联合腺苷及nNOS抑制剂在制备预防中枢神经系统氧中毒药物或食品中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是联合腺苷及nNOS抑制剂在制备预防中枢神经系统氧中毒药物或食品中的应用。

背景技术：

在中枢神经系统中，腺苷是一种体内固有、效用明确的抑制性物质。在突触间隙，由神经元和星形胶质细胞释放的ATP可经胞外核苷酸酶(ecto-nucleotidase，EN)作用快速降解为腺苷。此外，体内甲基转移反应也是它的一个重要来源。它与神经突触前膜上腺苷A1受体结合后可抑制兴奋性神经递质谷氨酸的释放，与突触后膜上A1受体结合，则可激活钾离子通道使突触后神经元超极化而阻滞兴奋性的传播。通过调控突触间隙中腺苷的含量，有望找到防治癫痫的新措施(参考文献：Aronica E,Sandau US,Iyer A,Boison D.Glial adenosine kinase--a neuropathological marker of the epileptic brain.Neurochem Int,2013,63(7):688-95.)。

一氧化氮(Nitric oxide，NO)在中枢神经系统氧中毒发生中具有非常重要的作用。它主要通过两条途径促进氧惊厥的发作，一是逆转了高压氧的缩血管效应，使得输送到脑组织中的氧大量增加，加剧了氧的毒性效应；二是它与高压氧暴露时产生的超氧阴离子(O₂·^-)生成了大量的过氧亚硝酸盐(ONOO^-)，进而对蛋白质等多种物质进行氧化和亚硝基化，最终破坏了受体、离子通道等的正常功能，造成神经毒性。由神经细胞中的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)生成的NO在上述过程中占有主导地位。采用基因敲除和药物抑制nNOS等手段，都可以有效延缓或减轻氧惊厥的发作(参考文献：Demchenko IT,Moskvin AN,Krivchenko AI,Piantadosi CA,Allen BW.Nitric oxide-mediated central sympathetic excitation promotes CNS and pulmonary O2toxicity.J Appl Physiol,2012,112(11):1814-23.)。

腺苷Adenosine(中文名：9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，英文简称：ADO，CA登记号：58-61-7)是一种有效的中枢神经系统抑制剂，其分子结构式如下所示：

神经元型一氧化氮合酶(nNOS)抑制剂7-Nitroindazole(中文名：7-硝基吲唑，英文简称：7-NI，CA登记号：2942-42-9)是一种强效的nNOS抑制剂，能够有效地减少中枢神经系统内的一氧化氮产生量，其分子结构式如下所示：

联合腺苷及nNOS抑制剂的应用主要出现在腺苷减少豚鼠心室肌细胞内游离钙浓度(参考文献：马会杰，董梅，吉恩生.腺苷减少豚鼠心室肌细胞内游离钙浓度.中国应用生理学杂志,2006,22(1):58-62)。至今尚未见到有关联合腺苷及nNOS抑制剂和中枢神经系统氧中毒相关的报道。

中枢神经系统氧中毒，是指机体吸入高于一定压力的氧气一定时间后，破坏了体内正常的氧化还原平衡，对机体产生毒性作用。主要发生在临床多种疾病的高压氧治疗，军事和民用潜水、高气压作业，以及潜艇失事后艇员离艇脱险等过程中。当吸入气中氧分压超过280kPa(相当于18米水深)时，毒性反应会在较短时间内发生，最剧烈的反应表现为全身惊厥大发作，称为氧惊厥，它严重地威胁着呼吸高压氧人员的生命安全，也极大地限制了潜水、高气压作业的效率。目前对氧惊厥尚缺乏主动的有效预防措施，主要为被动地限制吸氧的压力和时程，包括间歇吸氧等。找出能主动预防氧惊厥的措施，以便实现更高压力(更大深度)下安全用氧，对于潜水、高气压作业，以及高压氧治疗等都具有重要意义。(参考文献：徐伟刚.潜水医学.北京，科学出版社，2016:145-154)。

到目前为止，还没有得到公认的预防中枢神经系统氧中毒的药物。

发明人长期致力于中枢神经系统氧中毒方面的研究，在中国专利申请号：CN201210157924.3，公开号为CN102697798A，发明名称：腺苷(ADO)在制备预防中枢神经系统氧中毒药物或食品中的应用的专利文献中，发明人通过动物(BALB/C小鼠，雄性)实验验证了腺苷能有效预防中枢神经系统氧中毒现象的发生，披露了腺苷在制备预防中枢神经系统氧中毒药物或食品中的应用。

