本发明涉及生物材料制备领域，特别是涉及一种具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物及其制备方法。
背景技术：
石墨烯作为一种典型的碳纳米材料，具有优异的物理和化学性质，如超大比表面积、优异的导电导热性能等，使其在生物、医药等领域具有很好的应用前景。然而石墨烯是由碳原子以sp2杂化形成蜂巢晶格的平面薄膜，它几乎不溶任何溶剂，在溶液中极易团聚，这些问题很大程度上限制了其实际应用。
为了拓展石墨烯在生物、医药等领域的应用，必须改善其在水相介质中的分散性和稳定性。通常的方法是对其进行表面功能化修饰，引入新的官能团赋予其新的特性。氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，经氧化后，石墨烯表面含氧官能团(如羧基、碳基等)增多而使其性质较石墨烯更加活泼，能与多种分子以共价或非共价方式结合，通过与各种含氧官能团的反应而改善本身性质。
已有研究表明，石墨烯及其衍生材料可对生物分子(如dna和蛋白质等)产生损伤作用；另外，对哺乳动物细胞而言，石墨烯类材料可通过嵌入细胞膜、与细胞膜发生疏水性作用等方式导致细胞膜损伤，从而产生细胞毒性。已有大量文献研究如何通过表面修饰降低石墨烯及其衍生材料的细胞毒性、提高其生物兼容性。但有关表面修饰如何影响石墨烯及其衍生物细胞毒性的问题并没有完全理解清楚，有待进一步的研究。更为重要的是，已有文献报道，利用石墨烯类材料对细菌的抑制特性，可将石墨烯及其衍生物用于抗菌生物材料，如制作抗菌型band-aid(创可贴)；但对于如何利用石墨烯及其衍生物的细胞毒性则还未见相关报道。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种对正常细胞生物相容性好、对肿瘤细胞毒性强的具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物及其制备方法。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)氧化石墨烯与pamam发生酰胺化反应，得到pamam功能化氧化石墨烯复合物，其中所述氧化石墨烯的表面带有羧基；
(2)所述pamam功能化氧化石墨烯复合物与所述叶酸发生酰胺化反应，其中所述pamam功能化氧化石墨烯复合物提供酰胺化反应的氨基，所述叶酸提供酰胺化反应的羧基，制得所述具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物。
石墨烯类材料可通过嵌入哺乳动物细胞的细胞膜、与细胞膜发生疏水性作用、破坏细胞膜磷脂双分子层等方式导致细胞膜损伤，从而产生细胞毒性。然而石墨烯类材料对细胞的毒性不具有明显选择性，其对正常细胞和癌细胞均可造成损伤。而石墨烯较稳定，因此采用性质较活泼的氧化石墨烯(go)，氧化石墨烯上的羧基等含氧官能团可与其他官能团发生反应。
pamam为聚酰胺-胺型树枝状高分子，其端部含有较多的氨基，因此带正电。而生物细胞膜带负电，通过静电吸引能使其更好的进入细胞，因此将石墨烯类材料与pamam结合，有利于石墨烯类材料细胞发生相互作用或进入细胞。此外石墨烯类材料的比表面积大，因此石墨烯类材料与pamam结合后，进而使较多的pamam修饰在石墨烯类材料表面，从而使pamam功能化石墨烯类材料与细胞结合能力更强，有可能提高石墨烯类材料进入细胞的效率。
优选的，pamam为四代，一个pamam分子具有64个氨基。可以理解，在其他实施例中，pamam也为一代、二代、三代等其他聚酰胺-胺型树枝状高分子。
叶酸受体是一种细胞表面蛋白，也是一个肿瘤标示物。这是因为在人体肿瘤细胞组织，叶酸受体高于正常水平；而在正常组织中，叶酸受体是非常有限的。叶酸(fa)的氨基是肿瘤细胞表面叶酸受体的识别位点，它可结合到肿瘤相关的叶酸受体，因此将石墨烯材料与叶酸结合，使得石墨烯材料被肿瘤选择性地吸收，而正常组织不吸收，从而实现石墨烯复合物对肿瘤细胞的选择性毒性，同时也提高了石墨烯复合物的生物相容性。
上述具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物的制备方法，pamam结合在带有羧基的氧化石墨烯的表面形成pamam功能化氧化石墨烯复合物。由于pamam的氨基数量较多以及空间位阻效应，pamam必然剩余未与氧化石墨烯反应的氨基。pamam功能化氧化石墨烯复合物的氨基与叶酸的羧基反应，制得具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物。叶酸上的氨基作为肿瘤细胞表面叶酸受体的识别位点未参与反应，因此肿瘤细胞表面叶酸受体的识别位点与肿瘤细胞表面叶酸受体特异性结合，使其对肿瘤细胞的选择性毒性，而对正常细胞的生物相容性好。由于pamam结构的存在，使得具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物进入肿瘤细胞更高效，进而使其具有较强的细胞毒性。
