本发明涉及原发性三叉神经痛药物用途发明领域，尤其是涉及长非编码核糖核酸(LncRNA)uc.48+小干扰RNA可用于在制备缓解原发性三叉神经痛镇痛治疗药物中的应用，其作用机理涉及抑制三叉神经节嘌呤2X(P2X)4受体和降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)介导的痛觉信息传递。
背景技术：
：：疼痛是大多数疾病具有的共同症状，是人类共有而个体差异很大的一种不愉快的感觉。三叉神经痛(trigeminalneuralgia,TN)是指三叉神经分布区域内反复发作的阵发性剧烈疼痛，在临床上发病率较高，对病人的生活影响较大。疼痛发作时表现为骤然发生的闪电样、短暂而剧烈的疼痛，常难以忍受，疼痛可以像电击、抽痛、刀割等，每次发作持续几秒至1-2分钟不等，突然发作，突然停止，间歇期正常，发作反复，春季和冬季较容易发病。目前已经明确，三叉神经痛是一种慢性疼痛综合症，治疗的方法有很多，但是还没有可靠而有效的标准化治疗方法，一般分为无创治疗和手术治疗。前者包括药物治疗、伽玛刀治疗和神经阻滞治疗等；后者包括各种末梢神经切断术、半月神经节和神经血管减压术等。治疗三叉神经痛首选药物治疗，对于效果不理想或者出现严重副作用因而不能继续服药的病人而言，可以考虑进行神经阻滞手术，或者采用其它手术和治疗方法，但临床上治疗药物虽然较多，可有效而副作用较小的药很少，而且有些药物可能一开始有效但很快产生耐药性，给治疗带来很大困难，常无法达到理想的治疗效果。手术治疗效果较明显，但适应症少，适用范围小，副作用大，破坏力强，影响病人生活质量，往往病人难以接受，所以临床使用有限。三叉神经痛发作反复，疼痛剧烈，让人难以忍受，并且临床没有可靠有效的治疗方法，给病人及其家属的生活都带来极大的痛苦，因此一直以来都成为人们研究的重点。嘌呤类物质三磷酸腺苷(ATP)作为重要的信使物质参与痛觉信息传递。嘌呤(Purine)受体分为嘌呤1和嘌呤2(Purine1，Purine2；P1，P2)受体，ATP及其类似物作用于P2受体。P2受体分为配体门控性离子通道型受体(P2X受体)和G蛋白偶联型受体(P2Y受体)。P2X受体有七种亚型(P2X1-7)。P2X4受体属嘌呤受体家族中的P2X系列亚型，可以广泛表达于脑与脊髓中的神经小胶质细胞表面。新的研究表明该受体在构建和维持神经病理性疼痛上扮演着很重要的角色。动物实验表明在体外培养活化小胶质细胞，然后鞘内注射活化的小胶质细胞，3-5h后则诱发异常性疼痛。神经病理性疼痛的发生时，小胶质细胞中P2X4受体表达量显著增加，敲除P2X4受体的动物痛敏现象有好转。TN大鼠P2X4受体在三叉神经节、颈部脊髓以及眶下神经的表达都明显高于假手术组，且使用P2X4受体表达抑制剂SSRI(选择性血清素再摄取抑制剂)进行干预，干预组较对照组的疼痛阈值明显升高。以上报道表明P2X4受体可能参与引起了三叉神经痛并且有着关键的作用降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)是一种由降钙素基因表达的生物活性多肽，主要在三叉神经节和背根神经节等部位的神经胞体内合成，以快速轴浆运输形式输送到中枢端和周围感觉神经末梢，广泛分布于脑内及与体表感觉有关的脊髓背角和初级传入纤维，如感觉神经元的胞体和末梢内，参与机体许多功能的调节。CGRP作为一种伤害性刺激的递质，在神经病理性疼痛的研究中引起研究者们的高度重视。有研究发现发现咬合创伤可引起牙髓及牙周组织中的CGRP阳性纤维增多，用三叉神经眶下神经结扎术制备小鼠TN模型，术后发现CGRP和P物质(substanceP，SP)表达逐渐升高，且明显高于对照组。近年，大量研究证实CGRP在TN大鼠的三叉神经元上的表达上调，对三叉神经节神经元和星形胶质细胞的激活具有重要作用，CGRP从三叉神经节神经元释放可以促进三叉神经节神经元CGRP的合成，并刺激星形胶质细胞NO和前炎症细胞因子释放，促进胶质细胞P2X4受体的活化。