由于中枢神经系统氧中毒的发生存在多种不同的通路，针对不同的靶点和通路，采用联合应对的措施，将有可能优于单一的预防措施，甚至产生1+1>2的效果。

本技术领域一直在寻找能够预防中枢神经系统氧中毒发生的药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决目前缺乏能够主动预防中枢神经系统氧中毒的有效措施的问题。基于发明人原有的工作基础，在本发明中，一方面增加了对中枢神经系统氧中毒有明确抑制作用的物质——腺苷的含量，另一方面抑制了促发中枢神经系统氧中毒发生的重要因素——NO的产生，通过一正一反、双管齐下的方法，找出预防中枢神经系统氧中毒的更强有力的措施。

腺苷(Adenosine,ADO,9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤)具有中枢抑制作用，可用于预防中枢神经系统氧中毒；nNOS抑制剂可减少中枢神经系统内NO的产生，目前已经开发应用的nNOS抑制剂只有7-NI，单独使用nNOS抑制剂7-NI也可用于对抗中枢神经系统氧中毒。腺苷和NO在体内的产生和代谢均与高压氧暴露时氧的高浓度状态有关，若联合应用腺苷和7-NI有可能产生更加明显的抑制中枢神经系统氧中毒的作用。本发明人分别选择了腺苷、7-NI、联合腺苷&7-NI进行动物实验。

实验结果发现，ADO、7-NI均有预防中枢神经系统氧中毒的作用，联合ADO&7-NI产生的预防作用则最为明显。

此外，实验结果也发现，联合使用ADO&7-NI时，除了可以产生更为显著的预防作用，其中每种物质的用量均比单独使用时更少。

本发明的第一方面，提供腺苷和nNOS抑制剂联用在制备预防中枢神经系统氧中毒药物或食品中的应用。

所述的nNOS抑制剂为7-硝基吲唑(7-NI,7-Nitroindazole)。

较优的，所述的预防中枢神经系统氧中毒的药物或食品用于预防中枢神经系统氧中毒引起的氧惊厥。本发明通过动物实验验证了联合腺苷和7-硝基吲唑能够有效预防中枢神经系统氧中毒，特别是氧惊厥现象的发生。

较优的，所述的药物是以腺苷和7-硝基吲唑为活性成分的药物组合物，或是包含腺苷和7-硝基吲唑的药物组合物。

较优的，所述的药物组合物中腺苷和7-硝基吲唑的重量范围分别为腺苷10μg～160μg，7-硝基吲唑15μg～60μg，在此范围内二者比重可任意搭配。

较优的，所述的药物中还包括常用的药物辅料。所述的药物辅料为稀释剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、崩裂剂、香味剂、甜味剂中的一种或两种以上。所述的药物的剂型为口服剂或注射剂。

较优的，所述的食品是在日常食品中加入腺苷和7-硝基吲唑。所述的食品的形态为固态或液态。所述的食品也可作为保健食品。

本发明的第二方面，提供一种预防中枢神经系统氧中毒的药物，所述的药物是以腺苷和7-硝基吲唑为活性成分的药物组合物，或是包含腺苷和7-硝基吲唑的药物组合物。

所述的药物中还包括常用的药物辅料。所述的药物辅料为稀释剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、崩裂剂、香味剂、甜味剂中的一种或两种以上。所述的药物的剂型为口服剂或注射剂。

本发明的第三方面，提供一种预防中枢神经系统氧中毒的食品，所述的食品是在日常食品中加入腺苷和7-硝基吲唑。所述的食品的形态为固态或液态。所述的食品也可作为保健食品。

本发明优点在于：

1、与单独使用其中一种物质相比，联合使用可以更加有效地预防中枢神经系统氧中毒的发生；

2、联合使用腺苷和7-硝基吲唑时，其中每种物质的用量都比单独使用时更少，但可以实现更强的预防氧中毒作用，证明两者具有协同作用；

3、本发明提供了一种联合腺苷和nNOS抑制剂的新用途：在制备预防中枢神经系统氧中毒药物或食品中的应用，解决了目前缺乏能够主动预防中枢神经系统氧中毒的有效措施的问题。本发明通过动物实验证明了联合腺苷和7-硝基吲唑能有效地延缓中枢神经系统氧中毒现象的发生，与传统的只能通过严格限制吸氧的压力和时间来进行预防的方法相比，使用本发明中的方法，将可以在更高的压力下，更长时间地吸氧，从而进一步扩大了高压氧在潜水和高气压医学中的用途。