上述具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物的制备方法，条件温和，常温下即可反应，不需要高温加热，操作简单，通过表面功能化修饰得到了具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物，其有可能直接作为“物理型”抗癌药物或者作为抗肿瘤药物、蛋白质、基因等的靶向载体材料。
此外，先将氧化石墨烯与pamam反应，再与叶酸反应，而不采用先将叶酸与pamam反应，再与氧化石墨烯反应的制备顺序，可避免叶酸的氨基与氧化石墨烯的羧基反应，造成叶酸受体的识别位点减少或消失导致产物不能与肿瘤细胞特异性结合进而影响产物的选择性肿瘤细胞毒性的问题。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中pamam为过量。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)和所述步骤(2)中酰胺化反应的条件均为：在交联试剂作用下于磷酸盐缓冲溶液中反应24～72h，分离处理。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)分离处理的条件为用水透析；所述步骤(1)中分离处理后得到第一水溶液，所述第一水溶液的溶质为所述pamam功能化氧化石墨烯复合物。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)中分离处理的条件为用水透析；所述步骤(2)中分离处理后得到第二水溶液，所述第二水溶液的溶质为所述具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物。
在其中一个实施例中，所述交联试剂为edc和nhs。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中所述交联试剂与所述氧化石墨烯的质量比为5～8:1；所述步骤(2)中所述交联试剂与所述叶酸的质量比为5～8:1。
在其中一个实施例中，所述pamam功能化氧化石墨烯复合物与所述叶酸的质量比为1:1～4，其中所述pamam功能化氧化石墨烯复合物的质量以其对应的氧化石墨烯的质量计算。
在其中一个实施例中，所述氧化石墨烯由以下步骤制备得到：石墨烯在硫酸和硝酸的混合酸的作用下先于30～45℃回流0.5～2h，再于70～85℃回流0.5～2h，加入水至溶液总体积为90～100ml，再于95～110℃回流2～3h；冷却，用水透析至中性，干燥得到。
一种具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物，采用上述具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物的制备方法制得。
上述具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物，pamam结合在带有羧基的氧化石墨烯的表面形成pamam功能化氧化石墨烯复合物。由于pamam的氨基数量较多以及空间位阻效应，pamam必然剩余未与氧化石墨烯反应的氨基。pamam功能化氧化石墨烯复合物的氨基与叶酸的羧基反应，制得具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物。叶酸上的氨基作为肿瘤细胞表面叶酸受体的识别位点未参与反应，因此肿瘤细胞表面叶酸受体的识别位点与肿瘤细胞表面叶酸受体特异性结合，使其对肿瘤细胞的选择性毒性，而对正常细胞的生物相容性好。由于pamam结构的存在，使得具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物进入肿瘤细胞更高效，进而使其具有较强的细胞毒性。
附图说明
图1为实施例1的go和go-pamam-fa的透射电镜图；
图2为实施例1的go、pamam、fa及go-pamam-fa的红外谱图，分别对应图2中a、b、c、d；
图3为实施例1的go、fa、中间产物go-pamam及go-pamam-fa不同浓度条件对三种不同细胞的细胞毒性实验得到的细胞活力与浓度的曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明较佳实施例的具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物及其制备方法。其制备方法包括以下步骤。
步骤(1)、氧化石墨烯(go)与pamam发生酰胺化反应，得到pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)，其中氧化石墨烯(go)的表面带有羧基。
优选的，氧化石墨烯中的羧基的质量分数为32.8％，即羧基的浓度为7.5×10-3mol/g。优选的，pamam为四代，一个pamam分子具有64个氨基。可以理解，在其他实施例中，pamam也为一代、二代、三代等其他聚酰胺-胺型树枝状高分子。
