一种防治脂肪肝的中药多糖组合物及其制备方法与流程

本发明属于中医药领域，具体是一种防治脂肪肝的中药多糖组合物及其制备方法。

背景技术：

随着我国民众生活水平的不断提高，其生活方式及饮食结构发生改变，导致近年来脂肪肝的发病率逐年上升，成为第二类常见肝病，仅次于病毒性肝炎。流行病学发现，发病年龄越趋低龄，严重影响我国民众的健康及生活质量。目前现代医学对于脂肪肝的治疗尚未有特效药物，而中医药以其多物质、多靶点、多途径的治疗特色，在防治脂肪肝方面取得了显著的疗效。

算盘子Glochidion puberum（Linn.）Hutch.为大戟科植物，别名算盘木、野南瓜、算盘粒、金骨风等，生长于山坡灌丛中，主要分布于福建、广东、广西、贵州、四川、陕西、湖北、湖南等省区，广西各地均有产。具有清热解毒，消滞止痛，祛风除湿，活血散瘀等功效，可用于治疗感冒发热、消化不良、肠炎、痢疾、黄疸、咽炎、皮炎湿疹等病症。广西民间常用其治疗肝脏方面疾病，长期经验用药表明，其具有较高的药用价值。

穿破石C.tricuspidata（Carr.）Bur.ex Lavallee为拓树的根或根皮，别名辣椒刺、黄蜂刺、黄穿破石、黄龙退壳、山荔枝等，生长于山坡、溪边、灌丛中，主要分布于安徽、浙江、江西、福建、广西、广东、贵州、云南等省区，广西各地有产。具有止咳化痰，祛风利湿，散瘀止痛等功效，可用于肺结核，黄疸型肝炎，肝脾肿大，胃、十二指肠溃疡，风湿性腰腿痛等病症。

经检索，未见算盘子多糖、穿破石多糖和二者多糖的组合物在防治脂肪肝方面的报道，因此，本发明分别以算盘子多糖、穿破石多糖和二者多糖的组合物干预脂肪肝大鼠，通过药效指标，评判在防治脂肪肝方面的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是以算盘子根为原料提取纯化出算盘子多糖，以穿破石根为原料提取纯化出穿破石多糖，并将其二者有效部位除杂后，共同作用于脂肪肝大鼠，为其在防治脂肪肝方面提供理论依据，这在国内外尚未见有文献报道过。

实现本发明目的的技术方案是：

一种防治脂肪肝的中药多糖组合物，包含算盘子多糖及穿破石多糖，二者的比例为1∶1。

所述算盘子多糖的提取及纯化方法是：取算盘子根，粉碎成粗粉，按10∶1的料液比加入石油醚，回流脱脂提取2次，每次1 h，挥尽药渣中的石油醚后，按照20∶1料液比加入蒸馏水，沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液并浓缩；浓缩液用氯仿-正丁醇按4∶1多次萃取，取上清液，加入95%乙醇，并将其置于4℃冰箱中醇沉12 h，抽滤，滤渣依次用乙醚、丙酮、无水乙醇洗涤，得算盘子粗多糖；将算盘子粗多糖溶于水中，加样到经pH=8的磷酸盐缓冲液前处理的 DE52 型树脂层析柱中，静止过夜，用蒸馏水洗脱，流速为1.5 ml/min，合并洗脱液，冷冻干燥得到算盘子多糖。

采用DE52型树脂层析柱进行洗脱，先以蒸馏水进行洗脱，然后用0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/ml NaCl溶液梯度洗脱，洗脱液用苯酚- 硫酸试剂显色后，测其吸光度，测定算盘子多糖纯度≥75.62%。

所述穿破石多糖的提取及纯化方法是：取穿破石根，粉碎成粗粉，按照25∶1料液比加入蒸馏水，置于90℃的水浴中提取4 h，过滤后，取上清液，将上清浓缩至14%浓度，加入3倍体积95%乙醇，并置于4℃冰箱中醇沉12 h，4000 r/min离心20 min，烘干沉淀物，即为穿破石粗多糖；将穿破石粗多糖用去离子水复溶，调节pH=3，并加入4%的硫酸锌，4000 r/min离心20 min，烘干沉淀物，得到穿破石纯化多糖。应用“苯酚- 硫酸”法，测得其纯度≥70.57%。