附图说明

图1为大鼠服用不同剂量的联合腺苷&7-NI时，中枢神经系统氧中毒惊厥潜伏期的比较。

图2为大鼠服用不同剂量的腺苷时，中枢神经系统氧中毒惊厥潜伏期的比较。

图3为大鼠服用不同剂量的nNOS抑制剂7-NI时，中枢神经系统氧中毒惊厥潜伏期的比较。

图4为大鼠服用腺苷，7-NI，以及联合ADO&7-NI时，中枢神经系统氧中毒惊厥潜伏期的比较。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例，以下试剂如无特殊说明均为市售。

实验数据说明：给大鼠进行侧脑室注射各种药物后，各组大鼠惊厥潜伏期以x±s表示，采用单因素ANOVA分析组间差异，然后使用Student-Newman-Keuls检验进行两两比较。P<0.05为差异具有统计学意义。所有的统计分析用SPSS 11.5软件执行。各组大鼠惊厥潜伏期的比较见附图，其中：*P<0.05，**P<0.01。

实施例1：人工脑脊液及5％DMSO(二甲基亚砜)的配制

配制人工脑脊液及5％DMSO，所需试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

人工脑脊液的配制：氯化钠6.279g，氯化钾0.216g，氯化钙0.353g，氯化镁0.488g，碳酸氢钠1.932g，葡萄糖0.6g，磷酸氢二钠0.358g，双蒸水加至1000ml。通入含95％O₂—5％CO₂混合气体至饱和，pH 7.3～7.4。

5％DMSO人工脑脊液的配制：纯DMSO 500μl，加入9500μl上述人工脑脊液，震荡、混匀即可。

实施例2：用人工脑脊液及5％DMSO配制不同浓度的腺苷&7-NI混合溶液

腺苷，购自Tocris Bioscience公司，纯度>99％。

nNOS抑制剂7-NI，购自Tocris Bioscience公司，纯度>98％。

精密称取腺苷5mg，加入到实施例1配制的9.5ml人工脑脊液中，振荡混匀，使腺苷完全溶解，制成储备液。

精密称取7-NI 20mg，加入到500μl纯DMSO中内，震荡混匀，再加入9500μl上述储备液，旋即超声波震荡乳化制成浓度分别为腺苷0.5mg/ml&7-NI 2mg/ml的混合悬浊液，此为储备液。

取1ml储备液，加入1ml 5％DMSO人工脑脊液，混匀，制成腺苷0.25mg/ml(μg/μl)&7-NI 1mg/ml(μg/μl)的混合溶液。

另取1ml储备液，加入3ml人工脑脊液，混匀，制成腺苷0.125mg/ml(μg/μl)&7-NI 0.5mg/ml(μg/μl)的混合溶液。

所有溶液在脑室注射前经微孔滤膜过滤除菌。

实施例3：不同剂量的联合ADO&7-NI对大鼠氧惊厥潜伏期的影响

取Sprague-Dawley(SD)大鼠32只，雄性，体质量250±10g，由上海西普尔―必凯实验动物有限公司提供。随机平均分为4组，即溶剂对照组，低、中、高剂量给药组。

1)用腹腔注射3％戊巴比妥法将大鼠麻醉后，固定于脑立体定位仪上。保持头顶部水平，去毛，用75％酒精棉球消毒皮肤后，沿前正中线剪开头顶部皮肤，分离皮下组织，剥离刮掉骨膜，暴露前囟。取前囟后2mm，中线右侧旁开1.5mm为侧脑室注射点，用颅骨钻在该点钻开一直径为0.5mm的小孔，将固定在侧脑室定位仪垂直臂的侧脑室注射外管插入此孔中，深度为2mm，用牙科水泥将其固定于颅骨，缝合皮肤。全部过程均无菌操作。术后将大鼠继续饲养。

2)埋管手术3天后，乙醚吸入法将大鼠麻醉，用灭菌微量注射器分别吸取0.125&0.5，0.25&1，0.5&2μg/μl的联合ADO&7-NI溶液20μl，经预先置好的套管给大鼠进行侧脑室注射，低、中、高剂量组的给药量(Ado&7-NI)分别为：2.5μg&10μg、5μg&20μg以及10μg&40μg。溶剂对照组注射20μl 5％DMSO人工脑脊液。所有注射在30秒内完成，注射完后继续留针30秒。