CGRP选择性拮抗剂和胶质细胞P2X4受体的活化抑制剂或许有可能成为治疗三叉神经痛的有效药物。人类基因组测序完成以来，人类蛋白质编码基因仅占大约1.5％的DNA或大约20,000个基因。在真核生物中，有多达90％的转录，因此产生大量的非编码RNA(ncRNA)。根据转录后产物的长短可将非编码RNA分为短链非编码RNA(≤200bp)和长链非编码RNA(>200bp)。长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)是一类转录后长度大于200核苷酸的功能性非编码RNA分子。它们没有编码蛋白的功能，所以只能以RNA的状态去调控基因的表达。研究显示，lncRNA参与人类多种疾病基因调控。我们实验室利用SOLiDTM全转录分析技术完成SD大鼠多组织转录组高通量测序构建文库，已完成了大鼠多组织的转录组图谱构建；并在神经节中发现了大量与痛觉相关联的非编码转录本，并进行非编码基因的预测发现相应的lncRNA。我们实验室研究发现lncRNAuc.48+(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc？hgsid＝42796671_gIIKDUiyguaFXCbRBiWSM7gFOgqn&c＝chr2&o＝20462844&t＝20463142&g＝ct_Ultra_7128&i＝％28null％29+uc.48)与疼痛密切相关，本发明的内容就是要进行对TN大鼠lncRNAuc.48+小干扰RNA，抑制和下调三叉神经节中的CGRP和P2X4受体的活化，治疗TN。目前尚无lncRNAuc.48+小干扰RNA直接治疗三叉神经痛的报道，本发明涉及可用于防治三叉神经痛的lncRNAuc.48+小干扰RNA在制备治疗三叉神经痛的药物中的应用具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供长非编码核糖核酸uc.48+小干扰RNA治疗三叉神经痛的一个新用途。本发明所述的长非编码核糖核酸uc.48+小干扰RNA在制备用于上述疾病防治的局部或全身用药剂型药物中的应用。lncRNAuc.48+小干扰RNA可减轻三叉神经痛行为反应。lncRNAuc.48+小干扰RNA在治疗三叉神经痛的作用机理为：可能通过抑制和下调三叉神经节中的CGRP和P2X4受体的介导的疼痛信息传递，产生防治疼痛的作用。附图说明图1为各组大鼠机械痛阈值变化的影响图。lncRNAuc.48+小干扰RNA处理对三叉神经痛大鼠的机械痛行为具有抑制作用。实验分组：假手术组(Sham)；三叉神经痛模型组(TN)；三叉神经痛模型+lncRNAuc.48+小干扰RNA组(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神经痛模型+乱码小干扰RNA组(TN+scramblesiRNA)。其中**p<0.01表示和假手术组比较，##p<0.01表示与三叉神经痛模型组比较。图2为各组大鼠三叉神经节中CGRP的real-timePCR检测结果图。lncRNAuc.48+小干扰RNA处理后显著降低三叉神经痛模型组三叉神经节中上调的CGRP水平。实验分组：假手术组(Sham)；三叉神经痛模型组(TN)；三叉神经痛模型+lncRNAuc.48+小干扰RNA组(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神经痛模型+乱码小干扰RNA组(TN+scramblesiRNA)。其中**p<0.01表示和假手术组比较，##p<0.01表示与三叉神经痛模型组比较。图3为各组大鼠三叉神经节中P2X4受体的real-timePCR检测结果图。lncRNAuc.48+小干扰RNA处理后显著降低三叉神经痛模型组三叉神经节中上调的P2X4受体水平。