与现有技术相比，本发明首次公开了以算盘子根为原料提取纯化出算盘子多糖的方法和以穿破石根为原料提取纯化出穿破石多糖的方法，并通过实验证明，与其二者多糖单独作用于脂肪肝大鼠的疗效相比，其二者多糖共同作用的疗效更佳。

附图说明

图1为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验空白组的病理切片图(HE染色，×200)；

图2为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验模型组的病理切片图(HE染色，×200)；

图3为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验阳性组的病理切片图(HE染色，×200)；

图4为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验多糖联合组的病理切片图(HE染色，×200)；

图5为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验算盘子多糖组的病理切片图(HE染色，×200)；

图6为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验穿破石多糖组的病理切片图(HE染色，×200)；

图7为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验空白组的病理切片图(油红染色，×200)；

图8为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验模型组的病理切片图(油红染色，×200)；

图9为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验阳性组的病理切片图(油红染色，×200)；

图10为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验多糖联合组的病理切片图(油红染色，×200)；

图11为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验算盘子多糖组的病理切片图(油红染色，×200)；

图12为本发明中药多糖组合物抗大鼠脂肪肝实验穿破石多糖组的病理切片图(油红染色，×200)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的内容作进一步的说明，但并不是对本发明的限定。

一、算盘子多糖的提取和纯化：

取算盘子根，粉碎成粗粉，按10∶1的料液比加入石油醚，回流脱脂提取2次，每次1 h，挥尽药渣中的石油醚后，按照20∶1料液比加入蒸馏水，沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液并浓缩；浓缩液用氯仿-正丁醇按4∶1多次萃取，取上清液，加入95%乙醇，并将其置于4℃冰箱中醇沉12 h，抽滤，滤渣依次用乙醚、丙酮、无水乙醇洗涤，得算盘子粗多糖；将算盘子粗多糖溶于水中，加样到经pH=8的磷酸盐缓冲液前处理的 DE52 型树脂层析柱中，静止过夜，用蒸馏水洗脱，流速为1.5 ml/min，合并洗脱液，冷冻干燥得到算盘子多糖。

采用DE52型树脂层析柱进行洗脱，先以蒸馏水进行洗脱，然后用0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/ml NaCl溶液梯度洗脱，洗脱液用苯酚- 硫酸试剂显色后，测其吸光度，测定算盘子多糖纯度≥75.62%。

二、穿破石多糖的提取和纯化：

取穿破石根，粉碎成粗粉，，按照25∶1料液比加入蒸馏水，置于90℃的水浴中提取4 h，过滤后，取上清液，将上清浓缩至14%浓度，加入3倍体积95%乙醇，并置于4℃冰箱中醇沉12 h，4000 r/min离心20 min，烘干沉淀物，即为穿破石粗多糖；将穿破石粗多糖用去离子水复溶，调节pH=3，并加入4%的硫酸锌，4000 r/min离心20 min，烘干沉淀物，得到穿破石纯化多糖。应用“苯酚- 硫酸”法，测得其纯度≥70.57%。

三、算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用的保肝实验的方法和结果：

1.1 仪器、药物和动物

TGL-16K台式高速冷冻离心机，湖南湘仪离心机厂； AU600全自动生化检测仪，奥林巴斯生产；01ymPus BX51显微镜，奥林巴斯生产；BS1105电子天平，德国sartorius公司。恒温水浴锅XMTD—6000，上海长风仪器厂；THZ-C-1 台式冷冻恒温振荡器，太仓市实验设备厂。

算盘子为大戟科植物算盘子Glochidion puberum（Linn.）Hutch.的根或全株。穿破石为桑科植物拓树C.tricuspidata（Carr.）Bur.ex Lavallee的根或根皮。ALT，AST，AKP，MDA，SOD， GSH购于南京建成生物工程研究所；TG，TC，LDL-C，HDL-C购于北京北华康泰临床试剂有限公司；TNF-α，IL-6试剂盒购于Elabscience公司，TGF-β1购于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；水飞蓟宾胶囊天津天士力制药有限公司产品，批号20140224。

