺基团反应以形成稳定的硫醚键。另一个例子是在试剂上的可接近的胺，其可以与琥珀酰亚胺酯反应以形成稳定的酰胺键。具有在一端上的马来酰亚胺和在另一端上的琥珀酰亚胺酯的双功能接头可以用于将药物连接至抗体。如在下面的实施例中例证的，通过将氨基糖苷连接至类固醇药物的羟基从而形成o-糖苷键，可以方便地制备edc。然后，将nhs-peg-马来酰亚胺试剂连接至氨基糖苷的氨基以形成“接头-试剂”。最后，将接头-试剂中的马来酰亚胺共价地连接至抗体中的半胱氨酸部分。

因而，在edc中通常使用不同的化学接头(与单个共价键不同)。这类接头通常是由一个或多个“接头间隔基团”组成的线性原子或聚合物链，所述“接头间隔基团”的2个“末端”含有可以充当连接试剂以将靶向部分和/或治疗剂共价地连接至接头的官能团。合适的接头可以包括多种官能团和部分，包括、但不限于被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、醛、酸、酯和酸酐、巯基或羧基，诸如马来酰亚胺基苯甲酸衍生物、马来酰亚胺基己酸衍生物和琥珀酰亚胺基衍生物，或者可以源自氰基溴或氰基氯、琥珀酰亚胺基酯或磺酰卤等。

除了物理地连接靶向部分和药物以外，所述接头可以给本发明的edc赋予有益性质。所述接头可以用于使由试剂自结合或试剂造成的edc的聚集最小化。所述接头也可以改善edc的治疗效果。所述接头还可以改善edc的药代动力学。当将靶向部分连接至治疗剂时，连接基团可以具有几种其它功能，诸如使本发明的化合物具有更高的生物抗性、更高的生物相容性、更低的免疫原性、更低的毒性和/或更高的稳定性(当在循环结构中时)或对其它类型的破坏或消除更高的稳定性，或者使它成为不可切割的。因而，在某些实施方案中，稳定的或不可切割的接头会在生理条件下维持靶向部分与治疗剂的连接，但是也可能还具有有益的治疗效果。

稳定的、不可切割的接头的一个例子是聚亚烷甘醇接头。稳定的、不可切割的接头的另一个例子是连接至聚亚烷甘醇接头的糖苷。聚亚烷甘醇接头是具有至少2个且通常超过2个亚烷基部分的线性链，所述亚烷基部分被醚键形式的氧连接在一起。糖苷连接的聚亚烷甘醇接头是具有连接的糖(诸如氨基糖苷)的线性聚亚烷甘醇链。所述亚烷基可以是被取代的，但是通常是未被取代的，且可以包含任意期望数目的亚烷基单元，但是通常包含至少2个或不超过100个这样的单元，例如，亚乙基、亚丙基、亚己基等。在一个实施方案中，所述接头由24个重复乙二醇单元构成，形成peg24-型接头。该接头的长度是大约90-100埃，取决于连接至任一端的反应基团。通常，接头长度是在约50至约500埃、或约50至约200埃的范围内。在一个实施方案中，所述接头包含糖。在不同的实施方案中，如上所述，所述接头含有氨基糖。聚亚烷甘醇残基可以包含重复亚烷基单元，所述单元都是相同的或在长度和/或取代方面变化。在不同的实施方案中，使用(peg)36双功能接头构建本发明的edc的接头。在一个特定实施方案中，使用得自thermoscientific的sm(peg)24构建本发明的edc的接头。在一个特定实施方案中，使用氨基-糖苷构建本发明的edc的接头。在一个特定实施方案中，使用3-氨基-核苷、4-氨基-核苷、3-氨基-木糖苷和/或4-氨基-木糖苷构建本发明的edc的接头。

当使用聚乙二醇(peg)和一个或多个糖苷将靶向部分连接至药物时，所述edc可以能够耐受免疫系统的攻击。已经证实，将peg添加至蛋白或小分子会改善一些蛋白或小分子治疗剂的治疗效果(参见pegylatedproteindrugs:basicscienceandclinical；applicationsseries:milestonesindrugtherapyveronese,francescom.(编)2009和advanceddrugdeliveryreviews第55卷，第10期,2003年9月26日，第1261-1277页，通过引用并入本文)。因此，peg可以增加血清半衰期和降低抗原性。

当使用糖(诸如氨基糖苷)经由聚亚烷甘醇将抗体连接至药物时，与缺乏这样的糖的edc相比，所述edc可以具有增强的耐受免疫系统攻击的能力。在一个特定实施方案中，所述接头的优选糖苷是3-氨基-核苷、4-氨基-核苷、3-氨基-木糖苷和/或4-氨基-木糖苷。本领域技术人员会明白，存在众多可以利用的糖苷，其含有可以用于将糖苷连接至接头的其它部分的伯胺或亲核体。优选糖苷是并非天然存在的酶的底物的那些。已经证实，将糖添加至蛋白或小分子会改善抗体或小分子治疗剂的治疗效果(参见naturereviewsdrugdiscovery8,226-234(2009年3月)，和参见essentialsofglycobiology.第2版.coldspringharborlaboratorypress；2009)。因此，糖可以增加可溶性从而减少聚集和降低抗原性。

本发明的接头的糖苷可以包括：d或l型的己糖、戊糖、脱氧己糖、脱氧戊糖、脱氧-卤代己糖、脱氧-卤代戊糖、脱氧-氨基戊糖、脱氧-氨基己糖、丁糖、异糖、羧基糖、前述糖的衍生物、源自至少一种前述糖的二糖、或源自至少一种前述糖的多糖。合适的糖包括，例如，l-核糖、d-核糖、l-岩藻糖、d-岩藻糖、2-脱氧-d-半乳糖、3-脱氧-d-葡萄糖、6-脱氧-d-葡萄糖、2-脱氧-2-氟-d-葡萄糖、6-脱氧-6-氟-d-葡萄糖、l-来苏糖、d-来苏糖、l-鼠李糖、l-阿洛糖、d-阿洛糖、l-阿卓糖、d-阿卓糖、l-半乳糖、d-半乳糖、l-木糖、d-木糖、d-古洛糖、l-甘露糖、d-甘露糖、l-艾杜糖、d-艾杜糖、l-碳霉糖、6-酮-d-半乳糖、l-阿拉伯糖、d-阿拉伯糖、n-乙酰基-d-半乳糖胺糖(galactosaminose)、蜜二糖、乳糖、麦芽糖、d-半乳糖醛糖(galacturonose)、l-塔罗糖、d-塔罗糖、6-脱氧-6-偶氮-d-甘露糖、l-葡萄糖、d-葡萄糖和它们的氨基-糖苷。

尽管在制备edc时可以改变抗体、接头部分和药物的连接次序，通常所述制备过程如下进行：首先合成药物，然后连接接头的糖部分，然后连接接头的peg部分，最后连接抗体。本领域技术人员会理解，抗体可以存在多个用于共价连接药物-接头试剂(或接头)的位点。通过适当地修改偶联条件，可以使制备edc的制品，其中每个抗体的药物平均数随采用的条件而变化。在本发明的不同方法中，该平均数在实现edc的最大有益治疗效果时是重要的，如下面所讨论的。

为了形成本发明的edc，将治疗剂经由稳定接头偶联至靶向部分。所述接头通过一个或多个共价键将靶向部分连接至试剂，且因为需要稳定接头，所述接头通常不包括二硫键基团或酯基。所述接头是有功能的或多功能的部分，其可以用于连接一个或多个试剂和靶向部分以形成本发明的edc。使用具有用于结合靶向部分的反应官能团的接头，可以方便地制备edc。例如，抗体型靶向部分的半胱氨酸硫醇或胺(例如n-端或氨基酸侧链诸如赖氨酸)可以与接头试剂或药物-接头试剂的官能团形成键。在本发明的某些实施方案中，合成药物-接头试剂，然后偶联至抗体或其它靶向部分以形成本发明的edc。如在下面实施例1中例证的，本发明的有用药物-接头试剂包括这样的：其中药物是类固醇，诸如强心苷的糖苷配基，且接头是连接至peg间隔臂的糖苷。在本发明的不同实施方案中，接头或接头中的间隔臂的长度是至少50埃，或至少75埃，或至少95埃。在一个实施方案中，所述接头的长度是至少95埃，但是小于200埃。

在本发明的edc中采用的接头是稳定的。施用后，edc是稳定的且保持完整，例如靶向部分保持经由接头连接至试剂。所述接头在靶细胞外是稳定的，且保持不可切割以实现效力。有效的接头将：(i)维持抗体的特异性结合性质；(ii)允许递送缀合物或试剂；(iii)保持稳定和完整，例如不被切割，只要抗体和/或试剂保持稳定和完整；和(iv)维持所述试剂的细胞毒性的细胞杀死效应或细胞生长抑制效应，同时edc是完整的。通过标准分析技术诸如质谱法、hplc和分离/分析技术lc/ms，可以测量edc的稳定性。

稳定接头在治疗剂和靶向部分之间形成共价键，使得当连接时，试剂和靶向部分可以结合和作用于它们各自的靶标。尽管稳定接头可以简单地为在靶向部分和试剂上的反应部位之间形成的共价键，本发明的稳定接头通常包括接头间隔基团和糖苷。为了将靶向部分连接至药物-接头试剂，可以利用反应基团。例如，在靶向部分上的可接近的巯基可以与有活性的马来酰亚胺基团反应以形成稳定的硫醚键。

除了物理地连接靶向部分和药物以外，所述接头可以给本发明的edc赋予有益性质。所述接头可以用于使由试剂自结合或试剂造成的edc的聚集最小化(例如，通过将亲水的甲氧基三甘醇链引至支链肽接头的多柔比星部分上，会极大地减少免疫缀合物产物中的聚集)。所述接头也可以改善edc的治疗效果(例如，增加的多柔比星和br64单克隆抗体之间的接头稳定性会产生增加的效力和效能)。所述接头还可以改善edc的药代动力学(例如，聚乙二醇可以增加抗体和其它分子的血清半衰期)。接头还可以用于增加试剂或靶向部分的化学反应性，并从而增加靶向部分或试剂的偶联效率。化学反应性的增加还可以促进否则不可使用的部分或部分上的官能团的应用。当靶向部分连接至治疗剂时，连接基团可以具有几种其它功能，诸如使本发明的化合物具有更高的生物抗性、更高的生物相容性、更低的免疫原性、更低的毒性和/或更高的稳定性(当在循环结构中时)或对其它类型的破坏或消除更高的稳定性，或者使它成为不可切割的。因而，在某些实施方案中，稳定的或不可切割的接头会在生理条件下维持靶向部分与治疗剂的连接，但是也可能还具有治疗效果。

在本发明的edc中使用的接头是稳定的，且在不同的实施方案中，是不可切割的。在所有实施方案中，为了使本发明的edc发挥它的最大治疗效果，所述接头必须保持完整，这要求以下的：(i)本发明化合物的靶向部分和治疗剂之间的连接在循环结构中保持稳定延长的时间段，足以使edc找到和结合它的靶标；(ii)当在不同的条件和温度下储存本发明的edc延长的时间段时，所述连接保持稳定；和(iii)本领域技术人员可以通过实验确定本发明的edc的稳定特征。作为例子，稳定接头是这样的：当在本发明的edc中时，当在循环结构中、在靶组织表面处、在靶细胞表面处或在细胞外基质中存在至少4-8小时或更长的时段(诸如8-24小时或1-10天或更久)时，其表现出最小(例如，小于10％)切割；不可切割的接头在这些条件下稳定较长的时段，包括长至20天或更久的时段(durcy,l.等人.bioconjugatechem.2010,21,5-13)。