实验分组：假手术组(Sham)；三叉神经痛模型组(TN)；三叉神经痛模型+lncRNAuc.48+小干扰RNA组(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神经痛模型+乱码小干扰RNA组(TN+scramblesiRNA)。其中**p<0.01表示和假手术组比较，##p<0.01表示与三叉神经痛模型组比较。图4为各组大鼠三叉神经节中CGRP的蛋白印迹检测结果图。lncRNAuc.48+小干扰RNA处理后显著降低三叉神经痛模型组三叉神经节中上调的CGRP蛋白水平。实验分组：假手术组(Sham)；三叉神经痛模型组(TN)；三叉神经痛模型+lncRNAuc.48+小干扰RNA组(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神经痛模型+乱码小干扰RNA组(TN+scramblesiRNA)。其中**p<0.01表示和假手术组比较，##p<0.01表示与三叉神经痛模型组比较。图5为各组大鼠三叉神经节中P2X4受体的蛋白印迹检测结果图。lncRNAuc.48+小干扰RNA处理后显著降低三叉神经痛模型组三叉神经节中上调的P2X4受体蛋白水平。实验分组：假手术组(Sham)；三叉神经痛模型组(TN)；三叉神经痛模型+lncRNAuc.48+小干扰RNA组(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神经痛模型+乱码小干扰RNA组(TN+scramblesiRNA)。其中*p<0.05表示和假手术组比较，#p<0.05表示与三叉神经痛模型组比较。具体实施方式下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。实施例1。用本
技术领域：
：公知的方法，制成适用于涉及三叉神经痛疾病治疗的局部或全身注射用lncRNAuc.48+小干扰RNA制剂。为了更好地理解本发明的实质，下面以lncRNAuc.48+小干扰RNA对三叉神经节中CGRP和P2X7受体介导的相关疾病治疗作用研究的实验和结果来证明lncRNAuc.48+小干扰的用途。一、材料和方法。1.1动物和分组。采用雄性成年的SD大鼠进行CCI-ION模型的制备，所有实验大鼠于术前1w进行适应性训练，用细丝刺激大鼠，刺激部位为眶下神经在面部感觉支配区域围绕，鼻区中央的触须部位及周围有毛皮肤。手术当日0d和术后1，3，5d使用电子测痛仪(BME-404NO.E5489)在大鼠刺激部位行机械痛敏阈值测试(测定时间恒定于每天10:00—16:00，室温维持在22℃±0.5℃)。二周后选取机械痛敏阈值明显降低的大鼠进行随机分组，第一组为假手术组(Sham)即切开皮肤暴露眶下神经，不结扎神经，即缝合皮肤；第二组为模型组(TN)，即用两根铬肠线结扎眶下神经；第三组为手术加lncRNAuc.48+siRNA(TN+lncRNAuc.48+siRNA)；第四组为阴性对照组(TN+scramblesiRNA)。采用局部注射，眶下孔注射的方法对TN大鼠注射lncRNAuc.48+siRNA或scramblesiRNA，持续注射5天，并对四组大鼠进行行为学的测量，观察每组大鼠行为学的变化情况。1.2lncRNAuc.48+siRNA设计。设计uc.48+的siRNA序列3条，和一条阴性对照siRNAduplexes。将不同浓度siRNA用EntransterTM-R400转染试剂盒转染到离体培养的DRG神经元细胞，分别在转染后24，48和72h收集细胞，用RT-PCR测定uc.48+基因干扰效果，最终筛选出最佳siRNA序列用于动物实验。实验已确定第2条干扰效果最好。采用EntransterTM-R400转染试剂盒(Engreencompany)将筛选出最佳的siRNA进行动物三叉神经节局部注射。