昆明种SPF级小鼠60只，体重19-22g，雌雄各半，由桂林医学院SPF实验动物中心提供(许可证号SCXK2007-0001)。

1.2 方法

将60只大鼠完全随机分为6组，即正常对照组，模型组，水飞蓟宾组（100 mg·kg^-1），多糖联合组（各50 mg·kg^-1），算盘子多糖组（100 mg·kg^-1）及穿破石多糖组（100 mg·kg^-1），正常组喂以普通饲料，其余各组以高糖高脂饲料（基础饲料68.8%、10%蔗糖、10%蛋黄、10%猪油、胆固醇1%、胆盐0.2%）喂养，于第7周造成大鼠脂肪肝模型，并受试药物干预5周后，禁食不禁水18 h后，眼球取血和收集肝组织。参照试剂盒的说明，生物化学法检测血清中ALT，AST，AKP和TG，TC，LDL-C，HDL-C生化指标；测定肝组织中MDA，SOD，GSH水平或活性； ELISA法检测肝组织中TNF-α，IL-6和TGF-β1含量；取大鼠肝左叶，固定于4 %多聚甲醛溶液中，石蜡包埋、切片、应用油红染色，在光学显微镜下观察肝组织病理学变化。应用SPSS13.0软件进行统计分析，数据均以±s表示。

1.3 结果

1.3.1 算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对脂肪肝大鼠血清中ALT，AST和AKP水平的影响

表1 算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对脂肪肝大鼠血清中ALT，AST和AKP水平的影响(±s,n=10)

与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。

由表1结果可见，模型组与正常组相比较，ALT，AST和AKP差异有极显著性(P<0.01)；与模型组比较，算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用均能显著的抑制ALT，AST和AKP活性 ( P<0.01，P<0.05)，且二者多糖联合使用效果最佳，因此可判断算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对受损的肝细胞具有保护作用。

1.3.2 算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对脂肪肝大鼠血清中LDL-C，HDL-C，TG和TC的影响

模型对照组TG，TC和LDL-C含量升高以及HDL-C水平降低(P<0.05或0.01)，算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用能明显提高模型鼠HDL-C含量,降低TG，TC，LDL-C 含量(P<0.05或0.01)，可判断算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对脂肪肝大鼠的血清血脂具有显著的调节作用，见表2。

表2算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对脂肪肝大鼠血清中LDL-C，HDL-C，TG和TC的影响( ± s, n = 10)

与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。

1.3.3 算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对脂肪肝大鼠肝组织中MDA，GSH和SOD的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝中MDA含量明显升高，SOD活性降低及GSH 含量减少(P<0.01); 算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用能显著降低脂肪肝大鼠肝组织中MDA含量，SOD活性提高及GSH含量增加(P<0.05或0.01)，表明算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用具有良好的抗氧化能力。见表3。

表3 算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对脂肪肝大鼠肝组织中MDA，GSH和SOD的影响( ± s, n = 10)

与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。

1.3.4 算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对脂肪肝大鼠TNF-α，IL-6和TGF-β₁水平的影响，见表4。

表4算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用对脂肪肝大鼠TNF-α，IL-6和TGF-β₁水平的影响

与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。

由表4中 ELISA结果表明，与正常组比较，模型组肝组织中TNF-α，IL-6和 TGF-β1水平明显增加（P<0.01）。经受试药物治疗后，各组肝组织中TNF-α，IL-6和 TGF-β1的水平逐渐减少，与模型组比较，差别有统计学意义（P<0.01），表明算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖联合使用可通过抑制肝组织内的炎症反应和细胞毒性来实现保肝作用。

1.3.5 肝组织病理变化

经HE染色，在光镜下观察，正常大鼠肝细胞均匀整齐，胞浆丰富，未见脂肪病变，汇管区未发现炎症浸润，肝小叶结构完整，肝索和肝窦均清晰可辨。模型组肝组织肝细胞数量明显减少，出现明显脂肪变性，出现不同程度的水肿，中央静脉出现明显点灶状坏死和淤血现象。而经受试药物干预后，较模型组比较，呈现为炎症反应明显减轻，细胞索状排列较整齐，肝内淤血和点灶状坏死明显减少，肝细胞数量增加，脂肪变性细胞减少，但联合药物用药物改善最明显，见图1-6。从油红染色结果来看，正常对照组肝细胞内出现很少量橘红色脂滴聚集，模型组肝细胞胞浆内充满大量大小不等的橘红色脂滴，细胞发生明显的肿胀。药物干预组细胞内橘红色脂滴明显少于模型组，但联合用药组细胞内橘红色脂滴少于其余用药组，如图7-12所示。

以上本实验结果显示，与模型组比较，算盘子多糖，穿破石多糖及二者多糖组合物能够较好地改善脂肪肝大鼠肝功能，但二者联合使用疗效更佳。