包含EV71VP1蛋白的纳米颗粒及其制备方法与流程

本发明属于医药
技术领域：
，涉及一种纳米颗粒，其包含EV71病毒的VP1蛋白、免疫佐剂、阳离子聚合物和阴离子聚合物，所述免疫佐剂选自TNF-α、CpG、卡介苗和鞭毛蛋白中的一种或多种。本发明还涉及制备所述纳米颗粒的方法，包含所述纳米颗粒的免疫原性组合物(例如疫苗)，所述纳米颗粒用于制备免疫原性组合物(例如疫苗)的用途，以及所述纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)用于引发或增强受试者对EV71的免疫应答的用途。
背景技术：
：手足口病是由多种肠道病毒引起的全球性传染病，其主要病原体为小RNA病毒科肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)、埃可病毒(ECHOvirus，EO)和肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)。其中以CV16和EV71型感染最为常见。手足口病主要侵袭婴幼儿，临床表现以发热和手、足、口等部位的皮疹或疱疹为主要特征，多数患者症状轻微。但与其他肠道病毒相比，EV71感染性强、致病率高，感染引起重症病例的比例偏高、患儿可出现中枢神经和呼吸系统的损害，引发脑炎、急性弛缓性麻痹、肺水肿和心肌炎等并发症。目前，我国生物制品公司生产的EV71疫苗是灭活疫苗，灭活疫苗存在：抗原分子容易发生变性，抗原表位的空间构象容易遭到破坏，从而导致免疫原性较差，对机体的刺激较弱等缺点。需多次重复免疫，而且免疫反应持续的时间也较短，对于免疫力低下或缺陷的个体，可能存在潜在的安全性风险。为增强灭活疫苗的免疫效果，往往需要添加佐剂。铝佐剂是唯一被批准用于人的佐剂，但很多研究表明，铝佐剂只能激活体液免疫而不能激活细胞免疫。另有研究报道，铝佐剂会引起无菌性脓肿、嗜酸性粒细胞增多、筋膜炎等副作用。针对以上问题，本研究以合成多肽和重组蛋白抗原为基础，制备了一种新型纳米颗粒性佐剂疫苗，与病原微生物的大小相似，因而更容易被抗原呈递细胞(APC)捕获并向T细胞呈递抗原，促使T细胞和B细胞成熟活化，增强免疫效果。技术实现要素：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中使用的，术语“纳米颗粒”是指尺寸(即颗粒的最长维度中的直径)在纳米级的颗粒，例如尺寸不大于1,000nm、不大于500nm、不大于200nm或不大于100nm的颗粒。如本文中使用的，术语“颗粒”是指以离散颗粒、丸粒、珠粒或团粒存在为特征的物质状态，而不管其大小、形状或形态如何。如本文中使用的，术语“粒径”即“等效粒径”，是指当被测颗粒的某种物理特性或物理行为与某一直径的同质球体(或组合)最相近时，就把该球体的直径(或组合)作为被测颗粒的等效粒径(或粒度分布)。如本文中使用的，术语“平均粒径”是指对于一个由大小和形状不相同的粒子组成的实际粒子群，与一个由均一的球形粒子组成的假想粒子群相比，如果两者的粒径全长相同，则称此球形粒子的直径为实际粒子群的平均粒径。平均粒径的测量方法是本领域技术人员已知的，例如光散射法；平均粒径的测量仪器包括但不限于马尔文粒径仪。如本文中使用的，术语“室温”是指25±5℃。如本文中使用的，术语“约”应该被本领域技术人员理解，并将随其所用之处的上下文而有一定程度的变化。如果根据术语应用的上下文，对于本领域技术人员而言，其使用不是清楚的，那么“约”的意思是不超过所述特定数值或范围的正负10％。如本文中使用的，术语“EV71VP1蛋白”与“EV71的VP1蛋白”具有同样的含义，均是指肠道病毒71型(EV71)的外壳蛋白VP1。EV71分为A、B、C三个基因型，B型又可进一步分为B1、B2、B3、B4四个亚型，C型又可进一步分为C1、C2、C3、C4四个亚型。优选地，本发明的EV71属于A型别。然而，由于不同型别的EV71的VP1蛋白具有较高的同源性，本领域技术人员理解，术语“EV71VP1蛋白”包括所有型别的EV71的VP1蛋白。EV71的外壳蛋白的氨基酸序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号ACN59569提供了EV71上海毒株(036-2009)的氨基酸序列，其中566-832位为VP1蛋白的氨基酸序列)。在本发明中，当提及EV71VP1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQIDNO:1所示的序列来进行描述。如本文中使用的，术语“免疫佐剂”是指同抗原一起或预先施用于机体内，能增强免疫原性或改变免疫反应类型的物质。免疫佐剂本身可以具有免疫原性(例如卡介苗)，或不具有免疫原性(例如氢氧化铝佐剂)。如本文中使用的，术语“TNF-α”是指肿瘤坏死因子-α。如本文中使用的，术语“CpG”是指具有免疫激活功能的、含有CpG基序的DNA片段，术语“CpG基序”是指以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤为基元构成的特定核苷酸序列。CpG包括人工合成的含有CpG基序的寡聚脱氧核糖核苷酸(即，CpGODN)，以及天然存在的(例如来源于细菌、病毒或无脊椎动物的)含有CpG基序的DNA片段。如本文中使用的，术语“阳离子聚合物”是指在溶剂(例如水)中可以发生电离，使聚合物链带正电荷的聚合物，例如壳聚糖、聚醚酰亚胺(PEI)和聚赖氨酸。如本文中使用的，术语“阴离子聚合物”是指在溶剂(例如水)中可以发生电离，使聚合物链带负电荷的聚合物，例如肝素、三聚磷酸钠(TPP)和透明质酸。