lncRNAuc.48+小干扰序列：5’-GGCACUACUACUUGCAGAATT-3’5’-UUCUGCAAGUAGUAGUGCCTT-3’Stablenegativecontrol序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。1.3主要仪器。电子测痛仪(BME-404NO.E5489)；消毒纱布、手巾、棉签等，碘酒及75％酒精，手术器械包：剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线、有齿镊、神经剥离子等。1.4慢性三叉神经痛模型制作。10％水合氯醛(0.4ml/100g)对大鼠进行腹腔麻醉。麻醉SD大鼠，取俯卧位，固定头部和四肢。备皮、消毒、铺巾，手术显微镜下在眉弓上做一弧形切口，玻璃分针钝性分离，显露出颅骨、额骨和鼻骨，直至暴露眼眶，沿眶上缘将眶内容物用玻璃分针拨开，暴露眶下神经，位于眶底部内侧，仔细分离眶下神经，使游离出1cm长的距离。铬肠线(5-0)结扎眶下神经，至少结扎两次，间隔2mm。压迫的标准：结扎后，神经纤维直径稍稍变细，但不影响其神经电位的传导和血液循环的通畅。常规创口缝合，等动物苏醒后给其正常饮食。1.5三叉神经痛大鼠机械痛敏测定。各组SD大鼠于术前ld和术后1、3、5d行机械痛敏阈值测试(测定时间恒定在每天9:00-15:00，室温维持在23℃±1℃)。机械痛敏阈值用BME-403VonFrey细丝测定，折力分别是：0.13、0.20、0.33、0.60、1.30、3.60、5.00、7.30、9.90、20.1g，先从折力最小的开始，依次往上增加。刺激的范围是：以大鼠鼻区为中心，触须伸展到的区域。测定的方法是：测定前先让大鼠安静30min，然后慢慢地轻轻的靠近大鼠，先刺激它的非手术区，再刺激手术区，对比两边刺激后大鼠的反应，一般一边刺激3次，重复6次，最后取平均值。测定过程中注意动作幅度不要太大，以免惊吓到大鼠，影响到测定结果。刺激大鼠过程中，如果其出现如下反应中的一种或一种以上时，我们则考虑该大鼠为刺激性反应试验阳性。一、快速后退动作。为了防止面部再次被刺激，大鼠会蜷缩着身体往笼壁上靠拢，或者极力的将自己的头面部隐藏在身体下面，以躲避刺激。二、攻击行为。大鼠受到刺激感受到疼痛后也可表现出反攻，抓咬刺激物，反应迅速，动作凶猛。三、不停搔抓术侧面部。常常表现为洗脸的样子，但是是单侧的，手术侧的，至少连续出现3次或3次以上。四、如若刺激强度等于20.1g而大鼠未出现任何一种阳性反应时，该大鼠痛敏阈值定为20.1g。对比各组大鼠术前和术后对不同刺激强度的刺激反应，进行统计分析。1.6RT-PCR。1)总RNA的提取。三叉神经节注射后第5天将大鼠迅速断头，取出三叉神经节(TG)放入用DPPC处理过的PBS中清洗；在分别转移到用DEPC处理过的匀浆器，加入1ML的TRNzol充分研磨；将匀浆样品在室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；美观加入0.2ML氯仿混匀2min，室温放置3min；4℃，12000r/min离心15min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层；RNA主要在水相中，转移水相(约600微升)至另一离心管中；加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置30min；4℃，12000r/min，弃上清，管底可见少许白色沉淀物。每管加75％乙醇(无核酶水配置)1ml，充分洗涤RNA沉淀；4℃，5000r/min离心3min，倒出液体，用枪头小心吸干。室温放置干燥RNA沉淀，约3min即可；不宜过于干燥，会导致RNA的溶解性大大降低；加入30微升无核酶水，充分溶解RNA；取10微升RNA用于鉴定，余下-20℃保存。2)总RNA的鉴定。