本发明属于纳米材料制备和生物医学领域，一种基于DNA材料的磁性纳米治疗诊断试剂及其制备和应用。
背景技术：
磁性氧化铁纳米颗粒的作为药物输送载体已经得到了广泛的研究(Acc. Chem. Res. 2011 ,44 , 883 ), 这将磁性氧化铁纳米颗粒作为MRI成像探针直接升级为集诊断和治疗元素为一体的治疗诊断试剂（Theranostics 2012,2 , 86）。通常，磁性氧化铁纳米颗粒会与治疗试剂一起被载入基于聚合物的基质中，并且研制出各种各样的用于诊断治疗用途的磁性氧化铁纳米颗粒(Biomaterials, 2011, 32 , 9364)。比如，Nasongkla et al .研发出一种基于磁性氧化铁纳米颗粒治疗诊断试剂，被命名为SPIO-doxorubicin (Dox)-cRGD 微粒，该微粒可同时进行恶性肿瘤成像和可示踪药物输送（Nano Lett, 2006 , 6 , 2427）。
由于具有较高水平的结构可编程性、显著的生物相容性以及容易修饰官能团等优点，DNA被认为是良好的药物载体材料，特别是在抗肿瘤药物输送方面（Small , 2013，9 (18), 3082−3087）。很多研究者发现DNA在没有转染试剂的情况下就能很好地穿过哺乳动物细胞的细胞膜（Chem. Commun，2013，49 (20), 2010−2012）。除此之外，DNA分子操控技术日趋成熟，通过设计特定的碱基序列，可以构建出多向性的DNA三维结构，如带状结构、管状结构、2/3D晶体结构等等。该分子操控技术为DNA很好的应用在生物医药领域的研究奠定了基础。例如，Dongming Huang课题组利用六点星状的tiles组装DNA二十面体，连接配体后可作为阿霉素的载体，用于癌症的治疗(ACS Nano, 2011, 5(8): 6156-63)。
为了提高成像的灵敏度和磁靶向性，增强氧化铁纳米颗粒磁的性质成为关键。其中一种增大磁饱和值的方式就是掺杂二价金属元素，常用来掺杂的金属离子像Zn, Co, Ni, Cu和 Mn等。根据我们以前的研究表明，二巯基丁二酸（DMSA）包裹的Zn2+掺杂的Fe3O4纳米颗粒（DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs）具有较高的磁饱和值和生物相容性。并且通过其表面修饰肿瘤靶向肽环状的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（cRGD），最终可以得到了一种肿瘤靶向性的纳米复合磁性材料。此外，DNA四面体可以作为良好的药物输送载体。因为在众多的DNA三维结构中， DNA四面体（TND）具有最稳定的结构，且DNA双螺旋结构碱基对之间能够嵌入一些药物分子，比如说是平面存在芳香环的阿霉素。因此，制备以DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs为基质，增加RGD为靶向抗体且连接有DNA四面体药物载体的新型治疗诊断系统，具有较高的研究意义和应用价值。
技术实现要素：
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于DNA材料的磁性纳米治疗诊断试剂及其制备和应用。该方法控制反应条件制备具有高磁饱和值的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs，并以此纳米颗粒为基质，同时连接靶向分子c(RGD)以及药物载体DNA四面体，从而得到具有磁共振成像诊断和药物治疗的试剂。该治疗诊断具有性能稳定、生物相容性好、磁共振信号均较强以及靶向给药的特点。所得的产物能满足临床应用的需求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于DNA材料的磁性纳米治疗诊断试剂的制备方法，其特征在于：
（1）DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的制备
首先把FeSO4•(NH4)2SO4•6H2O 和ZnSO4溶解在20ml的水里，使得前体达到1.73×10-3mol Fe2+ and 2.67×10-4 mol Zn2+ 的目的，其次，把10ml油酸、10ml无水乙醇和1g NaOH混合，在常温下磁力搅拌直到得到均匀的溶液，再者，把前体Fe2+和Zn2+的混合溶液倒进该均匀溶液中，搅拌几分钟以后，混合溶液变成深棕色，最后把该溶液转移进50ml反应釜中，密封，230度加热15个小时，反应结束以后，冷却至室温，产品沉积在釜底，纳米颗粒分散在环己烷取出，再把乙醇加入分散有纳米颗粒的环己烷中，沉淀出纳米颗粒，最后纳米颗粒再用乙醇反复洗数次，颗粒表面的油酸用DMSA进行两次交换，使得纳米颗粒彻底分散在水相中；
（2）DNA四面体的制备
DNA四面体（TDN）是由TDN-1，TDN-2，TDN-3，氨基修饰的TDN-4，修饰在5’端记为NH3-TDN-4，四条单链组装而成的，取上述50 μM 的DNA单链TDN-1，TDN-2，TDN-3，NH3-TDN-4各2μL加入到42μL Tris-MgCl2缓冲液中， 10 mM Tris 和50 mM MgCl2 ，pH 8；将上述样品溶液置于PCR仪中在95℃保温10分钟后快速冷却至4℃，继续反应30分钟，通过碱基互补配对自组装成即可得到浓度为2μM 的NH3-DNA四面体；
（3）治疗诊断试剂TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制备
取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中，缓冲液PH=7.4， 0.05M，并用0.2M的盐酸调解PH，把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应，以活化羧基，将混合物用PBS 缓冲液磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，缓冲液PH=7.4， 0.01M，将活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中，把c(RGD)和NH3-DNA四面体溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室温反应，混合物用PBS 缓冲液磁分离洗涤3 次以除去多余的游离抗体和NH3-DNA四面体，缓冲液PH=7.4， 0.01M，最后重悬于PBS中，PBS0.01M，pH 7.4，4℃保存。
所述的治疗诊断试剂的磁共振成像诊断部分是Zn0.4Fe2.6O4 NPs。
所述的治疗诊断试剂的药物治疗载体部分是DNA四面体。
所述的治疗诊断试剂的靶向分子是氨基修饰的c(RGD)。
所述的DNA四面体是氨基修饰的。
所述的DNA四面体和c(RGD)的分子个数之比为0.1-10。
所述的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs与DNA四面体和c(RGD)的分子个数之比为1:10:10。
一种基于DNA材料的磁性纳米治疗诊断试剂，其特征在于，根据上述任一所述方法制备得到。
一种基于DNA材料的磁性纳米治疗诊断试剂的应用。
DNA四面体（TDN）是由TDN-1，TDN-2，TDN-3，氨基修饰的TDN-4，修饰在5’端记为NH3-TDN-4，四条单链组装而成的，其序列为tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55，tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55，ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55，acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagta 55。
本发明的优点在于：