如本文中使用的，术语“免疫原性组合物”是指能够在宿主体内生成抗免疫原的免疫应答的组合物。如本文中使用的，术语“抗原”或“免疫原”是指能够诱导宿主体内的特异性免疫应答的物质。抗原可以包括整个生物体(例如灭活的、减毒的或活的生物体)；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性的插入物的重组载体；在呈递给宿主后能够诱导免疫应答的DNA部分或片段；蛋白、糖蛋白、脂蛋白、多肽、肽、抗原表位、半抗原、毒素、抗毒素或其任何组合。本发明人通过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种包含EV71VP1蛋白、免疫佐剂、阳离子聚合物和阴离子聚合物的纳米颗粒，其中，所述免疫佐剂选自TNF-α、CpG、卡介苗和鞭毛蛋白中的一种或多种。本发明的纳米颗粒能够在动物体内产生较强的体液免疫，使细胞免疫明显增强，并能引起一定的局部粘膜免疫，免疫效果优于常规的含铝佐剂的疫苗，由此提供了下述发明：在一个方面，本申请提供了一种纳米颗粒，其包含EV71的VP1蛋白、免疫佐剂、阳离子聚合物和阴离子聚合物，所述免疫佐剂选自TNF-α、CpG、卡介苗和鞭毛蛋白中的一种或多种。EV71病毒中，VP1蛋白是主要的表达抗原，但是，其免疫原性较弱，单独使用往往不能引起有效的免疫效果。本发明通过阳离子聚合物和阴离子聚合物之间的静电作用，对EV71VP1蛋白和特定的免疫佐剂进行包裹，形成含有EV71VP1蛋白和特定免疫佐剂的纳米颗粒。相比于单独的EV71VP1蛋白，本发明的纳米颗粒能够产生更优的免疫效果。术语“包裹”并不限于将EV71VP1蛋白和免疫佐剂完全置于纳米颗粒的内部。本发明的纳米颗粒中，EV71VP1蛋白和免疫佐剂可以位于纳米颗粒内部，也可以位于纳米颗粒表面。在一个优选的实施方案中，所述EV71是A型。在一个优选的实施方案中，所述EV71的VP1蛋白具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述EV71的VP1蛋白是通过基因工程的方法，由大肠杆菌表达系统表达产生，再经过溶解和复性而获得的。在一个优选的实施方案中，所述免疫佐剂为TNF-α或CpG。在一个优选的实施方案中，所述CpG为CpGODN。在一个优选的实施方案中，所述CpGODN具有如SEQIDNO:2所示的核酸序列。在一个优选的实施方案中，所述阳离子聚合物选自壳聚糖、聚醚酰亚胺(PEI)和聚赖氨酸中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述阳离子聚合物为壳聚糖。在一个优选的实施方案中，所述阴离子聚合物选自肝素、三聚磷酸钠(TPP)和透明质酸中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述阴离子聚合物为肝素。在一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒为近似球形。在一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的粒径为100-150nm，例如100-105nm、105-120nm、120-135nm或135-150nm。在一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的Zeta电位为+10至+20mV，例如+10至+12mV、+12至+14mV、+14至+16mV、+16至+18mV或+18至+20mV。在一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒中，EV71VP1蛋白的包封率为80％-90％，例如80％-85％或85％-90％。在一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒中，免疫佐剂的包封率为85％-95％，例如85％-90％或90％-95％。在一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒中，EV71VP1蛋白：免疫佐剂：阳离子聚合物：阴离子聚合物的质量比为1-5:0.01-5:10-50:10-50，例如1-3:0.02-4.5:30-45:30-45、1-2:0.1-2:10-30:30-50、1-3:0.01-5:40-45:30-45、2-3:0.02-4:30-45:40-45、3:0.02-4:45:30-45或3:0.02-4.5:45:30，例如3:0.02:45:30、5:0.1:45:45、1:4:45:30或3:4.5:45:30。在一个方面，本申请提供了制备本发明的纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：提供包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含EV71VP1蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液；步骤2：使包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含EV71VP1蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液分别通过第一通道、第二通道、第三通道和第四通道到达混合区域中，进行混合。在一个优选的实施方案中，所述方法在包含第一通道、第二通道、第三通道、第四通和混合区域的装置中进行。