a)分光光度仪检测：取出2微升RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用紫外分光光度计测量光密度(opticdensity,OD)值；OD260/OD280应该在1.8-2.0之间，表面无蛋白质污染；b)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量：取RNA样品5微升与RNA上样缓冲液1:1混匀后进行1％琼脂糖凝胶电泳，恒压120mV，电泳约15min，紫外灯下可观察到28S，18S，5S三条带。3)RT-PCRa)cDNA合成：建立25微升逆转录反应体系：DEPC4.875μl，5×buffer5μl，Rnasin0.625μl，DNTP1.5μl，OligDT2μl，MMLV1μl，RNA样本10μl，共25μl.b)引物序列如下lncRNAuc.48+(产物长度是193bp)FORWARD5’-GTGGCGTAAGTGAATGTCCT-3’REVERSE5’-GTTGGCAGTTCTGCAAGTAG-3’CGRP(产物长度193bp)FORWARD5’-TCCTGGTTGTCAGCATCTTG-3’REVERSE5’-TCAGCCTCCTGTTCCTCCT-3’P2X4(产物长度124bp)：Forward：5’-ACCAACACCTCTCAGCTTGG-3’Reverse：5’-TGCTCTGTGTCTGGTTCACG-3’(退火温度：55℃)内参照引物β-actin(产物长度是240bp)：Forward：5’-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3’Reverse：5’-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3’(退火温度：55℃)PCR体系：25μL2×EasyTaqPCRSuperMix:12.5μL上游引物:1μl下游引物:1μlcDNA:2μlddH2O:8.5μlPCR扩增程序设置：94℃，1min30s→94℃，30s→58.5℃，30s→72℃，1min×30个循环→72℃，5min→4℃保存。琼脂糖凝胶电泳：制作1.5％的琼脂糖凝胶，冷却至60℃左右加入核酸染料。取10μl进行电泳。电泳30min后用多功能凝胶成像系统曝光。实验结果用Image-ProPlus图像分析系统分析，并Spass19.0进行统计学分析。1.7蛋白印迹(WesternBlot)1)蛋白质的提取：大鼠断头后，迅速取出手术侧TG置于2ml匀浆器内，每个TG加0.3ml去污剂裂解液，冰上充分研磨，尽量碾碎。反复裂解30min后，移至1.5ml离心管中，4℃离心12000rpm10分钟，取上清，各组取2μl含蛋白的上清进行蛋白定量，其余加5×凝胶上样缓冲液，再加10％DTT，混匀后分装，-80℃保存。2)实验步骤：a)测漏：检查玻璃板间的密封性是否良好，如无外漏则把水吸干备用。b)10％分离胶制备(10ml)：双蒸水4ml，30％丙烯酰胺混合液3.3ml1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)2.5ml，10％SDS0.1ml，10％过硫酸胺(AP)0.1ml，TEMED4μl。充分混匀后，灌胶，加入6ml即可，注意不要产生气泡，再加异丙醇压胶。20-30min分离胶凝固后倒出异丙醇，并用滤纸把玻璃板内残留的异丙醇吸干净，否则会出现断胶的现象。c)5％压缩胶制备(5ml)：双蒸水3.4ml，30％丙烯酰胺混合液0.83ml，1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)0.63ml，10％SDS0.05ml，10％过硫酸胺(AP)0.05ml，TEMED5μl。混匀后迅速灌胶，约4ml，迅速插入梳子，待20-30min胶完全凝固后使用。d)上样：将提取好的蛋白放入沸水中煮5min，使其变性，各孔上样量根据各组蛋白定量结果进行计算，浓度不同上样量也不同，一般不超过30μl。