稳定的、不可切割的接头的一个例子是经由酰胺键连接至糖苷的聚亚烷甘醇接头。聚亚烷甘醇接头是具有至少2个且通常超过2个亚烷基部分的线性链，所述亚烷基部分被醚键形式的氧连接在一起。所述亚烷基可以是被取代的，但是通常是未被取代的，且可以包含任意期望数目的亚烷基单元，但是通常包含至少2个且不超过5个、或不超过10个、或不超过25个或不超过50个、或不超过100个这样的单元，例如，亚乙基、亚丙基、亚己基等。在一个实施方案中，所述接头由24个重复乙二醇单元构成，形成peg24-型接头。该接头的长度是大约90-100埃，取决于连接至任一端的反应基团。在一个实施方案中，所述接头包含糖。在一个实施方案中，所述接头包含氨基糖。聚亚烷甘醇残基可以包含重复亚烷基单元，所述单元都是相同的或在长度和/或取代方面变化。在不同的实施方案中，使用(peg)36双功能接头或间隔臂构建本发明的edc的接头。在一个特定实施方案中，使用得自thermoscientific的sm(peg)24构建本发明的edc的接头。

当然可以选择一个或多个亚烷基单元的任意取代基，使得本发明的有利性质基本上不受损害。本领域技术人员考虑到本文中的公开内容能够做出适当选择。通常，这样的取代基如果存在的话则为羟基、烷氧基或二取代的氨基部分。当使用聚乙二醇(peg)和一个或多个糖苷将靶向部分连接至药物时，所述edc可以能够耐受免疫系统的攻击。已经证实，将peg添加至蛋白或小分子会改善一些蛋白或小分子治疗剂的治疗效果(参见pegylatedproteindrugs:basicscienceandclinical；applicationsseries:milestonesindrugtherapyveronese,francescom.(编)2009和advanceddrugdeliveryreviews第55卷，第10期,2003年9月26日，第1261-1277页，通过引用并入本文)。因此，peg可以增加半衰期，降低对频繁给药的要求，并且还降低抗原性。

可以通过接头将药物偶联至工程改造在抗体上的位点特异性的位置以制备本发明的edc。例如，通过使用甲酰基甘氨酸产生酶(fge)，可以制备醛标签，所述酶执行将氨基酸共有序列(也称作“硫酸酯酶基序”)内的半胱氨酸转化为携带醛的残基甲酰基甘氨酸(fgly)的翻译后修饰。所述基序可以安装在异源蛋白内作为遗传编码的“醛标签”，用于用氨基氧基-或酰肼-官能化的探针进行位点特异性的标记(参见cell.2003年5月16；113(4):435-44；jamchemsoc.2008年9月17日；130(37):12240-12241)。选择性地修饰抗体位点的另一个例子也通过半胱氨酸实现，且包括：首先使用噬菌体elisa选择来鉴别抗体表面上的反应性的硫醇基团(参见jimmunolmethods.2008mar20；332(1-2):41-52,和美国专利申请公开号us20080305044)。位点特异性地标记抗体的另一种方法是，通过使用掺入抗体多肽链中的非天然氨基酸(参见annurevbiophysbiomolstruct.200635:225-49)。

根据本发明的方法可以使用多功能接头或树枝状聚合物，使得多个试剂连接至靶向部分上的单个附着位点。以此方式，多个试剂可以连接至靶向部分上的单个特定位点(如以上所讨论的，其可以经过工程改造)，或连接至反应性侧链所在的多个位点。在每种情况下，药物和接头的数目是至少1个，且上限可以由本领域技术人员通过实验来确定。可以确定接头和药物的最佳数目，但是这没有要求。例如，1个接头可以连接多个治疗剂(树枝状聚合物)，且具有多个接头的edc可以具有一部分不含治疗剂的接头。

通过实验测量，例如通过在用于确定得到的本发明edc的活性的测定中试验多个接头长度，可以确定最佳接头长度。例如，如果接头长度过短(不允许药物和靶向部分同时到达它们的结合位点)，可以容易地鉴别和纠正该问题以提供本发明的edc。通常，接头长度是在约50至约500埃、或约50至约200埃的范围内。选择接头长度和组成以确保edc在循环结构中保持稳定(其中酶和其它环境物质否则可能将它分解)，并反映从靶向部分结合它的抗原的地方至试剂作用于它的靶标的地方之间的距离。多种符合这些要求的接头是可得到的或可合成的，这会建立非常大的本发明提供的edc类别，特别是当考虑在本发明的edc中可以采用的多种接头、治疗剂和靶向部分时。

因而，本发明的edc可以利用多种稳定的或不可切割的接头中的任一种。

v.治疗剂(药物)

多种治疗剂适合用在本发明的edc中。例如，但不限于，所述治疗剂可以是具有抗肿瘤、抗血管生成或抗炎治疗活性的试剂。优选地，治疗剂(例如，药物)与接头连接的位点是在接头连接仅微小地干扰或者根本不会干扰治疗剂活性的位置处。在本发明的edc中使用的试剂会结合或以其它方式与靶标相互作用，所述靶标与na,k-atp酶结合且紧密邻近或者是na,k-atp酶的一部分。在不同的实施方案中，本发明的edc具有结合na,k-atp酶的α亚基的的类固醇药物。

通常，所述试剂是直接作用于na,k-atp酶(例如，在α亚基处)的“非内化治疗剂”。在本发明的不同实施方案中，所述试剂或药物是强心苷的糖苷配基。在本发明的其它实施方案中，所述试剂的作用是抑制na,k-atp酶和与其结合的细胞表面途径信号传导蛋白之间的相互作用。

本领域技术人员会明白，尽管本公开内容主要关于含有靶向部分(其靶向与na,k-atp酶结合的蛋白)和治疗剂(其靶向na,k-atp酶)的edc解释了本发明，本发明也提供了相反类型的edc。在本发明的该实施方案中，靶向部分的靶标是na,k-atp酶，且所述试剂作用于与na,k-atp酶结合的蛋白。对na,k-atp酶特异性的合适抗体和其它靶向部分和结合na,k-atp酶的α亚基的合适治疗剂描述在pct公开号2011/021870和pct申请号us2012/028585中。

试剂负载表示在edc中的每个靶向部分(例如，抗体)的治疗剂的平均数目。在每个接头连接至1个治疗剂的情况下，治疗剂的平均数目等于靶向部分上的接头的平均数目。如果靶向部分是抗体(ab)，例如在将1、2、3、4、5、6、7和8个治疗剂共价连接至抗体的情况下，试剂负载的范围通常是1-8个试剂/靶向部分。因而，edc的组成包括缀合了一定范围(1-8个)的药物的抗体的集合。通过常规方式，诸如质谱法、elisa测定、电泳和hplc，可以表征得自缀合反应的edc制品中每个抗体的药物的平均数目。通过elisa，可以确定在特定edc制品中的治疗剂的平均值(hamblett等人(2004)clinicalcancerres.10:7063-7070；sanderson等人(2005)clinicalcancerres.11:843-852)。但是，通过基于elisa的方法，不可能鉴别与抗体缀合的治疗剂和/或接头的位置。在某些情况下，通过诸如反相hplc或电泳等方式，可以实现同质edc(其中治疗剂的数目是相同的，但是在抗体上的位置可能是不同的)的分离、纯化和表征。

作用于na,k-atp酶的edc靶向试剂的有利性质包括：(i)增加的效能，因为靶向部分可以降低ed50值；(ii)降低的毒性，因为所述试剂优先靶向与靶向部分的靶标结合的na,k-atp酶，而不是一般地靶向na,k-atp酶；和/或(iii)增加的药代动力学，因为抗体可以增加缀合的试剂的半衰期值，抗体可以增强对药物的efr(增强的渗透性和保留)作用，且抗体可以保持某些试剂免于被隔离在蛋白或脂质中。

在许多情况下，治疗剂具有与针对特定适应症指定的活化靶标无关的副作用。这样的副作用是已经归因于许多分子本性的复杂现象学观察，包括与脱靶结合的直接相互作用[参见keiser,mj,等人.nature462,175(2009),blagg,annu.rep.med.chem.41,353(2006),toxicityanddrugdiscov.today10,1421(2005)]。当没有与某些指定的蛋白或环境形成复合物时，其它靶标或相同靶标的随后活化可以导致有害的副作用。

几篇论文提示，靶向na,k-atp酶的试剂可能具有多个生理学靶标[参见(bmcstructuralbiology2010,10:12)和(currentmedicinalchemistry,2011,18,872-885)和(frontiersinbioscience14,2130-2148,2009年1月1日)]，从而指示这样的药物不可能在没有不可接受的副作用存在下使用。但是，根据本发明的方法和edc，利用na,k-atp酶的与多个蛋白形成复合物的能力和可以产生的不同相互作用和信号来提供多种药物和治疗干预。例如，na,k-atp酶与特定蛋白的结合随细胞和疾病类型而变化，从而使得本发明的edc靶向多种不同的细胞和疾病。

本发明的该重要益处的证据包括以下事实：已知强心苷对心脏、脑和其它器官具有负面或正面作用。现在已知这些作用不仅取决于试剂的局部浓度和试剂的类型以及na,k-atp酶的细胞位置，而且取决于na,k-atp酶与其结合或形成复合物的蛋白。因而，通过靶向有关的蛋白，可以仅将本发明的edc导向选定的细胞或疾病细胞类型。

除了已知直接地靶向na,k-atp酶(诸如强心苷)的药物以外，存在这样的药物：在本发明之前，其被认为结合或影响除了na,k-atp酶以外的蛋白，但是现在考虑到本公开内容，已知其会经由na,k-atp酶而实现它们的作用。一个这样的例子是药物格列本脲(glibenclamide)，也被称作格列本脲(glyburide)，其用于治疗ii型糖尿病。证实了酶促地和在电生理学上测量的na,k-atp酶活性会被格列本脲抑制(ribalet,b.等人.jgenphysiol.1996年2月；107(2):231-41)。因此，在本发明的edc的其它实施方案中，所述试剂是格列本脲衍生物。另一个例子是试剂黄体酮，考虑到本公开内容，认为其结合na,k-atp酶的α1-亚基的第一个外部环，这会增量调节磷脂n-甲基转移酶(参见，steroids.2008年1月；73(1):27–40)。雌激素和黄体酮都同样对脑中和许多其它组织中的na-k-atp酶泵表现出显著抑制作用(labella等人.fedproc44:2806-2811)。

因此，尽管在本发明的edc的许多实施方案中，所述试剂是调控na,k-atp酶的活性的类固醇，但是在其它实施方案中，所述试剂是另一种化合物。类固醇的例子包括洋地黄毒苷配基、海葱苷宁和皮质类固醇。这样的其它化合物的例子包括、但不限于选自以下的化合物：黄体酮、血管生成抑制因子、小檗碱、格列本脲、5-羟基癸酸酯、二甲基草酰基(oxallyl)甘氨酸和紫苏子醇(参见，amjcardiovascdrugs；7(2):135-41(2007)；endothelium,9:3-10,(2002)；molcellbiochemdec；306(1-2):231-7(2007)；jgenphysiol107(2):231-41(1996)；nat.genet.18,219-224(1998)；molcellbiochemdec；306(1-2):231-7(2007)；molcellbiochem345:29–34(2010)；steroids73(1):27–40(2008))。在不同的实施方案中，所述试剂是通道阻滞剂；在其它实施方案中，所述试剂不是通道阻滞剂。

