本发明涉及一种生物医用材料技术领域的方法，具体是一种水溶性单壁碳纳米管（SWNTs）改性的可注射性磷酸钙骨水泥及制备和应用。
背景技术：
磷酸钙类骨水泥由于其具备良好的生物相容性以及骨诱导性，在骨损伤修复方面具有广阔的应用前景。磷酸钙类骨水泥通常由两种或以上磷酸钙盐的粉末混合后与固化液在一定的固液比例下调匀，发生水化反应，能在室温或人体环境中自固化，具有自由塑形、固化温和的特点。通过添加适合的改性剂改善骨水泥调和浆的流动性和可注射性，磷酸钙骨水泥可以应用于微创介入治疗。
研究表明，碳纳米管能在近红外区域将光能转化为热能，在肿瘤热疗方面展露出广阔的应用前景[Emerich D.E, Biomol Eng, 2006]。其中，SWNTs具有良好的光热效应，经过化学改性后可具备良好的水溶性，一方面可以有助于从载体材料中释放，并增加被代谢的可能性，另一方面水溶性较好的短的碳纳米管被证明没有细胞毒性[Kam H，J Am Chem Soc，2005]，更加安全可靠。
在临床应用中，载药的骨水泥在治疗由癌症引起的骨缺损有良好表现，通常将包载抗癌药物的骨水泥植入骨缺损部位，进行癌症的化学治疗。本发明针对以上背景，利用可注射性骨水泥的负载能力和SWNTs良好的光热效应，提出一种水溶性SWNTs改性的磷酸钙骨水泥的制备方法，使其同时具备良好的可注射性和显著的光热效应，为临床治疗骨科癌症提出一种新的途径。
技术实现要素：
为克服现有技术的不足，本发明提供一种水溶性单壁碳纳米管（SWNTs）改性的可注射性磷酸钙骨水泥及制备和应用，开发出一种满足临床需求的新型热疗材料。
一种水溶性单壁碳纳米管改性的磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）采用固相反应法将原料磷酸氢钙与碳酸钙按摩尔比2:1充分混合后，在1250-1400℃煅烧2-4h并急速冷却至室温，制备α-TCP粉末；
（2）以上述α-TCP粉末为主体，加入质量分数0.5-1%的透明质酸钠改善调和浆的可注射性，将自制的SWNT-PEI按质量比1-5%混合于骨水泥粉末中，制备得到负载SWNT-PEI的磷酸钙骨水泥粉末；
（3）将上述骨水泥粉末与固化液Na2HPO4溶液按固液比2g/mL混合后，制备得到注射性良好的水溶性SWNTs改性的磷酸钙骨水泥。
步骤（1）所述的固相反应法的原料混合方式为使用无水乙醇为介质的湿法球磨，转速为400rpm，球磨时间为1-4h，球料比为质量比3:1；产物球磨方式为使用无水乙醇为介质的湿法球磨，转速为400rpm，球磨时间为6h，球料比为质量比4:1。
步骤（2）所述的透明质酸钠分子量为100，000以上；SWNT-PEI制备使用的原料SWNTs长度为1-30μm；所述粉末的混合方式为干法球磨，转速为200rpm，球磨时间2h，球料比为质量比4:1。
步骤（3）所述的固化液为质量分数2.5%的Na2HPO4溶液，配制方式为常温下磁力搅拌溶解。
一种水溶性单壁碳纳米管改性的磷酸钙骨水泥，其特征在于，根据上述任一所述方法制备得到。
一种水溶性单壁碳纳米管改性的磷酸钙骨水泥的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：将摩尔比为2:1的磷酸氢钙与碳酸钙粉末充分混合；采用固相反应法，通过控制反应条件，制备得到作为骨水泥粉末主体的α-TCP粉末；将纯化过的SWNTs与稀硝酸混合，加热回流后提纯，得到羧基化的SWNTs；将羧基化的SWNTs与亚硫酰氯（SOCl2）和富马酸二甲脂（DMF）混合后加热回流，提纯后得到氨基化的SWNTs；将氨基化的SWNTs进行PEI聚合化，得到水溶性良好的SWNT-PEI；在上述α-TCP粉末中加入质量分数0.5-1%的透明质酸钠作为改性剂，SWNT-PEI按质量比1-5%混合于骨水泥粉末中，与Na2HPO4溶液混合后，制备得到注射性良好的水溶性SWNTs改性的磷酸钙骨水泥。
本发明包括以下步骤：
1、将磷酸氢钙与碳酸钙混合均匀，其为摩尔比2:1。所述混合方式为使用无水乙醇为混合介质的球磨混合，转速400rpm，球磨时间为1-4h，混合后的悬浊液通过旋转蒸发除去乙醇后放入60℃烘箱中干燥。
2、将干燥后的磷酸氢钙与碳酸钙混合物在1250-1400℃炉中锻烧2-4h后取出，在鼓风环境下急速冷却，得到α-TCP粉末，之后采用湿法球磨的方式得到粒径均一的α-TCP粉末，其粒径范围在2-4μm。干燥后备用。
3、将纯化过的SWNTs与4mol/L稀硝酸混合，于110℃加热回流2h，室温冷却，超纯水稀释后用0.1μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，水洗至pH为中性；然后取下滤饼上的黑色固体，分散于1mol/L的盐酸中，超声振荡30min，纯水稀释后用0.1μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤并水洗至pH为中性，放入60℃真空烘箱中干燥，得到羧基化SWNTs。