e)电泳：压缩胶为90V，50min。分离胶为120V，约40min。f)转膜：切胶，去除非目的蛋白所在部分，保留含有目的蛋白的分离胶，用事前准备好的相同大小的滤纸和膜贴于其上，摆放顺序是黑板-垫子-4层滤纸-胶-PVDF膜-4层滤纸-白板。4℃，恒流300mA，1.5小时。g)封闭：将膜放在TBST中洗涤10min后，放入TBST配制的5％脱脂奶粉中封闭，室温下平摇1-3小时，如果背景高可考虑封闭过夜或更长时间。封闭时注意正面朝下。h)一抗孵育：将膜在滤纸上稍吸干后，不洗，直接放入脱脂奶粉配制的一抗中，4℃过夜，或室温下孵育2-4小时。i)加二抗：TBST洗10分钟×3遍后放入脱脂奶粉配制的二抗中，室温下平摇。1小时后用TBST洗10分钟×4遍。j)免疫复合物检测：显色，曝光，显影，定影。3)光密度分析：应用Image-ProPlus图像分析系统分析，并比较各组三叉神经节中CGRP和P2X4蛋白表达的变化。1.8实验数据的统计处理。各组数据以均数±标准误表示。多组间比较用单因素方差分析，继以最小显著差法(LSD)行两两比较。用SPSS19.0软件包进行数据处理。P<0.05为差异有显著性。二、结果。(一)行为学结果。各组大鼠造模中均未见肢体运动障碍和自残现象。造模前测定各组间机械缩足反射阈值的基础值差异无显著性(p>0.05)。机械痛敏(MWT)测定结果。术前Sham组、TN组、TN+uc.48+siRNA组、TN+scramblesiRNA组之间相比，大鼠术侧眶下神经面部感觉区域内的机械痛阈值没有显著性差异(p>0.05)。术后1天开始，TN组的机械痛反射阈值在双侧都有所下降，但以手术侧下降更为明显。二周后选取机械痛敏阈值明显降低的TN大鼠进行随机分组：模型组(TN)；模型加lncRNAuc.48+siRNA组(TN+lncRNAuc.48+siRNA)；模型加阴性对照干扰组(TN+scramblesiRNA)。采用假手术组(Sham)作为正常对照组，即切开皮肤暴露眶下神经，不结扎神经，缝合皮肤。采用局部注射，眶下孔三叉神经节注射的方法对TN大鼠注射lncRNAuc.48+siRNA或scramblesiRNA，持续注射5天，对四组大鼠进行行为学的测量，观察每组大鼠行为学的变化情况。lncRNAuc.48+siRNA3d开始，TN+lncRNAuc.48+siRNA组的术侧机械痛反射阈值和TN组相比有所升高(p<0.01)，但TN+scramblesiRNA组和TN组相比无显著性差异。(见Fig.1)。(见图1)。(二)实时定量-聚合酶链式反应(Real-timePCR)。持续注射5天，取对四组大鼠TG进行CGRP和P2X4受体mRNA的测定。结果表明TN大鼠的CGRP和P2X4受体mRNA和Sham组相比显著升高，lncRNAuc.48+小干扰RNA处理后TG的CGRP和P2X4受体mRNA表达受到抑制，显著降低(p<0.01)，但TN+scramblesiRNA组和TN组相比无显著性差异。(见图2，3)。(三)蛋白印迹。持续注射5天，取对四组大鼠TG进行CGRP和P2X4受体蛋白的测定。结果表明TN大鼠的CGRP和P2X4受体蛋白和Sham组相比显著升高，lncRNAuc.48+小干扰RNA处理后TG的CGRP和P2X4受体蛋白表达受到抑制，显著降低(p<0.05)，但TN+scramblesiRNA组和TN组相比无显著性差异。(见图4,5)。发明人研究发现注射lncRNAuc.48+小干扰RNA后，可减轻三叉神经痛大鼠的痛行为反应。根据lncRNAuc.48+小干扰RNA可以减少三叉神经痛大鼠三叉神经节CGRP和P2X4受体的表达的研究结果，表明：lncRNAuc.48+小干扰RNA减轻三叉神经痛的作用机理是阻断三叉神经节CGRP和P2X4受体介导的疼痛信息传递，具有防治疼痛的作用。当前第1页1 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