但是，在许多实施方案中，edc中的药物是强心苷的糖苷配基。合适的强心苷包括，例如，但不限于，已经被批准用于人用的强心苷，处于临床试验中的强心苷，和在pct公开号2010/017480和2011/031870和pct申请号us2012/028585(通过引用并入本文)中描述的强心苷。对于强心苷(和其它试剂)，使用术语治疗指数将实际的治疗效果与脱靶毒性副作用进行对比。潜在抗癌药物的一个例子是洋地黄毒苷，其具有强抗肿瘤活性，但是具有高心脏毒性(参见，goldin.digitalisandcancer.lancet1984；1:1134)。因此，尚未发现单独的药物作为抗癌剂在人类中是有效的。不同的强心苷试剂(诸如洋地黄毒苷、地高辛或海葱次苷和它们的糖苷配基)可用在本发明的不同实施方案中。已经报道这样的强心苷会对几种不同癌症类型表现出细胞毒性活性，但是处于在患者中具有心脏毒性效应的浓度[参见felth,j.等人.j.nat.prod.72,1969(2009)]。强心苷是一类源自洋地黄属(digitalis)植物毒毛旋花子(strophanthus)和其它植物的药物，其数百年来已经被用于治疗充血性心力衰竭和心律失常。在这些病症中，强心苷结合na,k-atp酶并抑制它的泵送活性。在过去十年中进行的研究表明，强心苷具有抗癌剂活性[mijatovic等人(2007)biochimbiophysacta1776:32-57和pct公开号2010/017480]。

因而，在本发明的不同实施方案中，edc中的治疗剂是强心苷的糖苷配基。在本发明的一个实施方案中，所述试剂是海葱苷宁。在另一个实施方案中，所述试剂是洋地黄毒苷配基。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂是含有在位置c-3的羟基、胺或硫基的类固醇。在本发明的不同实施方案中，所述类固醇是在pct公开号wo2010/017480中鉴别的化合物或其糖苷配基。合适的类固醇药物的非限制性例子包括下面式i的那些以及它们的药学上可接受的酯、衍生物、缀合物、水合物、溶剂合物、前药和盐，或前述任意的混合物：

其中甾体环是饱和的、不饱和的或它们的组合，

r还可以是在不同的皮质类固醇上存在的侧链，诸如choch3、o、oh或支链烷烃。r^a是ch3；r^b是ch3、ch2oh或cho；rc是h、oh或ch3coo；rd是h、oh或ch3coo；re是h或没有基团；rf是h、oh，或者当re是h或c＝c存在于连接至re、rf和rg的原子之间时，rf是没有基团；rg是h，或者当re是h或c＝c存在于连接至re、rf和rg的原子之间时，rg是没有基团；rh是h或oh；x是o、s或n(or’、sr’、nr’)；且r’是烷基或芳基。

vi.edc构建、筛选和具体实施方案

本发明提供了edc，其包含经由稳定的(且，在某些实施方案中，不可切割的)接头连接至治疗剂的靶向部分，且其不需要药物和靶向部分解离即可发挥效力。本发明的edc包含：(i)靶向部分，其靶向细胞表面上的信号传导途径蛋白，所述蛋白与na,k-atp酶相互作用(形成复合物)且与na,k-atp酶紧密邻近，(ii)稳定的或不可切割的接头，和(iii)治疗剂，其靶向na,k-atp酶或靶向na,k-atp酶或相互作用蛋白上的位点，在所述位点处的结合会阻断或以其它方式调控该相互作用。本发明的edc也包括含有以下元件的edc：(i)靶向部分，其靶向na,k-atp酶，(ii)稳定的或不可切割的接头，和(iii)治疗剂，其靶向细胞表面上的信号传导途径蛋白(其与na,k-atp酶相互作用且与na,k-atp酶紧密邻近)，或者靶向na,k-atp酶上的位点，在所述位点处的结合会阻断或以其它方式调控该相互作用。在所有这些情况下，可以如下表示edc：(靶向部分)-(接头)-(治疗剂)。

通过几种途径中的任一种，采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，可以制备本发明的edc，包括：(1)使靶向部分的亲核基团或亲电子基团与二价接头试剂经由共价键反应以形成抗体-接头中间体，随后与活化的试剂反应；和(2)使试剂的亲核基团或亲电子基团与接头试剂经由共价键反应以形成药物-接头中间体，随后与靶向部分的亲核基团或亲电子基团反应。可以与多种靶向部分、试剂和接头一起使用缀合方法(1)和(2)，以制备本发明的edc。可替换地，可以以药物-接头试剂的形式合成药物和接头，所述药物-接头试剂又偶联至抗体以产生本发明的edc(参见下面的实施例1)。在该实施方案中，在每个步骤中使用接头的亚组分，诸如糖苷或peg间隔臂，可以在多个步骤中将接头连接至药物。

在抗体和其它靶向部分上的亲核基团例如包括、但不限于：(i)n-端胺基，(ii)侧链胺基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羟基或氨基，其中所述抗体被糖基化。胺、硫醇和羟基是亲核的，且能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯诸如nhs酯、hobt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基和苄基卤诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。某些抗体具有可还原的链间二硫键，例如半胱氨酸桥。通过用还原剂诸如dtt(cleland氏试剂,二硫苏糖醇)或tcep(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(getz等人(1999)anal.biochem.vol273:73-80；soltecventures,beverly,mass.)处理，可以使抗体可反应用于与接头试剂缀合。每个半胱氨酸二硫键在理论上将如此形成2个反应性的硫醇亲核体。通过赖氨酸与2-亚氨基四氢噻吩(硫杂环戊烷)(traut氏试剂)的反应，可以将其它亲核基团引入抗体中，导致胺转化成硫醇。

也可以如下生产edc：修饰抗体以引入亲电子部分，该部分可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应。例如用高碘酸盐氧化试剂，可以氧化糖基化的抗体的糖，以形成可与接头试剂或药物部分的胺基反应的醛或酮基团。得到的亚胺希夫碱基团可以形成稳定键，或者可以被例如硼氢化物试剂还原以形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或高碘酸钠的反应可能在蛋白中产生羰基(醛和酮)基团，所述基团可与药物上的适当基团反应(hermanson,g.t.(1996)bioconjugatetechniques；academicpress:newyork,p234-242)。在另一个实施方案中，含有n-端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白可以与高碘酸钠反应，导致替代第一个氨基酸的醛的产生(geoghegan和stroh,(1992)bioconjugatechem.3:138-146；美国专利号5,362,852)。这样的醛可以与药物部分或接头亲核体反应。

同样地，在药物部分上的亲核基团包括、但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，其能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯诸如nhs酯、hobt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基和苄基卤诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。

在一个实施方案中，通过组合合成和筛选来构建本发明的edc。可以构建通过不可切割的或稳定的接头连接的靶向部分和试剂的文库或组合，并筛选以鉴别本发明的特定edc。在一个实施方案中，将单个非内化试剂连接至靶向部分文库，并针对特定治疗效果进行筛选以鉴别本发明的edc。在一个实施方案中，将单个非内化靶向部分连接至试剂文库，并针对特定治疗效果进行筛选以鉴别本发明的edc。在一个实施方案中，将非内化试剂文库连接至靶向部分文库，并针对特定治疗效果进行筛选以鉴别本发明的edc。

通过许多根据本发明的一个方面的方法，可以鉴别除了本文描述的那些以外与na,k-atp酶相互作用的紧密邻近靶标。在一个这样的方法中，将抗体文库缀合至结合na,k-atp酶的药物，并针对不同的活性诸如细胞毒性、细胞增殖或期望蛋白或小分子(诸如激素)的表达或排泄进行筛选。因为常规的酵母双杂交系统不适合用于检测膜蛋白之间的相互作用，在本发明的另一个方法中，采用分裂-泛素膜酵母双杂交系统，其允许检测嵌膜蛋白和它的配偶体之间的相互作用(ohno等人,amjphysiolcellphysiol2011300:c1047–c1054)。通过交联研究、或通过在模型系统中试验它们的相互作用、或通过在模型细胞和运行试验中除去蛋白之一以分析结果，也可以根据本发明鉴别与na,k-atp酶形成复合物的紧密邻近蛋白。当可得到特异性抗体时，靶蛋白与它的非共价结合蛋白配偶体一起的免疫沉淀，例如，共免疫沉淀(co-ip)，已经成为通常使用的用于鉴别围绕靶蛋白的潜在相互作用蛋白的技术。co-ip方法已经产生了在酵母、哺乳动物和许多其它生物体中的大规模蛋白相互作用数据，并且用正交方法对这些结果中的许多的验证证实了这些方法的实用性。与免疫沉淀偶联的化学交联会提供蛋白-蛋白相互作用的体内鉴别的替代策略，其已经被广泛地评论。交联反应可以用完整细胞实现，并用稳定共价键在化学上“冻结”蛋白-蛋白相互作用，这允许以后在更苛刻的或更严谨的条件下进行纯化步骤。结果，可以大幅减少非特异性结合。另外，与交联结合的免疫沉淀非常适合用于研究膜蛋白的相互作用。膜蛋白的分离和纯化通常要求使用去污剂，所述去污剂有时可以破坏膜蛋白之间的相互作用。因而，在膜蛋白的免疫沉淀之前用交联剂稳定化复合物会显著增加鉴别出与抗原结合的蛋白的机会。

本领域技术人员知道如何化学交联结合的或复合的靶标。例如，通过将样品与交联剂一起温育，可以揭示蛋白-蛋白接触。通过sds-page或通过hplc，可以检测和分离复合物。分离以后，可以消化靶标，并通过质谱法进行分析以确定片段分子质量，并输入数据库中，或通过计算机算法诸如x！link(参见lee等人,j.proteomeres.2007oct；6(10):3908-17)确定形成紧密邻近靶标的实际蛋白。采用与免疫沉淀偶联的具有附加疏水性的化学交联剂也是用于描绘细胞膜中的蛋白-蛋白相互作用图谱的实用策略(tang等人,mol.biosyst.,2010,6,939-947)。可以使用用针对两种蛋白的荧光染料对标记的抗体来证实紧密邻近。发现与这类靶标紧密邻近的药物和靶向部分的方法如上面关于存在于相同蛋白上的靶标所述。

通过经由稳定的和/或不可切割的接头将药物和靶向部分彼此连接，制备本发明的edc。一般而言，所述接头的长度应当不小于50埃，且更通常地长度为100埃，但是长度可以长至500埃。然后使用本领域技术人员已知的标准亲和方法、尺寸排阻方法、过滤方法或其它方法，从未偶联的药物、接头和靶向部分中纯化出由药物、接头和靶向部分(都彼此共价连接)组成的edc。

构建特定edc以后，可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的任一种来筛选它。在药物和靶向部分的靶标存在于不同蛋白上的情况下，这些靶标可以仅仅在某些细胞类型上紧密邻近，因而进行多个筛选以确定特异性和哪个细胞类型具有紧密邻近的靶标。这些包括、但不限于本领域已知的多种体外和体内方法。可以以中间或高通量筛选形式先后地和个别地或平行地筛选edc。为了用于疾病或障碍的预防性或治疗性处理而筛选edc的速率仅受限于合成或筛选方法的速率，包括数据的检测/测量/分析。

通常，首先进行体外筛选。例如，首先如下测量edc的细胞毒性的或细胞生长抑制性的活性：在细胞培养基中，将试验细胞(例如具有肿瘤相关抗原或受体蛋白的哺乳动物细胞)暴露于edc的抗体；将所述细胞培养约6小时至约5天的时段；和测量细胞生存力(或其它性质)。使用基于细胞的体外测定来测量生存力，例如增殖(ic50)、细胞毒性(ec50)和edc对细胞凋亡(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化)的诱导。

对于体内试验，转基因的动物和细胞系在筛选抗体-药物缀合物(edc)中是特别有用的，所述抗体-药物缀合物具有作为疾病或障碍的预防性或治疗性处理的潜力，所述疾病或障碍涉及肿瘤相关抗原和细胞表面受体例如her2(美国专利号6,632,979)的过表达。筛选有用的edc可能包括：将一定剂量范围内的候选edc施用给转基因动物，和在不同的时间点测定edc对评价的疾病或障碍的影响。可替换地，或者另外，可以在暴露于疾病的诱导物之前或同时(如果适用的话)施用药物。

