一种熊果酸‑阿司匹林偶联物在制备保肝护肝药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及一种熊果酸和阿司匹林的偶联物，具体涉及熊果酸-阿司匹林偶联物的保肝护肝作用及其制备保肝药物的应用。

背景技术：

肝脏的主要功能，是分泌胆汁、储藏糖原，调节蛋白质、脂肪和碳水化合物的新陈代谢，还有解毒、造血和凝血作用。肝脏还是人体内最大的解毒器官，体内产生的毒物、废物，吃进去的毒物、有损肝脏的药物等等也必须依靠肝脏解毒。肝脏分解由肠道吸收或身体其他部分制造的有毒物质，然后以无害物质的形式分泌到胆汁或血液继而排出体外，所以肝脏是人体最重要的脏器之一。肝脏疾病是临床上较为常见的疾病，肝脏疾病一直是医学科学重点研究的对象之一。肝损伤是由手术打击、创伤、微生物感染、肝脏疾病、有毒化合物、药物毒副作用、免疫紊乱、遗传变异、代谢失常、理化刺激等导致的肝细胞、肝组织甚至整个肝脏器官的形态与功能的病理改变肝损伤是危害人类健康常见的临床疾病之一。肝损伤的长期存在往往会导致肝纤维化，是进而诱发肝硬化、肝功能衰竭、甚至肝癌的重要始动因素。因此预防和治疗肝细胞损伤是临床上肝病治疗的重要环节之一，是抑制肝纤维化、肝坏死、肝硬化以及肝癌等疾病发生和发展的基础。目前临床常用的保肝药物，或因为价格昂贵，或因使用不便，或具有较大副作用，使用受到限制。

研究应用中经典的肝损伤模型主要有化学性、免疫性、生物性、酒精肝损伤模型等，其中生物性肝损伤模型的建立条件要求高，病原体易感染研究者等限制了其在研究中应用，免疫性肝损伤模型通过诱发免疫应答产生特异性抗体，从而导致肝细胞损伤。目前，在建立肝损伤动物模型方面，国内外学者最常用的是化学性诱导剂，CCl₄、硫代乙酰胺、乙醇都是目前最常见的化学性损伤诱导剂。根据目前的研究显示，四氯化碳导致肝损伤的机制包括：（1）引起氧化应激；（2）引起体内相关酶系变化；（3）改变细胞因子活性；（4）引起细胞调亡；（5）毒性基因组学变化。其中CCl₄的CCl₃·自由基导致的脂质过氧化过程，被认为是引发肝损伤的主要机制。CCl₄进入机体后，经肝脏细胞色素P450激活，生成CCl₃·。CCl₃·生成后，能够与细胞膜上的不饱和脂肪酸反应生成脂肪酸，从而引起脂质过氧化而导致细胞膜、细胞器损伤。MDA为此过程中的稳定产物，而SOD是体内清除超氧阴离子自由基的主要酶，能抑制体内脂质过氧化反应。毒害期间，体内的氧自由基急骤增加要消耗大量的SOD，同时产生大量的MDA。因此，细胞色素P450、SOD、MDA变化可反映体内脂质过氧化反应强度和组织损伤的程度。

本发明涉及的熊果酸-阿司匹林（ASP-UA）偶联物能抑制肿瘤细胞与细胞外基质的粘附；能抑制肿瘤细胞的运动迁移能力；能抑制肿瘤细胞的侵袭能力；能抑制肿瘤细胞表面粘附因子的表达；能防止乳腺癌发生肺部转移(见专利201510466210.4)。本发明提供的熊果酸-阿司匹林偶联物（简写为ASP-UA），经实验证明，可显著降低四氯化碳致肝损伤模型小鼠血清ALT、AST活性，增强肝脏SOD活性，具有很好的保肝护肝效果。