3)脑室注射结束10min后，将各组大鼠分别置于加压舱内，每次1只。用纯氧置换舱内空气，待测氧仪显示舱内氧浓度达到99％以上时，以1ATA/min的速度匀速加压至6ATA，保持压力稳定，密切观察大鼠的行为变化，待大鼠出现颈项强直、角弓反张等表现时，表明发生了惊厥大发作。(该标准是国内外公认的判断中枢神经系统氧中毒发作的行为学标准。参考文献：Domachevsky L,Rachmany L,Barak Y,Rubovitch V,Abramovich A,Pick CG.Hyperbaric oxygen-induced seizures cause a transient decrement in cognitive function.Neuroscience,2013,247:328-34.)记录从舱内压力达到6ATA开始直至发生惊厥大发作之间的时间，作为惊厥潜伏期(CNS-OT latency)。结果如图1。待大鼠发生第一次惊厥大发作后，以1ATA/min的速度开始减压，直至舱内压力恢复至正常大气压。

实验结果见图1，对照组氧惊厥潜伏期平均时间为20.50±1.72min，Ado&7-NI低剂量组(2.5μg&10μg)的氧惊厥潜伏期平均时间为24.90.15±1.60min，中剂量组(5μg&20μg)的氧惊厥潜伏期平均时间为34.30±1.89min，高剂量组(10μg&40μg)的氧惊厥潜伏期平均时间为69.50±2.42min。与对照组相比，联合Ado&7-NI低、中、高剂量组的惊厥潜伏期均显著延长，有非常显著的统计学差异。低、中、高剂量组之间惊厥潜伏期也存在显著性差异，说明具有剂量依赖性。

实施例4：联合ADO&7-NI与单独使用腺苷对大鼠惊厥潜伏期影响的比较实验

按照实施例2和实施例3所示方法，用5％DMSO人工脑脊液配置腺苷溶液，同时给大鼠进行侧脑室注射腺苷，进行高压氧暴露，记录惊厥潜伏期。低、中、高剂量组的给药量分别为40μg、80μg、160μg，溶剂对照组注射20μl 5％DMSO人工脑脊液。结果如图2。

由图2可见，侧脑室注射40μg的腺苷，CNS-OT潜伏期与对照组相比未见显著性差异。侧脑室注射80、160μg的腺苷均可使CNS-OT潜伏期显著延长，且组间存在一定的量效关系。对比图1和图2可见，联合ADO&7-NI高剂量组(10μg&40μg)的氧惊厥潜伏期平均时间明显长于腺苷高剂量组(160μg)的氧惊厥潜伏期平均时间，表明在使用联合ADO&7-NI时，腺苷的用量更少，但预防效果却更好。

实施例5：联合ADO&7-NI与单独使用7-NI对大鼠惊厥潜伏期影响的比较实验

按照实施例2和实施例3所示方法，用5％DMSO人工脑脊液配置nNOS抑制剂7-NI溶液，同时给大鼠进行侧脑室注射7-NI溶液，进行高压氧暴露，记录惊厥潜伏期。低、中、高剂量组的给药量分别为15μg、30μg、60μg，溶剂对照组注射20μl 5％DMSO人工脑脊液。结果如图3。

由图3可见，侧脑室注射15μg的7-NI，CNS-OT潜伏期与对照组相比未见显著性差异。侧脑室注射30μg、60μg的7-NI均可使CNS-OT潜伏期显著延长，且各组之间存在一定的量效关系。对比图1和图3可见，联合ADO&7-NI高剂量组(10μg&40μg)的氧惊厥潜伏期平均时间明显长于7-NI高剂量组(60μg)的氧惊厥潜伏期平均时间，表明在使用联合ADO&7-NI时，7-NI的用量更少，但预防效果却更好。

实施例6：联合ADO&7-NI对大鼠氧惊厥潜伏期影响的比较实验

按照实施例2和实施例3所示方法，用5％DMSO人工脑脊液分别配置腺苷、7-NI、联合ADO&7-NI溶液，同时给大鼠分别进行侧脑室注射以上溶液后进行高压氧暴露，记录惊厥潜伏期。各剂量组的给药量分别为腺苷10μg、7-NI 40μg、联合ADO&7-NI 10&40μg，溶剂对照组注射20μl人工脑脊液。结果如图4。

由图4可见，40μg的7-NI和10&40μg的联合ADO&7-NI可使CNS-OT潜伏期延长，而10μg的腺苷并不能使大鼠氧惊厥潜伏期延长。联合ADO&7-NI对于大鼠氧惊厥发作潜伏期的延长作用，明显优于单独使用同剂量的各药物。

上述动物实验表明，联合ADO&7-NI经中枢直接给药后，可剂量依赖地延长高压氧暴露导致惊厥发作的潜伏期，且联合ADO&7-NI的预防效果明显优于单独使用腺苷或7-NI，因此可用于制备预防中枢神经系统氧中毒的药物或食品。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。