在多种实施方案中提供了本发明的edc。如以上所讨论的，edc的靶向部分的靶标通常是与na,k-atp酶复合的蛋白，且所述试剂的靶标是na,k-atp酶。靶向部分和治疗剂当连接到一起时协同地起作用，因为edc比单独地或联合地使用的靶向部分或药物(作为2个单独的不同的试剂)更有效地治疗目标病症。因而，本发明的edc的靶向部分的靶标和试剂的靶标都是细胞外的。本发明的edc包含非内化靶向部分，其通过稳定的或不可切割的接头连接至试剂。因而，本发明的edc不需要内化即可发挥治疗效果。选择本发明的edc中的接头，以允许靶向部分和试剂结合或作用于它们的靶标(当复合在一起时)，无需接头切割。edc的靶向部分和治疗剂因而同时结合以产生期望的治疗效果。因而，edc中的接头足够长，以允许靶向部分和试剂的同时结合(当它们各自的靶标复合在一起时)。通过稳定的或不可切割的接头相连的edc的靶向部分和治疗剂作用于不同的靶标。

在不同的实施方案中，所述靶抗原是在肿瘤细胞、间质细胞、肿瘤内皮细胞、诸如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞等细胞上，或者否则是与癌症、炎症反应、糖尿病或疼痛有关的抗原。将本发明的edc施用给患者，穿过血流承载，且当在靶细胞或抗原附近时，经由靶向部分结合靶抗原，并同时地或并行地结合药物的靶标以产生期望的治疗效果。在不同的实施方案中，本发明的edc包含识别靶标的靶向部分，所述靶标与转移性患病细胞有关且与那些患病细胞中的na,k-atp酶形成复合物。

本发明提供了edc，其包含：结合na,k-atp酶以损害它的正常功能的试剂，稳定的或不可切割的接头，和识别蛋白的靶向部分，所述蛋白与na,k-atp酶离子转运蛋白复合物形成复合物。na,k-atp酶的特征在于，由它的α-、β-和γ-亚基的多个异形体的表达和差异结合引起的复杂分子异质性(参见在am.j.physiol.275(renalphysiol.44):f633–f650,1998中的综述)。na,k-atp酶属于广泛分布类型的p-型atp酶，其负责多种阳离子跨细胞膜的主动转运。目前，已经在哺乳动物细胞中鉴别出多达4种不同的α-异形体、3种不同的β-异形体和9种不同的γ-异形体。在进化和它们的表达的组织特异性的和发育模式的过程中对复合物的异形体的结构的严谨约束提示，不同的na,k-atp酶复合物已经进化不同的性质以对细胞要求做出应答。α-亚基的不同异形体以不同水平在不同细胞类型上表达，且不同地行为。α-亚基含有阳离子的结合位点、atp、src激酶、和不同的治疗剂。一些试剂源自心脏糖苷类分子。因此，在本发明的不同实施方案中，α-亚基充当本发明的edc的试剂的靶标，且所述试剂是强心苷或强心苷的糖苷配基。

具体地，由于它们的抗心律失常作用，强心苷类分子已经在治疗上主要用于治疗心力衰竭。最近确定这类药物也具有抗癌活性，然而，由于在需要的水平的心脏毒性，作为抗癌药物的用途尚未得到批准。因而，将这类分子远离心脏和朝向癌细胞靶向是有益的。因此，在本发明的一个实施方案中，强心苷衍生物或强心苷的糖苷配基是本发明的edc的药物。在一个实施方案中，这些edc包含作为强心苷类小分子的成员的药物(或其糖苷配基部分)。在本发明的不同实施方案中，通过稳定接头将强心苷或有关的试剂连接至抗体，所述抗体将靶向药物癌性组织，从而提供治疗上有用的用于治疗癌症的本发明的edc。

在本发明的一个实施方案中，将强心苷cen-09-106或它的对应的糖苷配基海葱苷宁通过接头连接至抗体，所述抗体结合与na,k-atp酶形成复合物的蛋白。在一个实施方案中，将海葱苷宁糖苷配基通过具有peg间隔臂的糖苷接头连接至抗体，所述抗体结合与na,k-atp酶形成复合物的细胞表面信号传导途径蛋白。在本发明的另一个实施方案中，将强心苷cen-09-106或海葱苷宁通过接头连接至抗体，所述抗体结合与na,k-atp酶紧密邻近的蛋白。在本发明的另一个实施方案中，将强心苷cen-09-106或海葱苷宁通过peg接头或间隔臂连接至抗体，所述抗体结合与na,k-atp酶形成复合物的蛋白。在本发明的另一个实施方案中，将强心苷cen-09-106或海葱苷宁通过peg接头或间隔臂连接至抗体，所述抗体结合与na,k-atp酶紧密邻近的蛋白。在本发明的另一个实施方案中，将强心苷cen-09-106或海葱苷宁通过peg24接头或间隔臂连接至抗体，所述抗体结合与na,k-atp酶形成复合物的蛋白。在本发明的另一个实施方案中，将强心苷cen-09-106或海葱苷宁通过peg24接头或间隔臂连接至抗体，所述抗体结合与na,k-atp酶紧密邻近的蛋白。

本发明也提供了包含与强心苷连接的靶向部分的edc，所述强心苷可以用作抗炎剂或用于治疗其它疾病。na,k-atp酶亚基异形体/调节剂在囊性纤维化患者的肺中的分布和水平不同于正常肺的那些，且所以是针对囊性纤维化过度炎症的治疗剂的靶标。结合na,k-atp酶的强心苷可以通过nf-κb抑制剂的特异性抑制磷酸化而抑制得自培养的cf上皮细胞的il-8的分泌过多(参见srivastava等人proc.natl.acad.sci.usa2004,101,7693-7698，通过引用并入本文)。强心苷的潜在治疗用途的综述讨论了肥胖、肾脏疾病、偏头痛、癫痫、张力失常、帕金森症(2007journalof内科学261；44-52)。因此，本发明的edc可以用于治疗所有这些病症。

可以与na,k-atp酶相互作用以调控细胞信号传导途径的本发明的edc的靶向部分的靶标的示例性列表包括：cd147、lat1、asct2、cd98、prp、epcam、mct1、整联蛋白(例如，cd29(整联蛋白β1))、cd166、cd44(hcell)、cd71、cd56、cd87、(tfr1)、sel-1、igfr、c-met、fgfr、pdgfr、glur2、5-羟色胺转运蛋白、5-ht1a受体、gabaa受体、eaat、tlr4、t-细胞受体、mtnfα(跨膜)、pla2、rankl、胰岛素受体、pe-nmt、血管紧张素ii受体、atp-敏感的k通道、pe-nmt、血管紧张素受体、tnf-α、insp3r、rs1或α-klotho。另外，可以与na,k-atp酶相互作用以调控与特定疾病状态有关的细胞信号传导途径的本发明的edc的靶向部分的靶标的示例性列表包括：癌症-cd147、lat1、asct2、cd98、prp、epcam、mct1、整联蛋白(例如，cd29(整联蛋白β1))、cd166、cd44(hcell)、cd71、cd56、cd87、(tfr1)、sel-1、igfr、c-met、fgfr、pdgfr；神经障碍-cd147、prp、mct1、glur2、5-羟色胺转运蛋白、5-ht1a受体、gabaa受体、eaat；炎症性障碍(例如腹泻、人炎性肠病、类风湿性关节炎)-tlr4、t-细胞受体、mtnfα(跨膜)、pla2、rankl；糖尿病/肥胖-胰岛素受体、pe-nmt、血管紧张素ii受体、atp-敏感的k通道；心血管疾病-整联蛋白、pe-nmt、血管紧张素受体；免疫抑制/免疫介导的疾病/炎症-tlr4、t-细胞受体、pla2、tnf-α、insp3r；缺血性损伤-整联蛋白、黄斑变性：rs1；老化/蛋白缺乏-α-klotho；银屑病-cd147。参见，例如，molecular&cellularproteomics4:1061–1071,2005,cancergenomicsandproteomics，2010年5-6月，第7卷第3期157-169,currentcancerdrugtargets,2010,10,287-306,jcellphysiol208(1):23–38,2006,jbiochem282(45):32792–32801,2007,physiolrev87:593–658,2007,hummolgenet.2011年3月15日；20(6):1132-42,plosbiol.2005年12月；3(12):e423,j.neuroscience,2007年11月7日,27(45):12331–12340,shakibaei和mobasheri(2003)histolhistopathol18,343-351,jamsocnephrol17:1503–1520,2006.,biochemistry.2000年12月5日；39(48):14877-83.,kidneyinternational78,1119-1127(2010年12月1日),geriatrgerontolint2010；10(增刊1):s80–s87,clinicrevboneminermetab(2008)6:31-36,j.biol.chem.第274卷,第37期,第26287–26295页,1999年9月10日,archbiochembiophys.1985年4月；238(1):315-24.,bmcstructuralbiology2010,10:12,amjphysiol.1988年9月；255(3pt1):e347-52.,jpharmacolexpther，1988年5月，245:664-672,arteriosclerthrombvascbiol.2009年9月；29(9):1349-55.2009年6月11日电子出版,amjphysiolrenalphysiol290:f241–f250,2006,nengljmed.2010年4月22日；362(16):1477-90,j.pharm.exp.ther.jpet285:835–843,1998,jgenphysiol.1996年2月；107(2):231-41.,circulation.2010；122:a16963,antiviralresearch79(2008)62–70,hum.mol.genet.(2011)20(1):90-103,cho等人.j.cellularbiochem.2010111:1252-1259,j.neurosci.,june24,2009,29(25):8143–8155,thejournalofdermatology,第37卷,第12期,第1053–1056页,2010年12月。本发明的edc的靶向部分的靶标可以是与na,k-atp酶相互作用的细胞外靶标，包括所述细胞外靶标与na,k-atp酶紧密邻近或与na,k-atp酶复合。提供了用于检测na,k-atp酶与细胞外靶标的相互作用(例如，紧密邻近或形成复合物)的方法和试剂，包括如上所述的示例性靶标。通常，这些方法采用抗体-药物缀合物(adc)，其中所述抗体靶向细胞外靶标，诸如在目标细胞表面信号传导途径中涉及的靶标，且所述药物靶向na,k-atp酶，且二者通过稳定的或不可切割的接头连接。然后在体外和/或在体内与适当的对照(抗体和药物)一起试验该adc，以确定所述adc是否对一种或多种目标细胞类型发挥比单独的抗体或药物更有效的和/或更特异性的作用，诸如细胞毒性或细胞生长的抑制、增殖或分化。如果确定adc发挥比单独的抗体或药物更有效或更特异性的作用，那么确定所述抗体靶向的细胞外靶标(例如细胞表面蛋白)会与这样的目标细胞类型中的na,k-atp酶相互作用。

因而，本发明的edc存在众多靶向部分靶标，其中所述药物靶向na,k-atp酶。例如，但不限于，在药物是有效的但是药物的特异性使得脱靶副作用、低活性、差药代动力学、药物抗性(例如mdr介导的药物抗性)或其它问题存在的情况下，和在通过接头将药物连接至靶向部分会显示出治疗效果改善的情况下(对于强心苷，通常如此)，本发明的edc是有用的。本发明的edc包括这样的edc：其中试剂和靶向部分协同地起作用以增强期望的治疗效果。例如，但不限于，在所述试剂的更好特异性是合乎需要的情况下(对于强心苷，仍然如此)，本发明的edc也是有用的。当所述试剂的靶标可能存在于许多不同类型的正常细胞和患病细胞上但是仅仅作为复合物或与靶向部分在目标患病细胞上的靶标紧密邻近时，也是如此。