在其中一个实施例中，pamam为过量。可以理解，为了避免叶酸的氨基与氧化石墨烯的羧基反应，pamam过量即氧化石墨烯表面的羧基完全消耗，而pamam的氨基过量。
在其中一个实施例中，步骤(1)中酰胺化反应的条件为：在交联试剂作用下于磷酸盐缓冲溶液(即pbs缓冲液)中反应24～72h，分离处理，得到pamam功能化氧化石墨烯复合物。其中，交联试剂将氧化石墨烯中的羧基与pamam分子中的氨基共价交联，将pamam高分子修饰至氧化石墨烯表面，得到pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)。
优选的，步骤(1)中酰胺化反应的时间为48h。优选的，pbs缓冲液的ph值为7.4，该ph值与人体的生理ph值一致，因此在该pbs缓冲液中制得的材料具有更好的生物相容性。
在其中一个实施例中，步骤(1)中的交联试剂为edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)。其中，edc还可活化氧化石墨烯表面的羧基，从而提高酰胺化反应效率。可以理解，在其他实施例中，交联试剂也可采用其他试剂。优选的，edc和nhs的质量比为2：3。
优选的，步骤(1)中交联试剂与氧化石墨烯的质量比为5～8:1。更优选的，步骤(1)中交联试剂与氧化石墨烯的质量比为7.5:1。
优选的，在其中一个实施例中，步骤(1)中分离处理的条件为用水透析。步骤(1)中分离处理后得到第一水溶液，第一水溶液的溶质为pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)。如此第一溶液可直接继续与叶酸反应。
可以理解，也可将第一水溶液干燥，得到pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)。
在其中一个实施例中，氧化石墨烯由以下步骤制备得到：石墨烯在硫酸和硝酸的混合酸的作用下先于30～45℃回流0.5～2h，再于70～85℃回流0.5～2h，加入水至溶液总体积为90～100ml，再于95～110℃回流2～3h；冷却，用水透析至中性，干燥得到。未经处理的石墨烯经混酸作用、加热回流处理，再经透析、干燥步骤获得氧化石墨烯。采用该方法得到的氧化石墨烯，其在水溶剂中、磷酸盐缓冲溶液和细胞培养介质中均具有良好分散性和稳定性。
优选的，硫酸和硝酸的混合酸的组成为体积比为3∶1的浓硫酸和浓硝酸。优选的，氧化石墨烯由以下步骤制备得到：石墨烯在硫酸和硝酸的混合酸的作用下先于45℃回流0.5h，再于80℃回流1h，加入水至溶液总体积为90ml，再于100℃回流2.5h；冷却，用水透析至中性(ph＝7.0)，干燥得到。
步骤(2)、pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)与叶酸(fa)发生酰胺化反应，其中pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)提供酰胺化反应的氨基，叶酸(fa)提供酰胺化反应的羧基，制得具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物(go-pamam-fa)。
步骤(2)中go-pamam的氨基相对fa的羧基过量，以使fa完全反应。优选的，pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)与叶酸的质量比为1:1～4，其中pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)的质量以其对应的氧化石墨烯的质量计算，即步骤(1)得到该pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)对应需要的氧化石墨烯的质量。更优选的，pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)与叶酸的质量比为1:2。
在其中一个实施例中，步骤(2)中酰胺化反应的条件为：在交联试剂作用下于磷酸盐缓冲溶液中反应48h，分离处理，制得具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物(go-pamam-fa)。优选的，pbs缓冲液的ph值为7.4。其中，交联试剂将叶酸中的羧基与阳离子型pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)高分子中的氨基共价交联，制得具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物(go-pamam-fa)。
在其中一个实施例中，步骤(2)中的交联试剂为edc和nhs。其中edc还可起到活化叶酸的羧基的作用，从而提高酰胺化反应效率。优选的，edc和nhs的质量比为2∶3。