4、将羧基化SWNTs加入SOCl2和DMF混合液，油浴70℃回流24h。反应结束后，高速离心除去上清液，用无水四氢呋喃（THF）洗涤多次，0.1μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，加入乙二胺搅拌5天后，抽滤溶液，用乙醇充分洗涤，放入真空烘箱中干燥，得到氨基化SWNTs。
5、将氨基化SWNTs分散于二氯甲烷中，超声30min，然后加入氮丙啶，并加入盐酸作为催化剂，40℃加热回流24h。用0.1μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，产物用大量二氯甲烷洗涤，然后在甲醇中超声3次。室温真空干燥，得到聚合化的SWNT-PEI。
6、在α-TCP粉末中加入质量分数0.5-1%的透明质酸钠作为改性剂，将SWNT-PEI按质量比1-5%混合于骨水泥粉末中，与固化液Na2HPO4溶液按固液比2g/mL混合后，制备得到注射性良好的水溶性SWNTs改性的磷酸钙骨水泥。
本发明的优点在于：
1、使用透明质酸钠改性的可注射性磷酸钙骨水泥作为载体材料，将水溶性改性后的SWNT-PEI负载于骨水泥中，可通过微创介入手术直接植入骨缺损部位，在980nm近红外光的激发下，进行肿瘤的热疗。
2、单壁碳纳米管进行水溶性改性后，其细胞毒性降低，同时磷酸钙骨水泥具有良好的骨诱导性，可以促进术后骨缺损部位的愈合。
以自制的α-TCP为粉末主体，使用透明质酸钠作为改性剂改善其可注射性，将水溶性SWNTs负载于骨水泥粉末中，与固化液混合后，制备得到水溶性SWNTs改性的可注射性磷酸钙骨水泥。
附图说明
图1是本技术所制备的载药骨水泥在体外的光热升温曲线，体系在980nm光照下300s内可升温至70℃，对局部肿瘤细胞有良好的杀伤效果。
具体实施方式
以下实施例以发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。
实施例1
（1）α-TCP粉末制备：
按摩尔比2:1称量磷酸氢钙粉末和碳酸钙粉末，使用适量无水乙醇为介质湿法球磨，转速400rpm，球磨时间4h，球磨珠与粉末质量比为3:1。原料混合液通过旋转蒸发除去乙醇，置于60℃烘箱中干燥24h。将干燥后的粉末置于马弗炉中，1400℃煅烧2h后取出，在鼓风环境下急速冷却。将冷却后的粉末以无水乙醇为介质湿法球磨，转速400rpm，球磨时间为6h，球磨珠与粉末质量比为4:1。粉末悬浊液置于80℃烘箱中充分干燥，制备得到α-TCP粉末。
（2）SWNT-PEI的制备：
将纯化过的SWNTs与4mol/L稀硝酸混合，于110℃加热回流2h，室温冷却，超纯水稀释后用0.1μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，水洗至pH为中性；然后取下滤饼上的黑色固体，分散于1mol/L的盐酸中，超声振荡30min，纯水稀释后用0.1μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤并水洗至pH为中性，放入60℃真空烘箱中干燥，得到羧基化SWNTs。
将羧基化SWNTs加入20mL SOCl2和DMF混合液，油浴70℃回流24h。反应结束后，8000rpm离心除去上清液，用无水四氢呋喃（THF）洗涤多次，0.1μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，加入乙二胺搅拌5天后，抽滤溶液，用乙醇充分洗涤，放入真空烘箱中干燥，得到氨基化SWNTs。
将40mg氨基化SWNTs分散于20mL二氯甲烷中，超声30min，然后加入0.5mL的氮丙啶，并加入10M盐酸10μL作为催化剂，40℃加热回流24h。用0.1μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，产物用大量二氯甲烷洗涤，然后在甲醇中超声3次。室温真空干燥，得到聚合化的SWNT-PEI。
（3）光热曲线测试：
将所制备的骨水泥调和浆0.1mL注射至96孔板中，加入100μLPBS缓冲液，用980nm红外灯照射一段时间后记录溶液温度，绘制时间-温度曲线。
实施例2
将实施例1制备的α-TCP与质量分数0.5%透明质酸钠混合，同时加入质量分数5%的SWNT-PEI，得到骨水泥粉末，将其与质量分数2.5%的Na2HPO4溶液按2g/mL的固液比进行调和，调和浆移入注射器中，可注射性为95%以上；将调和浆置于100%湿度环境中固化，参照标准ASTM C191测定其初凝时间为8min。按实施例1（3）所述方法测试光热曲线，得到结果如图1所示。
实施例3
将实施例1制备的α-TCP与质量分数0.1%透明质酸钠混合，同时加入质量分数5%的SWNT-PEI，得到骨水泥粉末，将其与质量分数2.5%的Na2HPO4溶液按2g/mL的固液比进行调和，调和浆移入注射器中，可注射性为80%以上；将调和浆置于100%湿度环境中固化，参照标准ASTM C191测定其初凝时间为6min。