本发明的edc也包括这样的edc：其包含识别靶抗原的一部分或亚基或异形体的靶向部分，所述靶抗原优先存在于在患病的或被靶向的组织区域中或附近的细胞上。这些靶抗原包括作为在患病的或被靶向的组织区域中的突变的、差别地表达的或异常地糖基化的蛋白(相对于在正常组织中的那些相同蛋白)的那些靶抗原。

在不同的实施方案中，edc通常可用于研究目的。本发明源自下述发现：na,k-atp酶会结合多种不同的蛋白以调控对于多种细胞而言关键性的且因此涉入巨大量疾病中的细胞信号传导途径。尽管本公开内容解释了na,k-atp酶/蛋白相互作用的众多这样的例子，无疑存在更多的例子。例如，用于将强心苷连接至目标抗体的方便试剂，以及已经连接至强心苷的edc，是本发明提供的可以用于这样的研究的有用试剂。

本发明的edc也可以用在用于确定蛋白是否与细胞表面上的na,k-atp酶形成复合物的方法中。在某些实施方案中，所述方法可以包括：使所述细胞与本发明的edc接触，并确定所述edc是否对所述细胞具有作用(例如，细胞生存力或增殖的下降)，所述作用不同于使所述细胞与靶向部分或治疗剂接触的作用。在所述edc对细胞的作用不同于使所述细胞与靶向部分或治疗剂接触的作用的情况下，可以认为所述蛋白与na,k-atp酶复合。

在本发明的不同实施方案中，所述edc通常可用于治疗癌症、囊性纤维化和许多其它疾病。对于癌症治疗而言，疾病的例子包括：乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌和胰腺癌。具体地，可以实现下述肿瘤类型之一的治疗：b-细胞成淋巴细胞性白血病、t-细胞成淋巴细胞性白血病、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、滤泡淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、黑素瘤、眼黑素瘤、皮肤黑素瘤、结肠腺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、卵巢癌、前列腺腺癌、肝癌、移行细胞癌、胰腺腺癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌。

在一个实施方案中，本发明提供了一种edc，其由结合cd147的抗体和结合na,k-atp酶的α-亚基的类固醇药物组成。实施例2解释了这样的edc。这些edc可用于治疗癌症，包括、但不限于小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、黑素瘤和骨髓瘤。

在一个实施方案中，本发明提供了一种edc，其由结合cd44的抗体和结合na,k-atp酶的α-亚基的类固醇药物组成。实施例3解释了这样的edc。这些edc可用于治疗癌症，包括、但不限于非小细胞肺癌和胰腺癌。

在一个实施方案中，本发明提供了一种edc，其由结合cd98的抗体和结合na、k-atp酶的α-亚基的类固醇药物组成。实施例4解释了这样的edc。这些edc可用于治疗癌症，包括、但不限于非小细胞肺癌、胰腺癌、头颈癌、小细胞肺癌和骨髓瘤。

在一个实施方案中，本发明提供了一种edc，其由结合cd87的抗体和结合na,k-atp酶的α-亚基的类固醇药物组成。实施例5解释了这样的edc。这些edc可用于治疗癌症，包括、但不限于黑素瘤。

在一个实施方案中，本发明提供了一种edc，其由结合cd230的抗体和结合na,k-atp酶的α-亚基的类固醇药物组成。实施例6解释了这样的edc。这些edc可用于治疗朊病毒疾病、阿尔茨海默氏病和癌症，包括、但不限于非小细胞肺癌和黑素瘤。

在一个实施方案中，本发明提供了一种edc，其由结合cd56的抗体和结合na,k-atp酶的α-亚基的类固醇药物组成。实施例7解释了这样的edc。这些edc可用于治疗癌症，包括、但不限于小细胞肺癌。

在不同的实施方案中，本发明提供了结合非nak-atp酶的细胞外靶标的方法，所述方法包括：使表达靶标的细胞与本文中公开的edc接触。

在不同的实施方案中，本发明提供了结合非nak-atp酶的细胞外靶标的方法，所述方法包括：给受试者施用一定量的本文中公开的可有效地结合所述靶标的edc。

部分viii描述了本发明的药物制剂和施用它们以治疗疾病和其它医学病症的方法。

vii.药物制剂

根据本发明的化合物或制剂(例如，包含公开的edc的化合物或制剂)的施用，可以通过对于治疗剂而言被接受的且通常本领域已知的施用方法中的任一种来实现。这些方法包括、但不限于全身性施用，例如通过胃肠外的、口服的、鼻的或表面的施用。胃肠外施用通常通过皮下、肌肉内或静脉内注射或通过灌注来实现。一般而言，通常静脉内地施用基于抗体的治疗剂。可以以标准形式(在混悬液或液体溶液中，或以适合用于在液体中即时溶解的固体形式)制备可注射的组合物。在一个实施方案中，胃肠外施用使用具有缓慢释放或延时释放的系统的设备，其确保恒定剂量水平的维持。对于鼻内施用，可能使用本领域技术人员众所周知的合适的鼻内媒介物。所述口服施用可以借助于片剂、胶囊剂、软胶囊剂(包括具有延迟释放或延时释放的制剂)、丸剂、粉剂、颗粒、酏剂、染料、混悬液、糖浆剂和乳剂来实现。该形式的呈现更特别适合穿过肠屏障。

根据本发明的化合物或制剂的施用剂量根据多种因素来选择，所述因素包括：受试者的类型、血统、年龄、重量、性别和医学病症；要治疗的病症的严重程度；施用方法；受试者的肾和肝功能的状况以及使用的特定化合物或盐的性质，并且可以使用已知的试验方案或通过从体内或体外试验或诊断数据外推而经验地确定。进一步理解，对于任何特定个体，应当根据个体需要和施用或监督制剂给药的人员的专业判断随时间调节具体剂量方案。例如，通常有经验的医生会容易地确定和开出有效量的期望的化合物以预防、中断或停止要治疗的医学病症的进程。作为示例，当胃肠外地施用时，根据本发明的化合物的有效水平是在约0.002至约500mg/千克体重、更具体地约0.02mg至约50mg/千克体重的范围内，并每天、每周或每2周施用。

根据本发明的化合物或制剂可以以单独每日剂量的形式施用，或者可以以每天2剂、3剂、4剂或更多剂的剂量(例如，分份剂量)施用总日剂量。可以间歇地施用这样的剂量，例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20剂(例如约6剂)组合物或制剂)。可以施用最初较高的负荷剂量，继之以一个或更多个较低的剂量。一个示例性的给药方案包括：施用最初负荷剂量，继之以每周维持剂量。但是，其它剂量方案可能是有用的。更具体地，在某些实施方案中，剂量可以类似地在1-20mg/平方米(mg/m²)体表面积(bsa)的范围内，且可以每周或每2周施用该剂量。对于实体瘤，在某些实施方案中，剂量可以更高，例如，在200-600mg/m²bsa或约1-20mg/kg(例如，通过120-分钟静脉内输注来施用)和150-350mg/m²或1-10mg/kg(通过60-分钟静脉内输注来施用)范围内的初始剂量。因此，根据本发明的化合物的给药范围可以是1mg/m²至500mg/m²bsa的每天至每周剂量。

根据本发明的组合物或制剂可以经过灭菌和/或可以含有以下的一种或多种：无毒的佐剂和辅助物质，诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂；促进溶解的试剂；和调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可以含有提供治疗优点的其它物质。分别通过本领域技术人员众所周知的标准的混合、制粒或涂布方法来制备组合物。

本文中的本发明的化合物或制剂可以与第二种药物并行地、顺序地或交替地施用，或者在使用其它疗法没有应答性以后施用。因而，第二种药物的联合施用包括：共同施用，使用单独的制剂或单一药物制剂，和以任一种次序连续施用，其中优选地存在两种(或全部)疗法同时发挥它们的生物活性的时间段。多种第二药物可以与本发明的化合物联合使用。

在本发明的另一个实施方案中，提供了制品，其含有可用于治疗上述障碍的物质。在一个方面，所述制品包含：(a)容器，其包含本文中的化合物或制剂(优选地所述容器包含在所述容器内的edc和药学上可接受的载体或稀释剂)；和(b)包装说明书，其具有关于治疗患者中的障碍的说明。

本文还提供了用于评估本发明的edc的活性的方法。在一种方法中，可以使用靶向部分来识别本发明的靶向部分的靶标，但是最优选地，它是本文中公开的那些之一。这些方法之一是，评估本发明的抗体的靶标的存在的方法，所述方法包括：使得自肿瘤(诸如肺癌，但是包括所有肿瘤类型)的患者组织接触edc的单独靶向部分，并通过本领域已知的免疫组织学方法来分析结合。一种用于评估本发明的edc在肿瘤组织中的活性的方法包括：对得自肿瘤的患者组织进行荧光共振转移，以确定试剂的靶标和靶向部分的靶标是否紧密邻近。在该方法中，用一种荧光团标记靶向部分，用另一种荧光团标记的试剂靶标特异性抗体(或类似物)可以吸收特定波长的能量，并在不同的(但是同样特定的)波长重新发射能量。另一种用于评估edc在肿瘤组织中的活性的方法包括：对得自用edc处理过的肿瘤(诸如肺癌，但是包括所有肿瘤类型)的患者组织进行fdg-pet成像，然后确定单独的靶向部分是否抑制fdg向组织中的摄取。fdg摄取的抑制与本发明的edc在该方法中实现的延迟的肿瘤生长有关。用于进行成像和确定fdg摄取是否受到抑制的方法是本领域已知的。

通过适合要治疗的病症的任意途径，可以施用本发明的治疗性edc。通常胃肠外地(例如输注、皮下、肌肉内、静脉内、真皮内、鞘内、推注、肿瘤内注射或硬膜外)施用所述edc(shire等人(2004)j.pharm.sciences93(6):1390-1402)。通常用药学上可接受的胃肠外媒介物将edc的药物制剂制备成用于胃肠外施用，且呈单位剂量可注射形式。任选地与药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂一起混合具有期望的纯度程度的edc，呈低压冻干制剂或水溶液的形式(remington'spharmaceuticalsciences(1980)第16版,osol,a.ed.)。

可接受的胃肠外媒介物、稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在采用的剂量和浓度是对受体无毒的，且包括：缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如edta；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如tween^tm、pluronics^tm或聚乙二醇(peg)。例如，在wo97/04801(明确地通过引用并入本文)中描述了低压冻干的抗-erbb2抗体制剂。edc的一种示例性制剂含有约100mg/ml海藻糖(2-(羟基甲基)-6-[3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2--基]氧基-四氢吡喃-3,4,5-三醇；c12h22o11；cas编号99-20-7)和约0.1％tween^tm20(聚山梨酯20；十二烷酸2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)四氢呋喃-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基酯；c26h50o10；cas编号9005-64-5)，在大约ph6。

治疗性edc的药物制剂可以含有特定量的未反应的药物部分(d)、抗体(或其它靶向部分)-接头中间体(ab-l)和/或药物-接头中间体(d-l)，作为以下因素的后果：在制备edc的过程中，多余试剂、杂质和副产物的不完全纯化和分离；或在贮存散装edc或配制的edc组合物以后，时间/温度水解或降解。例如，它可能含有可检测的量的药物-接头或不同的中间体。可替换地，或者额外地，它可能含有可检测的量的未连接的游离靶向部分。一种示例性制剂可能含有至多10％摩尔当量的试剂接头的试剂，如通过体外细胞增殖测定所确定的，在某些情况下，药物-接头缀合物的细胞杀死不如游离药物有效。

也可以将活性药物成分捕集在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如，羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊剂)中或在微乳剂中。这样的技术公开在remington'spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.ed.(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有edc的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质是成形颗粒的形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物诸如luprondepot^tm(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。