优选的，步骤(2)中交联试剂与叶酸的质量比为5～8:1。更优选的，步骤(2)中交联试剂与叶酸的质量比为7.5:1。
在其中一个实施例中，步骤(2)中分离处理的条件为用水透析，步骤(2)中分离处理后得到第二水溶液，第二水溶液的溶质为具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物(go-pamam-fa)。需要用到具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物(go-pamam-fa)的水溶液时，直接将第二水溶液配置成需要的浓度即可。
在其中一个实施例中，还包括将第二水溶液干燥，得到具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物(go-pamam-fa)的步骤。
在其中一个实施例中，步骤(2)为第一水溶液与叶酸发生酰胺化反应，其中pamam功能化氧化石墨烯复合物提供酰胺化反应的氨基，叶酸提供酰胺化反应的羧基，制得具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物。优选的，第一水溶液的浓度稀释为0.5mg·ml-1，再与叶酸发生酰胺化反应。其中第一水溶液中的go-pamam溶质的质量以其对应的氧化石墨烯的质量计算，即步骤(1)得到该pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)对应需要的氧化石墨烯的质量，合成和透析过程中氧化石墨烯的损失忽略不计。
以下为具体实施例
实施例1
1)合成氧化石墨烯(go)
将80mg石墨烯加入圆底烧瓶中，溶于30ml浓h2so4和浓hno3的混酸中(浓h2so4和浓hno3的体积比为3∶1)，并在45℃回流搅拌0.5h；再升温到80℃回流搅拌1h，然后向上述溶液中加入水至溶液的总体积为90ml，再升温加热到100℃，回流搅拌2.5h。
反应结束后，空气中冷却至室温，将其装入透析袋(分子量：3500d)内，水中透析约3天，至袋内溶液呈中性；于烘箱中30℃干燥24小时后存放在干燥器中备用。制备得到的go用xps(x射线光电子能谱仪)测得羧基的质量分数为32.8％，由此得到羧基的浓度为7.5×10-3mol/g。
2)合成pamam功能化氧化石墨烯复合物(go-pamam)
pamam试剂购于sigma公司，pamam试剂为分散在甲醇中质量浓度为10％的溶液。其中，pamam为第四代，其分子量为14214.17。该pamam试剂的密度为0.813g/ml，故200ulpamam试剂中pamam的摩尔量为1×10-6mol，而1个pamam分子有64个氨基，故200ulpamam试剂中氨基的摩尔量为6.4×10-5mol。因此，pamam分子的氨基相对于氧化石墨烯的羧基是过量的。
将4mg氧化石墨烯溶于2mlph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中。再加入20mgedc和30mgnhs，搅拌至edc和nhs完全溶解，继续搅拌1h，活化氧化石墨烯的羧基。而后加入200μlpamam，继续搅拌下反应48h。反应结束后，将其装入透析袋(分子量：15kd)内，水中透析约3天，取出透析袋中的溶液得到第一水溶液，第一水溶液的溶质为go-pamam。用水将第一溶液配成0.5mg·ml-1的go-pamam溶液。(其中go-pamam溶质的质量是以加入的氧化石墨烯的质量为计算，合成和透析过程中氧化石墨烯的损失忽略不计)
3)合成具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物(go-pamam-fa)
将4mg叶酸溶于2mlph为7.4的磷酸缓冲溶液中。再加入20mgedc和30mgnhs，搅拌至edc和nhs完全溶解，继续搅拌1h，活化叶酸上的羧基。而后加入4ml0.5mg·ml-1go-pamam溶液，继续搅拌48h。反应结束后，将其装入透析袋(分子量：3500d)内，水中透析约3天，取出透析袋中的溶液得到第二水溶液，第二水溶液的溶质为go-pamam-fa。用无抗生素含10％牛血清的细胞培养基将第二溶液分别配成浓度为5μg·ml-1、15μg·ml-1、25μg·ml-1、50μg·ml-1、100μg·ml-1的go-pamam-fa溶液以进行细胞毒性实验。(其中go-pamam-fa的质量是以加入的go-pamam对应的氧化石墨烯的质量计算，合成和透析过程中氧化石墨烯的损失忽略不计)将第二水溶液干燥，得到go-pamam-fa。
实施例2
1)合成氧化石墨烯(go)与实施例1相类似，不同之处在于加热回流的条件为先于35℃回流搅拌2h；再升温到85℃回流搅拌0.5h，然后向上述溶液中加入水至溶液的总体积为100ml，再升温加热到95℃，回流搅拌3h。
2)合成pamam功能化氧化石墨烯复合物与实施例1相类似，不同之处在于酰胺化反应的时间为24h。