本发明以高磁饱和值的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs为基质，通过偶联的方法将靶向分子c(RGD)和DNA四面体连接到其表面，即可得到具有靶向性的治疗诊断试剂。所用原料生物安全性高。本发明制备的诊断治疗试剂具有良好的物理化学稳定性、靶向性磁共振成像和药物输送的性能。本发明所用的药物输送载体DNA四面体具有良好的细胞穿透性和生物相容性。本发明中的制备方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
1．DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的制备
首先把FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O 和ZnSO4溶解在20ml的水里，使得前体达到1.73×10-3mol Fe2+ and 2.67×10-4 mol Zn2+ 的目的。其次，把10ml油酸、10ml无水乙醇和1g NaOH混合，在常温下磁力搅拌直到得到均匀的溶液。再者，把前体Fe2+和Zn2+的混合溶液倒进该均匀溶液中，搅拌几分钟以后，混合溶液变成深棕色。最后把该溶液转移进50ml反应釜中，密封，230度加热15个小时。反应结束以后，冷却至室温。产品沉积在釜底，纳米颗粒分散在环己烷取出。再把乙醇加入分散有纳米颗粒的环己烷中，沉淀出纳米颗粒，最后纳米颗粒再用乙醇反复洗数次。颗粒表面的油酸用DMSA进行两次交换，使得纳米颗粒彻底分散在水相中。
2. DNA四面体的制备
DNA四面体（TDN）是由TDN-1，TDN-2，TDN-3，NH3-TDN-4四条单链组装而成的。取上述50 μM 的DNA单链TDN-1，TDN-2，TDN-3，NH3-TDN-4各2μL加入到42μL Tris-MgCl2缓冲液中（10 mM Tris 和50 mM MgCl2 ，pH 8）。将上述样品溶液置于PCR仪中在95℃保温10分钟后快速冷却至4℃，继续反应30分钟，通过碱基互补配对自组装成即可得到浓度为2μM 的NH3-DNA四面体。
3. 治疗诊断试剂TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制备
取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中（PH=7.4，0.05M）中，并用0.2M的盐酸调解PH。把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应，以活化羧基。将混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中。把c(RGD)和NH3-DNA四面体（分子个数之比1:1）溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室温反应。混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4，0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的游离抗体和NH3-DNA四面体，最后重悬于PBS(0.01M，pH 7.4) 中，4℃保存。
经表征DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的水和动力学半径为22nm，Zeta电势为-30mV；TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs水和动力学半径为35nm，Zeta电势为-5mV。
实施例2
步骤1、2同实施例1。
3. 治疗诊断试剂TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制备
取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的盐酸调解PH。把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应，以活化羧基。将混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中。把c(RGD)和NH3-DNA四面体（分子个数之比2:1）溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室温反应。混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的游离抗体和NH3-DNA四面体，最后重悬于PBS(0.01M，pH 7.4) 中，4℃保存。
经表征DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的水和动力学半径为22nm，Zeta电势为-30mV；TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs水和动力学半径为33nm，Zeta电势为-11mV。
实施例3
步骤1、2同实施例1。
3. 治疗诊断试剂TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制备
取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的盐酸调解PH。把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应，以活化羧基。将混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中。把c(RGD)和NH3-DNA四面体（分子个数之比1:2）溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室温反应。混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的游离抗体和NH3-DNA四面体，最后重悬于PBS(0.01M，pH 7.4) 中，4℃保存。
经表征DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的水和动力学半径为22nm，Zeta电势为-30mV；TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs水和动力学半径为41nm，Zeta电势为5mV。
实施例4
步骤1、2同实施例1。
3. 治疗诊断试剂TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制备
取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的盐酸调解PH。把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应，以活化羧基。将混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中。把c(RGD)和NH3-DNA四面体（分子个数之比3:1）溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室温反应。混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的游离抗体和NH3-DNA四面体，最后重悬于PBS(0.01M，pH 7.4) 中，4℃保存。
经表征DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的水和动力学半径为22nm，Zeta电势为-30mV
TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs水和动力学半径为39nm，Zeta电势为-14mV。
<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
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