技术实现要素：

如式I所示的熊果酸-阿司匹林偶联物（简写为ASP-UA）在制备保肝护肝药物中的应用。

本发明对熊果酸-阿司匹林偶联物进行进一步的研究，建立肝损伤小鼠模型，分别测定不同剂量的阿司匹林（80mg/kg、160mg/kg）、熊果酸（80mg/kg、160mg/kg）、熊果酸-阿司匹林（20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）、阿司匹林（80mg/kg）和熊果酸（80mg/kg）联合用药组药物作用后小鼠体内AST、ALT和SOD的活性，结果表明： 不同剂量ASP-UA（20mg/kg～160mg/Kg）对肝损伤模型小鼠体内AST活性均有显著抑制作用，且同等剂量下其抑制作用均大于阿司匹林和熊果酸单独用药组(80mg/kg、160mg/kg)和阿司匹林（80mg/kg）和熊果酸（80mg/kg）联合用药组，其中40mg/kg剂量的ASP-UA对肝损伤模型小鼠体内AST活性降低作用最显著，其对AST活性抑制率达到48.37%；‚ 不同剂量ASP-UA（20mg/kg～160mg/kg）对肝损伤模型小鼠体内ALT活性均有显著抑制作用，且同等剂量下其抑制作用均大于阿司匹林和熊果酸单独用药组（80mg/kg、160mg/kg）和阿司匹林（80mg/kg）和熊果酸（80mg/kg）联合用药组，其中40mg/kg剂量的ASP-UA对肝损伤模型小鼠体内ALT活性降低作用最显著，其对ALT活性抑制率达到64.48%；ƒ 不同剂量ASP-UA（20mg/kg～160mg/kg）对肝损伤模型小鼠体内SOD活性均有显著促进作用，且同等剂量下其促进作用大于阿司匹林和熊果酸单独用药组(80mg/kg、160mg/kg)和阿司匹林（80mg/kg）和熊果酸（80mg/kg）联合用药组，其中80mg/kg剂量的ASP-UA对肝损伤模型小鼠体内SOD活性促进作用最显著，其对SOD活性促进率达到39.81%。经查阅对比文献发现，单独阿司匹林用药起到保肝护肝作用的剂量是200mg/kg(占德华.阿司匹林对百草枯中毒大鼠肝肾功能的保护作用.浙江大学硕士论文，2012.)，单独熊果酸用药起到保肝护肝作用的剂量是100mg/kg（林艳芹.熊果酸在 CCl4诱导的小鼠肝损伤的保护作用研究.福建医科大学，2015.）。因此，与阿司匹林和熊果酸单独用药和阿司匹林（80mg/kg）和熊果酸（80mg/kg）联合用药的保肝护肝作用相比，本发明涉及的ASP-UA偶联物保肝护肝作用效果更好，其在40mg/kg剂量时就能发挥最佳保肝护肝作用,且该作用优于熊果酸和阿司匹林本身。

附图说明

图1 ASP-UA对 CC致肝损伤小鼠血清AST的影响（n=10）

图2 ASP-UA对 CC致肝损伤小鼠血清的ALT影响（n=10）

图3 ASP-UA对 CC致小鼠肝损伤血清SOD影响（n=10）

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例 1

ASP-UA偶联物对小鼠四氯化碳致肝损伤 ( 动物体内肝损伤模型 ) 的保护

药物与试剂：AST、ALT,SOD试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；四氯化碳（CCl₄，分析纯），使用时用大豆油配成0.3%的大豆油溶液；熊果酸（UA）标准品临用前大豆油溶解配成溶液；阿司匹林（ASP）用时先用7%的无水乙醇溶解，再加7%的大豆油溶解，最后加磷酸缓冲液配制成溶液。

实验动物：雄性昆明种小鼠，体重18～22g。

雄性昆明小鼠110只适应性喂养3天适应环境后，随即分成空白对照组、CCl₄模型组、阿司匹林组、熊果酸组、ASP-UA剂量组、阿司匹林和熊果酸联用组，每组十只。

肝损伤动物模型的诱导：

各组分笼饲养一周后，配置0.3%CCl₄大豆油溶液，从实验第一天起进行CCl₄灌胃，每只小鼠灌胃量0.2mL。除空白组外，CCl₄模型组、阿司匹林组、熊果酸组、ASP-UA偶联物低、中、高剂量组均灌0.3%CCl₄大豆油溶液，连续灌胃一周后，从各组中随机选取一只小鼠摘除眼球取血，测定血清中AST和ALT活力，其活力升高确定肝损伤造模成功。

ASP-UA偶联物灌胃

肝损伤模型诱导成功后，空白组和模型组不做处理，阿司匹林（ASP）组灌胃溶液（80mg/kg、160mg/kg）、熊果酸（UA）组灌胃溶液（80mg/kg、160mg/kg）、ASP-UA偶联物灌胃溶液（20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）和阿司匹林（80mg/kg）和熊果酸（80mg/kg）联合用药剂量组，分别按上述剂量每只小鼠灌胃0.2mL，每隔24 h灌胃一次，给药组连续灌胃20天后于1、4、7天除空白对照组外其他组加灌0.3%的CC大豆油溶液，自由摄食饮水。

动物解剖实验

最后一次灌CCl₄ 20h和灌药12h后，各组小鼠禁食12h后，称重记录。摘除眼球取血，全血静置2h,在3000r/min离心10min,4℃保存备用；小鼠摘除眼球采血后颈椎脱臼而死，快速分离肝脏，用4℃生理盐水冲洗拭干，称取肝脏、脾脏、胸腺重量。