要用于体内给药的制剂必须是无菌的，这通过穿过无菌过滤膜的过滤容易地实现。

所述制剂包括适合前述施用途径的那些。所述制剂可以方便地以单位剂型存在，且可以通过药学领域众所周知的任意方法来制备。技术和制剂通常参见：remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingco.,easton,pa.)。这类方法包括使活性成分与载体结合的步骤，所述载体构成一种或多种助剂。一般而言，如下制备所述制剂：使活性成分与液体载体或精细粉碎的固体载体或二者均匀地且亲密地结合，然后如果必要的话，使产品成形。

水性悬浮液含有与赋形剂混合的活性物质(edc)，所述赋形剂适合用于制备水性悬浮液。这样的赋形剂包括：助悬剂，诸如羧甲纤维素钠、交联羧甲纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和金合欢树胶，和分散剂或润湿剂诸如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如，十七乙烯氧基鲸蜡醇)，环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。所述水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂(诸如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。

edc的药物组合物可以呈无菌可注射制剂(诸如无菌的可注射的水性或油性混悬液)的形式。该混悬剂可以按照已知技术采用以上已经提及的那些合适的分散剂或湿润剂和助悬剂配制。所述无菌的可注射制剂也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射的溶液或混悬液，诸如在1,3-丁二醇中的溶液，或制备为低压冻干的粉末。可以使用的可接受的介质和溶剂是水、林格液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油可以常规地用作溶剂或悬浮介质。就该目的而言，可以使用任意的温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油单酯。另外，诸如油酸等脂肪酸同样可以用于制备可注射制剂。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将随治疗的宿主和特定给药模式而变化。例如，意图用于静脉内输注的水溶液可以含有约3-500μg活性成分/毫升溶液，以便可以以约30ml/小时的速率输注合适的体积。可以以约1.5ml或更小的总体积和约100mgedc/ml的浓度实现皮下(推注)施用。对于需要频繁和长期给药的edc，可以采用皮下途径，诸如通过预充式注射器或自动注射器装置技术。

作为一般前提，每剂施用的edc的初始药学有效量是在约0.01-100mg/kg的范围内，即约0.1-20mg/kg患者体重/天，使用的化合物的典型初始范围是0.3-15mg/kg/天。例如，可以以约1.0mgedc/千克患者体重初始施用给人患者。可以将剂量升高至最大耐受剂量(mtd)。给药方案可以是约每3周，但是根据诊断的病症或应答，所述方案可以是更多或更少的频率。在治疗过程中，可以进一步调整剂量为mtd或低于mtd，其可以安全地施用多个循环，诸如约4个或更多个。

适合用于胃肠外施用的制剂包括：水性的和非水性的无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与目标受体的血液等张的溶质；和水性的和非水性的无菌混悬液，其可以包括助悬剂和增稠剂。

尽管蛋白治疗剂的口服施用通常是不利的(由于差生物利用度，这归因于在肠中的有限吸收、水解或变性)，可以将适合用于口服施用的edc的制剂制备为离散单位诸如胶囊剂、扁囊剂或片剂，每个含有预定量的edc。

可以将所述制剂包装在单位剂量或多次剂量容器(例如密封的安瓿和管形瓶)中，且可以储存在冷冻干燥的(低压冻干的)条件下，仅需要在即将使用之前加入无菌的液体载体，例如注射用水。从以前描述的种类的无菌粉剂、颗粒和片剂制备即时注射溶液和混悬液。示例性的单位剂量制剂含有每日剂量或单位每日亚剂量(或其适当的比例)的活性成分。

本发明另外提供了兽医组合物，其包含至少一种如上定义的活性成分以及用于它的兽用载体。兽用载体是这样的材料：其对于施用组合物的目的而言是有用的，且可以是在兽医领域中否则是惰性或可接受的固体、液体或气体物质，且与活性成分相容。可以胃肠外地、口服地或通过任意其它期望的途径施用这些兽医组合物。

预见到，本发明的edc可以用于治疗不同的疾病或障碍，诸如在人或动物受试者中的癌症和自身免疫病症。在一个实施方案中，所述受试者是人。在另一个实施方案中，所述受试者是非人动物(例如，狗、猫、马、鸟等)。示例性的病症或障碍包括：良性或恶性肿瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤；其它障碍诸如神经元的、神经胶质的、星形胶质细胞的、下丘脑的、腺的、巨噬细胞的、上皮的、间质的、囊胚腔的、炎症性的、血管生成性和免疫学的障碍。

可以在荷瘤的高等灵长类动物和人临床试验中进一步试验在动物模型和基于细胞的测定中鉴别出的edc化合物。可以设计与测试效力的临床试验类似的人临床试验。可以与已知治疗方案(诸如涉及已知化疗剂和/或细胞毒性剂的辐射和/或化学疗法)组合地设计临床试验以评价edc的效力(pegram等人(1999)oncogene18:2241-2251)。在一个实施方案中，所述组合治疗剂选自：贝伐珠单抗；卡铂；顺铂；环磷酰胺；多西他赛注射剂；多柔比星；依托泊苷；磷酸依托泊苷；健择(盐酸吉西他滨)；和美新(盐酸托泊替康)；异环磷酰胺；易瑞沙(吉非替尼)；伊立替康注射剂；甲氨蝶呤注射剂；丝裂霉素；紫杉醇；光卟啉、qlt；培美曲塞；丙卡巴肼；链佐星；特罗凯(厄洛替尼)；长春碱；长春新碱；和酒石酸长春瑞滨。

在本文中要治疗的癌症的例子包括、但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。这样的癌症的更具体的例子包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胃肠间质瘤(gist)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、以及头颈癌。

对于疾病的预防或治疗，edc的适当剂量将取决于如上定义的要治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和进程、施用的分子用于预防还是治疗目的、以前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的判断。适当地将分子一次性地或在一系列治疗中施用给患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1-20mg/kg，包括、例如，1mg/kg至15mg/kg)的分子是用于施用给患者的初始候选剂量，例如，不论通过一次或多次单独施用，还是通过连续输注。典型日剂量的可能范围为约1μg/kg至100mg/kg(例如，1mg/kg至100mg/kg)或更高，取决于上述因素。要施用给患者的edc的一种示例性剂量是在约0.1至约10mg/kg患者重量的范围内。

可以将本发明的edc组合进药物组合制剂或给药方案中作为联合治疗，其中第二种化合物具有抗癌性质。所述药物组合制剂或给药方案的第二种化合物优选地具有与该组合的edc互补的活性，使得它们不会不利地影响彼此。

所述第二种化合物可以是化学治疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、芳香酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、脂质激酶抑制剂、抗-雄激素、反义寡核苷酸、核酶、基因治疗疫苗、抗血管生成的试剂和/或心脏保护剂。这样的分子适当地以对于预期目的而言有效的量存在于组合中。含有edc的药物组合物也可以具有治疗有效量的化学治疗剂，诸如形成微管蛋白的抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或dna结合剂。

可以将其它治疗方案与根据本发明鉴别的抗癌剂的施用相组合。所述联合治疗可以作为同时或相继方案来施用。当顺序地施用时，可以在2次或更多次施用中施用所述组合。联合施用包括共同施用，使用单独的制剂或单一药物制剂，和任一种次序的连续施用，其中存在两种(或全部)活性剂同时发挥它们的生物活性的时间段。

在一个实施方案中，使用本发明的edc的治疗包括本文中鉴别的抗癌剂和一种或多种化学治疗剂或生长抑制剂的联合施用，包括不同化学治疗剂的混合液的共同施用。化学治疗剂包括紫杉烷(诸如紫杉醇和多西紫杉醇)和/或蒽环类抗生素。这样的化学治疗剂的制备和给药方案可以根据生产商的说明书来使用，或者由熟练的从业人员根据经验来确定。这样的化学疗法的制备和给药方案也描述在：chemotherapyserviceed.,m.c.perry,williams&wilkins,baltimore,md.(1992)。

所述抗癌剂可以与抗激素化合物联合使用；例如，抗雌激素化合物如他莫昔芬；抗-黄体酮化合物如奥那司酮(ep616812)；或抗雄激素化合物如氟他胺，为这种分子的已知剂量。如果被治疗的癌症是不依赖激素的癌症，或者患者以前可能已经进行过抗激素治疗并且在癌症变成不依赖激素的癌症以后，可以给患者施用抗-erbb2抗体(和如本文中所述的任选其它试剂)。可能有益的是，也给患者共同施用心脏保护剂(以预防或减轻与治疗有关的心肌功能障碍)或一种或多种细胞因子。除了上述的治疗方案以外，可以对患者进行癌细胞的外科手术除去和/或辐射疗法。

上述共同施用的试剂中的任一种的合适剂量是目前使用的那些剂量，且由于新鉴别的试剂和其它化学治疗剂或治疗的联合作用(协同作用)可以降低。

所述联合治疗可以提供这样的效果：其在一起使用的活性成分大于单独使用化合物产生的效果的总和时实现。当如下处理活性成分时，可能达到所述效果：(1)在组合的单位剂量制剂中共配制和同时施用或递送；(2)作为单独制剂交替地或平行地递送；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中递送时，如果顺序地施用或递送化合物(例如通过在单独注射器中的不同注射)，可以达到效果。一般而言，在交替治疗过程中，顺序地(例如连续地)施用有效剂量的每种活性成分，而在联合治疗中，一起施用有效剂量的2种或更多种活性成分。

在本发明范围内也包括本文描述的edc化合物的体内代谢产物，只要这样的产物相对于现有技术而言是新颖的且非显而易见的。这样的产物可以源自例如施用的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化、酶切割等。因此，本发明包括通过特定方法产生的新颖的且非显而易见的化合物，所述方法包括：使本发明的化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的时间段。

可以如下鉴别代谢产物：制备放射性标记的edc，以可检测的剂量(例如大于约0.5mg/kg)将它胃肠外地施用给动物诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人，允许代谢进行足够的时间(通常约30秒至30小时)，并从尿、血液或其它生物样品分离它的转化产物。这些产物可容易地分离，因为它们经过标记(通过使用能够结合残留在代谢物中的表位的抗体来分离其它产物)。以常规方式，例如通过ms、lc/ms或nmr分析，确定代谢物结构。一般而言，以与本领域技术人员众所周知的常规药物代谢研究相同的方式，进行代谢物的分析。转化产物(只要它们否则不会存在于体内)可用于edc化合物的治疗剂量的诊断测定。

代谢物包括edc的体内切割的产物，其中发生将药物部分连接至抗体的任意键的切割。代谢切割因而可以产生裸抗体或抗体片段。可以将抗体代谢物连接至接头的一部分或全部。代谢切割也可以导致药物部分或其部分的产生。药物部分代谢物可以连接至接头的一部分或全部。

在另一个实施方案中，提供了制品或“试剂盒”，其含有edc和可用于治疗上述障碍的物质。所述制品包含容器和贴在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器或泡罩包。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。容器装有可有效治疗病症的edc组合物，且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶子)。组合物内的至少一种活性剂是edc。所述标签或包装说明书指示，组合物用于治疗选择的病症，例如癌症。例如，癌症可以是过表达本发明的edc的靶标之一的癌症。标签或包装说明书还可以指示，组合物可用于治疗癌症，其中所述癌症不以过表达本发明的edc的靶标之一为特征。在其它实施方案中，所述包装说明书可以指示，edc组合物也可以用于治疗不依赖于激素的癌症、前列腺癌、结肠癌或结直肠癌。

所述制品可以包含其中装有化合物的容器，其中所述化合物包含本发明的edc。在该实施方案中的制品可以进一步包含包装说明书，后者指示edc可以用于治疗癌症。可替换地，或另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑制细菌注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品可以进一步包含从商业和用户观点看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

下述实施例例证了本发明的有用方法和edc。

实施例

本发明的其它优点和特征将从下述实施例中显现，所述实施例作为例子给出，且不应解释为限制性的。可以以在实施例中具体描述的方式以外的方式实践本发明。考虑到上面的教导，本发明的众多修改和变化是可能的，且因此是在这些实施例后面的附带权利要求的范围内。

实施例1：接头就绪的治疗剂的合成、edc的制备和生物活性的评估.