3)合成具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物与实施例1相类似，不同之处在于酰胺化反应的时间为72h。
实施例3
1)合成氧化石墨烯(go)的步骤与实施例1相类似，不同之处在于加热回流的条件为先于30℃回流搅拌1h；再升温到70℃回流搅拌2h，然后向上述溶液中加入水至溶液的总体积为95ml，再升温加热到90℃，回流搅拌2h。
2)合成pamam功能化氧化石墨烯复合物的步骤与实施例1相类似，不同之处在于酰胺化反应的时间为72h。
3)合成具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物的步骤与实施例1相类似，不同之处在于酰胺化反应的时间为48h。
实施例4
实施例4的步骤与实施例1相类似，不同之处在于pamam试剂为第三代pamam。
(一)形貌分析
将实施例1得到的氧化石墨烯和具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物分别采用透射电镜分析，得到透射电镜图，如图1所示。图1a表明，石墨烯经混酸氧化处理后获得的氧化石墨烯具有相对光滑的表面和折叠结构。图1b表明，通过共价交联方法成功将pamam和fa修饰至go的表面。
(二)红外分析
将实施例1制备的go、原料pamam、原料fa及产物go-pamam-fa分别进行红外光谱分析，得到的红外谱图分别如图2中a、b、c、d所示。
产物go-pamam-fa在3431cm-1、3291cm-1和3090cm-1有吸收峰，对应着o-h和n-h的伸缩振动，与go的o-h的伸缩振动吸收峰(3443cm-1)以及原料pamam的n-h伸缩振动吸收峰(3281cm-1、3100cm-1)对应。
产物go-pamam-fa在1652cm-1有吸收峰，对应着c＝o的伸缩振动及c＝c骨架伸缩振动；与原料pamam的c＝o的伸缩振动吸收峰(1672cm-1)、fa的c＝o的伸缩振动吸收峰(1624cm-1)、go的c＝o的伸缩振动吸收峰(1729cm-1)及石墨烯片层的c＝c骨架伸缩振动(1652cm-1)对应。
通过红外谱图分析，采用本发明具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物的制备方法，成功将pamam和fa修饰至go的表面，得到具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物(go-pamam-fa)。
(三)细胞毒性实验
将实施例1制备的go、原料fa、中间产物go-pamam及产物go-pamam-fa分别配置成5μg·ml-1、15μg·ml-1、25μg·ml-1、50μg·ml-1、100μg·ml-1不同浓度的溶液进行细胞毒性实验。肿瘤细胞毒性实验运用水溶性四唑盐(wst-8法)，且分别测定了go、fa、go-pamam和go-pamam-fa对正常细胞(huvec，人脐带静脉内皮细胞)、hela(宫颈癌细胞)和mcf-7(乳腺癌细胞)三种细胞的体外细胞毒性，得到的细胞活力与样品浓度的曲线图分别如图3中a、b、c、d所示。
wst-8检测具体步骤如下：细胞传代时将huvec细胞以1.0万/孔、mcf-7细胞以1.4万/孔、hela细胞以1.8万/孔的个数分别接种到96孔培养板中，在培养条件为5wt.％co2和37℃的细胞培养箱中培养24h，用pbs清洗两遍。换上含不同浓度样品、无抗生素的rpmi-1640培养基中培养24h后，用pbs清洗两遍，然后每个孔中加入100μlrpmi-1640培养基和10μlwst-8混合溶液。继续培养4h，培养基溶液变成橙黄色。采用多功能酶标仪(infinitem1000,tecan,switzerland)检测溶液在450nm处的吸光度值。检测实验平行进行三次以上。
从图3a中可以得知，氧化石墨烯go对三种细胞均具有细胞毒性，而且细胞毒性随着氧化石墨烯go的浓度增高而增大。
从图3b中可以得知，叶酸对三种细胞都具有很好的生物相容性。
从图3c中可以得知，中间产物go-pamam对三种细胞均具有毒性，且其细胞毒性与氧化石墨烯go相比，明显增强。
从图3d中可以得知，在go-pamam-fa的浓度达到50μg·ml-1时，huvec的细胞活力约82％，hela的细胞活力开始明显降低，约为68％，而mcf-7的细胞活力只有约38％。在氧化石墨烯-聚酰胺-胺-叶酸纳米复合物达到最大浓度100μg·ml-1时，huvec的细胞活力仍有80％以上，hela的细胞活力约为46％，而mcf-7的细胞活力只有约31％。这表明具有选择性肿瘤细胞毒性石墨烯复合物go-pamam-fa表现出较强的选择性细胞毒性，其对hela和mcf-7肿瘤细胞具有较强的毒性，而对huvec正常细胞具有较好的生物相容性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。