统计学处理

所有实验数据均采用SPSS16.0统计处理软件进行统计学处理，结果以`x±s表示,组间比较采用方差分析。

实验结果

1.ASP-UA偶联物对小鼠肝和肝重的影响

实验中CC肝损伤模型组与空白组比较，肝脏指数显著高于空白组（P<0.05）；不同剂量的本发明ASP-UA偶联物与模型组相比，肝脏指数显著低于模型组（P<0.05）,说明本发明ASP-UA偶联物对肝脏起到了一定的保护修复作用，降低了肝脏受损的程度；胸腺指数和脾脏指数从侧面反映了免疫功能的情况，不同剂量的本发明ASP-UA偶联物与模型组相比，胸腺指数和脾脏指数都有所提高（P<0.05），这说明摄入不同剂量的本发明ASP-UA偶联物可促进机体免疫器官的生长发育，提高机体免疫功能；已证明ASP和UA具有保肝护肝的作用，不同剂量的本发明ASP-UA偶联物和ASP、UA的胸腺指数和脾指数都接近正常组，说明本发明ASP-UA偶联物具有保肝护肝的作用，具体实验结果见表1。

表中A为ASP;U为UA;AUA为ASP-UA；下同。

2.ASP-UA偶联物对CC致肝损伤小鼠血清 AST的影响

实验中 CC肝损伤模型组AST活性与正常组相比显著升高（P<0.01）；本发明不同剂量的ASP-UA偶联物与模型组相比，均不同程度的地使肝损伤小鼠血清AST活性降低（P<0.01、P<0.05）；不同剂量的本发明ASP-UA偶联物与阿司匹林（80mg/kg、160mg/kg）组即图1中的A-80、A-160和熊果酸（80mg/kg、160mg/kg）组即图1中的U-80、U-160和阿司匹林（80mg/kg）和熊果酸（80mg/kg）联合用药组即图1中的A-80+U-80组的AST活性下降水平相比，本发明ASP-UA偶联物AST活性下降的水平均大于ASP组、UA组和A-80+U-80组；ASP、UA能降低肝损伤小鼠血清中的AST活性，已证明ASP、UA具有保肝护肝作用，因此本发明的保肝护肝作用优于ASP、UA和A-80+U-80，具体实验结果见图1。

3.ASP-UA偶联物对CCl₄致肝损伤小鼠血清ALT的影响

实验中 CC肝损伤模型组ALT活性与正常组相比显著升高（P<0.01），本发明不同剂量的ASP-UA偶联物与模型组相比，均不同程度的使肝损伤小鼠血清ALT活性下降（P<0.01、P<0.05）；本发明不同剂量的ASP-UA偶联物与阿司匹林（80mg/kg、160mg/kg）组即图2中的A-80、A-160相比，本发明ASP-UA偶联物组ALT活性下降的水平均大于ASP组；本发明不同剂量的ASP-UA偶联物与熊果酸（80mg/kg、160mg/kg）组即图2中的U-80、U-160相比和阿司匹林（80mg/kg）和熊果酸（80mg/kg）联合用药组即图2中的A-80+U-80组的ALT活性下降水平相比，本发明ASP-UA偶联物组ALT活性下降水平均大于UA和A-80+U-80组；ASP、UA能降低肝损伤小鼠血清的ALT，已证明ASP、UA具有保肝护肝的作用，因此本发明的保肝护肝作用优于ASP、UA和A-80+U-80，具体实验结果见图2。

4.ASP-UA偶联物对CC致肝损伤小鼠血清SOD的影响

实验中 CC肝损伤模型组与正常组比较，小鼠血清SOD活性明显降低（P<0.01）；本发明不同剂量的ASP-UA偶联物与模型组相比，均不同程度的地使肝损伤小鼠血清SOD活性升高（P<0.01、P<0.05）；本发明不同剂量的ASP-UA偶联物与阿司匹林（80mg/kg、160mg/kg）组即图3中的A-80、A-160和熊果酸（80mg/kg、160mg/kg）组即图3中的U-80、U-160和阿司匹林（80mg/kg）和熊果酸（80mg/kg）联合用药组即图3中的A-80+U-80组SOD活性下降水平相比，本发明ASP-UA偶联物SOD升高水平均大于ASP组、UA组和A-80+U-80组SOD活性下降水平；UA能使肝损伤小鼠血清SOD活性升高，已证明ASP、UA具有保肝护肝作用，因此本发明的保肝护肝作用优于ASP、UA和A-80+U-80，具体实验结果见图3。

实验结论：ASP-UA偶联物对 CC致小鼠肝损伤具有保护活性，以此证明ASP-UA偶联物具有较好的保肝护肝的作用，在40mg/kg剂量时能够发挥最佳保肝护肝作用,且该作用优于熊果酸和阿司匹林本身。