本实施例描述了处于它的硫醇反应形式的“接头就绪的”试剂cen010-105的合成(部分a)和形成本发明的不同edc的类固醇海葱苷宁与抗体的缀合(部分b)。本实施例也描述了可以用于评估edc活性的不同方法(部分c)。

部分a“接头就绪的”试剂的合成

本实施例描述了用于将类固醇药物连接至接头以产生可以容易地连接至如本文中所述的抗体的“接头就绪的”试剂的合成方案。通过将氨基酸半胱氨酸连接至硫醇反应形式的“接头就绪的”试剂，还可以使用加帽的“接头就绪的”试剂来研究潜在edc分解产物的活性，所述产物可以通过蛋白酶体内edc降解而产生。

cen010-105是一种“接头就绪的”海葱苷宁，其包含海葱苷宁、接头和用于形成与抗体的共价稳定连接的活性基团。制备cen010-105的一般合成步骤如下。

2,3-二-o-苯甲酰基-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷-1-三氯乙酰亚氨酸酯.在氩气下，将1-烯丙基-2,3-二-o-苯甲酰基-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃核糖苷(11.9g,28.1mmol)溶解在二氯甲烷/甲醇(80ml,90:10)中，并将pdcl2(0.5g,2.8mmol)加入该溶液中。将混合物在室温搅拌过夜，穿过硅藻土(celite)垫过滤，并在减压下浓缩。穿过硅胶垫(己烷/etoac,70:30)过滤残余物。在氩气下，将得到的化合物(8.38g,21.83mmol)溶解在无水二氯甲烷(170ml)中。加入ccl3cn(21.9ml,218.3mmol)，随后在0℃逐滴加入dbu(1.63ml,10.91mmol)。将反应物在0℃搅拌1h。在减压下除去溶剂。穿过硅胶垫(己烷/etoac,60:40至40:60)过滤粗产物，得到作为黄色油的2,3-二-o-苯甲酰基-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃核糖苷-1-三氯乙酰亚氨酸酯(9.7g,65％)。将该化合物不经进一步纯化用于下一步。rf0.37(硅胶,己烷/etoac,80:20)。

海葱苷宁-2,3-二-o-苯甲酰基-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷.在氩气下在0℃，将2,3-二-o-苯甲酰基-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷-1-三氯乙酰亚氨酸酯(0.483g,0.915mmol)加入活化的分子筛(90mg)在无水二氯甲烷(15ml)中的混悬液中。然后将海葱苷宁(0.182g,0.474mmol)加入混合物中。5分钟以后，加入zn(otf)2(17mg,0.047mmol)，并将反应混合物在0℃搅拌另外30分钟。加入额外量的海葱苷宁(0.182g,0.474mmol)。将反应混合物在0℃搅拌30分钟。用几滴et3n淬灭反应。将混合物过滤，并在减压下除去溶剂。通过快速色谱法(己烷/etoac,75:25至50:50)纯化粗产物，得到作为白色粉末的海葱苷宁-2,3-二-o-苯甲酰基-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷(0.521g,76％)rf0.35(硅胶,己烷/etoac,50:50)。¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δ,0.68(s,3h),0.90-2.17(m,21h),2.39-2.44(m,1h),3.47(dd,1h,j＝12.0,9.5hz,h-5b),3.79-3.87(m,1h,h-4),4.17-4.22(m,2h,h-5a),4.78(d,1h,j＝6.8hz,h-1),5,26(dd,1h,j＝8.6,6.8hz,h-2),5.33(s,1h),5.49(dd,1h,j＝8.7hz,h-3),6.22(dd,1h,j＝9.7,0.6hz),7.18-7.19(m,1h),7.33-7.39(m,4h),7.47-7.53(m,2h),7.80(dd,1h,j＝9.7,2.6hz),7,92-7.97(m,4h)；¹³c-nmr(75mhz,cdcl3)δ16.7,19.0,21.4,25.8,28.7,28.8,32.4,32.8,35.2,37.6,40.8,42.9,48.4,50.2,51.2,59.2,63.1,71.6,72.9,76.1,85.2,100.0,115.5,121.7,122.8,128.5,128.6,129.1,129.5,129.9,130.1,133.4,133.6,146.9,147.6,148.7,162.5,165.3,165.7。

海葱苷宁-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷.将海葱苷宁-2,3-二-o-苯甲酰基-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷(0.351g,0.468mmol)溶解在甲醇(21ml)中。加入et3n(7ml)和h2o(7ml)。将反应混合物在室温搅拌2天。过滤混合物，并在减压下蒸发溶剂。通过快速色谱法(ch2cl2/meoh,98:2至95:5)纯化粗产物，得到作为黄色粉末的海葱苷宁-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷(40mg,24％)rf0.31(ch2cl2/meoh,95:5)；¹h-nmr(300mhz,cd3od)δ,0.74(s,3h),1.03-2.21(m,21h),2,52-2.57(m,1h),3.12-3.20(m,2h),3.40-3.44(m,2h),3.87-3.92(m,1h),4.17-4.23(m,1h),4.31(d,1h,j＝7.7hz,h-1),5.35(s,1h),6.28(dd,1h,j＝9.7,0.8hz),7.43(d,1h,j＝1.5hz),7.99(dd,1h,j＝9.7,2.6hz)。

海葱苷宁-4-氨基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷.将海葱苷宁-4-叠氮基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷(1.61g,2.34mmol)溶解在thf/h2o(2.8ml,90:10)中。加入聚合物-结合的pph3(79mg,3mmol.g^-1)。将反应混合物在40℃搅拌2小时。然后过滤混合物，并在减压下除去溶剂。通过快速色谱法(ch2cl2/meoh,90:10至80:20)纯化粗产物，得到作为黄色粉末的海葱苷宁-4-氨基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷(23mg,58％)rf0.2(ch2cl2/meoh,80:20).¹h-nmr(300mhz,cd3od)δ,0.74(s,3h),1.06-2.19(m,21h),2.52-2.57(m,1h),2.75-2.86(m,1h,h-4),3.14-3.24(m,2h,h-2,h-3),3.64-3.72(m,1h,h-5b),3.87-3.91(m,1h,h-5a),4.19-4.24(m,1h),4.36(d,1h,j＝7.1hz,h-1),5.38(s,1h),6.28(dd,1h,j＝9.7,0.6hz),7.42(d,1h,j＝1.6hz),7.99(dd,1h,j＝9.7,2.5hz)；¹³c-nmr(75mhz,cd3od)δ17.4,19.6,22.5,26.8,29.9,30.1,33.3,33.6,36.6,38.8,41.8,43.5,49.4,51.7,52.2,75.3,76.5,78.9,79.3,79.8,85.8,103.7,115.6,123.4,125.1,148.4,149.4,150.5,164.9。

cen010-105.在室温，向海葱苷宁-4-氨基-4-脱氧-l-吡喃木糖苷(18.5mg,0.0359mmol)在dmf(1ml)中的溶液中，加入nhs-peg24-马来酰亚胺(50mg,0.0359mmol)。然后，加入et3n(0.025ml,0.18mmol)。将反应物在室温搅拌2小时。在减压下除去溶剂。通过快速色谱法(ch2cl2/meoh,95:5至80:20)纯化粗制物质，得到作为黄色油的cen010-105(48mg,75％)rf0.66(ch2cl2/meoh,80:20)。hplc分析[lunac18,250x4,60mm,5μm,5％至95％acn历时32分钟,1ml.min^-1]指示>95％纯度的产物。hrms-esi(m/z)：c87h147n3o35[m+k⁺]⁺的计算值：1832.9452，实测值为1832.9777。

部分b免疫缀合物(edc和对照)的制备

通过下述方法(包括抗体链间二硫键的还原)，制备在实施例2-9中描述的edc和对照缀合物(含有抗体4f12,小鼠iggκ，其不结合细胞人细胞)。简而言之，在有1mm二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)(mpbiomedicalllc)和8摩尔当量的三(2-羧基乙基)膦(tcep)(目录号:hr2-651,hamptonresearch)存在下，在37℃还原在pbs(20mm磷酸钠ph7和150mmnacl)中的1-10mg/ml的浓度的抗体2小时，然后转移至湿冰。然后，加入9.6当量的cen010-105(“接头就绪的”试剂)，并允许在冰上反应30min。通过在cen010-105上面添加1.5当量的l-半胱氨酸，并在室温反应30分钟，淬灭反应。然后使用amiconultra30,000mwco(millipore,billerica,ma)和dpbs缓冲液更换，通过重复离心浓缩，将抗体缀合物与未缀合的cen010-105分离。以在1-10mg/ml范围内的浓度，将缀合物在2-8℃储存在pbs中。

通过下述方法，用海葱苷宁作为试剂，确定edc的试剂负载(每个抗体的试剂数目)。一旦在280nm±10nm以外的波长确定了试剂的消光系数，可以将该方法用于包含类固醇药物的任意edc。所述方法能够在280nm和在海葱苷宁的情况下299nm，测量缀合物的吸光度、抗体(ab)和海葱苷宁(药物)。首先，在280nm(a280ab)和299nm(a299ab)测量游离抗体的吸光度，以确定抗体常数[constantab]。接着，在280nm(a280药物)和299nm(a299药物)测量游离药物的吸光度，以确定药物常数[constantdrug]。最后，测量抗体药物缀合物的吸光度[a280conj和a299conj]。在280nm的抗体摩尔消光系数＝204,000m^-1cm^-1。在299nm的海葱苷宁的摩尔消光系数＝5623m^-1cm^-1。通过求解下述方程式，确定缀合物的试剂负载。

[constantab]＝a299ab/a280ab

[constantdrug]＝a299药物/a280药物

a280ab^*＝a280conj-(a299conj-[constantab]xa280conj)/([constantdrug]-[constantab])

a299药物^*＝a299-[constantab]xa280ab

抗体浓度＝a280ab^*/204,000m^-1cm^-1

药物浓度＝a299药物^*/5623m^-1cm^-1

药物负载＝药物浓度/抗体浓度

a299药物^*＝edc的药物组分

a280ab^*＝edc的抗体组分

部分c细胞毒性活性评估

细胞和培养条件：从americantypeculturecollection(atcc),manassas,va得到细胞系h460、ht29、a549、panc-1、mb231、fadu、h69和h929。从dctdtumorrepository,nationalcancerinstitute,frederick,maryland得到恶性黑素瘤细胞系loximvi。将细胞系维持在推荐的培养基配方中，并每3-4天传代培养。为了活化某些靶标(药物部分可以与其结合和/或与某些蛋白形成na,k-atp酶复合物)的表达，可以在推荐的培养基中培养细胞，所述培养基添加了添加剂诸如佛波醇酯、不同的生长因子和细胞因子诸如vegf、成纤维细胞生长因子、人生长因子、白介素和肿瘤坏死因子。另外，可以与其它细胞如人成纤维细胞一起共培养细胞。另外，可以用不同的蛋白如纤维蛋白原包被微孔滴定板。

体外细胞毒性评估：以1250-3333/孔的密度，将细胞铺板在384-孔白色组织培养物处理过的微孔滴定板内的20ul完全培养基中，然后在保湿培养箱中在37℃、7％co2下培养24小时，然后加入缀合物或小分子试剂。在有试验化合物存在下温育细胞72小时，然后进行细胞生存力试验。使用celltiter-glo发光细胞生存力测定(promega,madison,wi)，进行细胞生存力试验。使用graphpadprism5软件，确定试验化合物对每个细胞系的ec50值。

实施例2：edc2–靶向cd147和na,k-atp酶的edc

edc2免疫缀合物包含靶向分化簇147(cd147)的抗体和靶向na,k-atp酶的药物，所述分化簇147是一种在人类中由bsg基因编码的蛋白，其编码basigin(bsg)(也被称作细胞外基质金属蛋白酶诱导物(emmprin))的表达。

如在实施例1中所述，用cen010-105缀合下述4种抗-cd147单克隆抗体，以制备本发明的edc：(1)克隆him6(小鼠igg1,κ),biolegend,sandiego,ca,目录号306206；(2)克隆1a6a8(小鼠igg1,κ)；(3)克隆2c4(小鼠igg1,κ)；和(4)克隆8d12(小鼠igg1,κ),ebioscience,sandiego,ca,目录号14-1472。

根据命名法edcx.y，将得到的与单克隆抗体him6、1a6a8、2c4和8d12缀合的cen010-105的edc分别命名为edc2.1、edc2.2、edc2.3和edc2.4，其中x表示靶向试剂所结合的靶标(例如在该实施例中，cd147)，且y是采用的具体靶向试剂(例如在该实施例中，在一种情况下，mab克隆him6)。

针对如在实施例1中所述的许多癌细胞系，在体外评价了这些edc的细胞毒性活性，并将结果总结在实施例8的表1(ec50值以nm为单位)中。结果表明，cd147在试验的9种细胞系中表达，并且靶向该细胞表面蛋白的edc通常在皮摩尔范围内是有活性的。这些结果证实，细胞表面蛋白cd147在试验的9种癌细胞系中一致地与na,k-atp酶复合。因此，采用与作用于na,k-atp酶的试剂缀合的、针对cd147的靶向部分的edc通常可用于治疗许多类型的癌症，包括在实施例8中报道的试验的癌症类型(大细胞肺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、小细胞肺癌、黑素瘤和骨髓瘤)。

实施例3：edc3–靶向cd44和na,k-atp酶的edc

edc3免疫缀合物包含靶向分化簇44(cd44)的抗体和靶向na,k-atp酶的药物，所述分化簇44是一种在人类中由cd44基因编码的80-95kd糖蛋白，也被称作hermes、pgp1、h-cam和hutch。

如在实施例1中所述，用cen010-105缀合下述2种抗-cd44单克隆抗体，以制备本发明的edc：(1)克隆im7(大鼠igg2b,κ),biolegend,sandiego,ca,目录号103002；和(2)克隆bj18(小鼠igg1,κ),biolegend,sandiego,ca,目录号338802。将得到的cen010-105与单克隆抗体im7和bj18的edc分别命名为edc3.1和edc3.2。

针对如在实施例1中所述的许多癌细胞系，在体外评价了这些edc的细胞毒性活性，并将结果总结在实施例8的表1(ec50值以nm为单位)中。结果表明，cd44在试验的所有细胞系中表达，并且靶向该细胞表面蛋白的edc通常在低纳摩尔范围(对于细胞系a549和panc1)和低于100nm(对于细胞系ht29、mb231、fadu、h46)是有活性的。对于所有细胞类型，edc3.1和edc3.2表现出低于对照缀合物的活性。这些结果表明，当在所述的条件下培养时，cd44在细胞系a549中与na,k-atp酶复合，且panc1和cd44在细胞系ht29、mb231、fadu、h46中以低水平表达或者与na,k-atp酶弱(不总是)复合。强相互作用是这样的：其中细胞类型对edc的敏感性比对照缀合物好至少100倍。弱相互作用是这样的：其中细胞类型对edc的敏感性比对照缀合物好至少10倍，但是没有好100倍。没有相互作用是这样的：其中细胞类型对edc的敏感性没有比对照缀合物好至少10倍。因此，采用与作用于na,k-atp酶的试剂缀合的、针对cd44的靶向部分的edc通常可用于治疗许多类型的癌症，包括在实施例8中描述的试验的癌症类型(非小细胞肺癌和胰腺癌)。

实施例4：edc4–靶向cd98和na,k-atp酶的edc

edc4免疫缀合物包含靶向由slc3a2和slc7a5组成的分化簇98(cd98)异源二聚体糖蛋白的抗体和靶向na,k-atp酶的药物，所述slc3a2和slc7a5一起形成大型中性氨基酸转运蛋白(lat1)。如在实施例1中所述，用cen010-105缀合下述抗-cd98抗体，以制备本发明的edc：克隆mem-108(小鼠igg1,κ),biolegend,sandiego,ca,目录号315602。将得到的缀合物命名为edc4.1。

针对如在实施例1中所述的许多癌细胞系，在体外评价了该edc的细胞毒性活性，并将结果总结在实施例8的表1(ec50值以nm为单位)中。结果表明，cd98在确定的条件下在试验的所有细胞系中表达，并且靶向该细胞表面蛋白的edc在试验细胞系的纳摩尔范围内和在低于对照缀合物的水平是有活性的，从而指示cd98在那些细胞系中与na,k-atp酶复合。因此，采用与作用于na,k-atp酶的试剂缀合的、针对cd98的靶向部分的edc通常可用于治疗许多类型的癌症，包括在实施例8中报道的试验的癌症类型(非小细胞肺癌、头颈癌、小细胞肺癌和骨髓瘤)。

实施例5：edc5–靶向cd87和na,k-atp酶的edc

edc5免疫缀合物包含靶向分化簇87(cd87)的抗体和靶向na,k-atp酶的药物，所述分化簇87也被称作尿激酶受体或upar。如在实施例1中所述，用cen010-105缀合下述抗-cd87抗体，以制备本发明的edc：克隆vim5(小鼠igg1,κ),biolegend,sandiego,ca,目录号336902。将得到的缀合物命名为edc5.1。

针对如在实施例1中所述的许多癌细胞系，在体外评价了该edc的细胞毒性活性，并将结果总结在实施例8的表1(ec50值以nm为单位)中。结果表明，在用于培养细胞的条件下，cd87仅在lox细胞上表达，并且靶向cd87和na,k-atp酶的edc5.1在低纳摩尔范围对该细胞系是有活性的，从而指示cd98在该细胞系中与na,k-atp酶复合。

没有使用cd87刺激因子来产生在实施例8中描述的结果，且cd87通常没有以可检测的水平在静止细胞上表达。因此，在启动upar系统的活性之前，cd87可能需要增量调节。例如，cd87表达在体外受以下因素刺激：诸如佛波醇酯等试剂(lund等人,j.biol.chem.1991,266:5177-5181)，上皮细胞和多种生长因子和细胞因子诸如vegf、bfgf、hgf、il-1、tnfα(在内皮细胞中)和gm-csf(在巨噬细胞中)的转化(mignatti等人,j.cellbiol.1991,113:1193-1201；mandriota等人,j.biol.chem.270:9709-9716；yoshida等人,inflammation1996,20:319-326)。更重要的是，upar似乎在迄今为止检查的大多数人癌中在体内被增量调节，具体地，在肿瘤细胞本身中，在经历血管生成的肿瘤相关的内皮细胞中，和在巨噬细胞中(pyke等人,cancerres.1993,53:1911-15)，其可能参与肿瘤血管生成的诱导(lewis等人,j.leukoc.biol.1995,57:747-751)。

因此，采用与作用于na,k-atp酶的试剂缀合的、针对cd87的靶向部分的edc通常可用于治疗许多类型的癌症，包括在实施例8中描述的试验的癌症类型(例如黑素瘤)。另外，edc5.1或用作用于na,k-atp酶的upar特异性的靶向部分和试剂开发的edc可用于治疗涉及巨噬细胞的炎性疾病。

实施例6：edc6-靶向cd230和na,k-atp酶的edc

edc6免疫缀合物包含靶向分化簇230(cd230)的抗体和靶向na,k-atp酶的药物，所述分化簇230也被称作主要朊病毒相关蛋白(prp)。如在实施例1中所述，将下述抗-cd230抗体偶联至cen010-105，以制备本发明的edc：克隆4d5(小鼠igg1,κ),ebioscience,sandiego,ca,目录号14-9230-82。将得到的缀合物命名为edc6.1。

针对如在实施例1中所述的许多癌细胞系，在体外评价了edc6.1的细胞毒性活性，并将结果总结在实施例8的表1(ec50值以nm为单位)中。结果表明，cd230在所有试验细胞系中表达，并且靶向该细胞表面蛋白的edc在纳摩尔范围和低于对照缀合物水平对细胞系a549和lox是有活性的，从而指示cd230在这些细胞系中与na,k-atp酶复合。结果也表明，edc6.1对panc1、mb231或fadu细胞是没有活性的，从而指示在试验的条件下，cd230没有与那些细胞的表面上的na,k-atp酶复合。因此，采用与作用于na,k-atp酶的试剂缀合的、针对cd230的靶向部分的edc通常可用于治疗许多类型的癌症，包括在实施例8中描述的试验的癌症类型(例如非小细胞肺癌和黑素瘤)。另外，用作用于na,k-atp酶的朊病毒特异性的靶向部分和试剂开发的edc可用于治疗由朊病毒和朊病毒相关蛋白的积累造成的神经学缺陷。

实施例7：edc7–靶向cd56和na,k-atp酶的edc

edc7免疫缀合物包含靶向分化簇56(cd56)的抗体和靶向na,k-atp酶的药物，所述分化簇56也被称作神经细胞粘附分子(ncam)。

基本上如在实施例1中所述，将下述2种抗-cd56抗体偶联至cen010-105，以制备本发明的edc：(1)克隆hcd56(小鼠igg1,κ),biolegend,sandiego,ca,目录号318324；和(2)克隆mem-188(小鼠igg2a,κ),biolegend,sandiego,ca,目录号304622。将得到的与抗体hcd56和mem-188缀合的cen010-105的edc分别命名为edc6.1和edc6.2。

针对如在实施例1中所述的许多癌细胞系，在体外评价了这些edc的细胞毒性活性，并将结果总结在实施例8的表1(ec50值以nm为单位)中。结果表明，cd56仅在命名为h69细胞的小细胞肺癌细胞系上表达，并且靶向该细胞表面蛋白的edc在皮摩尔范围内对该细胞系是有活性的，从而指示cd56在该细胞系中与na,k-atp酶复合。因此，采用与作用于na,k-atp酶的试剂缀合的、针对cd56的靶向部分的edc通常可用于治疗小细胞肺癌。

实施例8.edc的体外细胞毒性

表1-(ec50值以nm为单位)

实施例9：edc在动物模型中的效力

在ht-29人结肠癌异种移植物模型中证实了edc2.2的效力(参见实施例2)。简而言之，为了建立人结肠直肠腺癌疾病模型，切碎得自承载ht-29异种移植物的小鼠的肿瘤，并用套针将8mm³片段皮下移植进hsd:athymicnude-foxn1^nu小鼠(harlan,indianapolis,in)的左胁腹。然后当7只动物组中的肿瘤体积平均值为约100mm³时，开始使用edc2.2的治疗。使用每3天1次注射共注射4次(q3d×4)的方案，静脉内施用使用媒介物对照和1或5mg/kgedc2.2的治疗。以qd×5施用的15mg/kg紫杉醇充当阳性对照治疗组。使用经校准的游标卡尺，测量每个组的肿瘤体积，并相对于第一天的肿瘤植入物绘图，持续至植入后69天和初始给药后41天。在初始给药后第41天，与媒介物相比，1和5mg/kg的edc2.2分别产生59％和66％的肿瘤生长抑制。与媒介物相比，在它的最适剂量的紫杉醇产生85％的肿瘤生长抑制。因此，采用与作用于na,k-atp酶的试剂缀合的、针对cd147的靶向部分的edc通常可用于治疗结肠癌。