在一个优选的实施方案中，所述装置为多入口涡流混合器，例如四入口涡流混合器。在一个优选的实施方案中，包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含EV71VP1蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液在通道中都以匀速流动。在一个优选的实施方案中，包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含EV71VP1蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液在通道中的流速相同。在一个优选的实施方案中，包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含EV71VP1蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液在通道中的流速均为1-20mL/min，例如1-5mL/min、5-10mL/min、10-15mL/min或15-20mL/min，例如1mL/min、5mL/min、10mL/min、15mL/min或20mL/min。在一个优选的实施方案中，包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含EV71VP1蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液在混合区域中产生涡流。图1示例性地描述了本发明方法中的步骤2，实线箭头表示液体流动的方向。如图所示，使包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含EV71VP1蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液分别通过通道1、通道2、通道3和通道4到达混合区域中进行混合，得到纳米颗粒。在一个优选的实施方案中，步骤2得到包含纳米颗粒的溶液。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括步骤3：对包含纳米颗粒的溶液进行浓缩，例如通过超滤进行浓缩。在一个优选的实施方案中，所述步骤1中，包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含EV71VP1蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液的浓度比为0.1-0.5mg/mL:0.1-0.5mg/mL:10-50μg/mL:0.1-50μg/mL，例如0.1-0.45mg/mL：0.1-0.3mg/mL:10-30μg/mL:0.1-1μg/mL、0.1-0.45mg/mL：0.1-0.3mg/mL:10-30μg/mL:1-30μg/mL、0.4-0.5mg/mL：0.1-0.3mg/mL:10-20μg/mL:1-10μg/mL或0.3-0.5mg/mL：0.25-0.5mg/mL:10-50μg/mL:10-50μg/mL，例如0.45mg/mL:0.3mg/mL:30μg/mL:0.2-45μg/mL。在一个优选的实施方案中，所述步骤1中，包含阳离子聚合物的溶液为水溶液。在一个优选的实施方案中，所述步骤1中，包含阴离子聚合物的溶液为水溶液。在一个优选的实施方案中，所述步骤1中，包含EV71VP1蛋白的溶液为水溶液。在一个优选的实施方案中，所述步骤1中，包含EV71VP1蛋白的溶液还包含乙酸。在一个优选的实施方案中，所述步骤1中，包含免疫佐剂的溶液为水溶液。在一个优选的实施方案中，所述步骤2在多入口涡流混合器中进行。在一个优选的实施方案中，本发明中的多入口涡流混合器，包括位于上部的第一部件、位于中部的第二部件和位于下部的第三部件，所述第一部件、第二部件和第三部件为具有相同直径的圆柱体。第一部件设置有多个通道，第二部件设置涡流混合区域和多个导流区域，第三部件设置通道。第一部件的通道与第二部件的导流区域流体连通。第二部件的导流区域均与涡流混合区域流体连通。第二部件的涡流混合区域与第三部件的通道流体连通。可使用螺纹连接装置将第一部件、第二部件和第三部件密封连接。在某些实施方案中，第一部件设置有多个通道，通道的上下两端分别位于第一部件的上表面和下表面。在某些实施方案中，所述多个通道的横截面为圆形。在某些实施方案中，所述多个通道分别通过连接部件与外部管道连接。在某些实施方案中，第二部件的上表面凹陷设置有多个导流区域和一个涡流混合区域。在某些实施方案中，多个导流区域通过在第二部件的上表面设置的槽与涡流混合区域流体连通。在某些实施方案中，第二部件的涡流混合区域通过平行于第二部件轴向的通道与第三部件的通道流体连通。在某些实施方案中，涡流混合区域的横截面为圆形，并与第二部件的横截面具有共同的圆心。在某些实施方案中，多个导流区域的横截面为圆形。在某些实施方案中，第二部件的导流区域的数量与第一部件的通道数量相同。在某些实施方案中，第二部件的多个导流区域各自位于第一部件的多个通道的正下方。在某些实施方案中，第三部件的通道的上下两端分别位于第三部件的上表面和下表面。在某些实施方案中，第三部件的通道的横截面为圆形。在某些实施方案中，第三部件的通道通过连接部件与外部管道连接。在某些实施方案中，所述多入口涡流混合器由刚性材料(例如不锈钢)制成。示例性的多入口涡流混合器参见图2。图2A为第一部件、第二部件和第三部件组装后并连接了外部管道的状态，其中，第一部件位于多入口涡流混合器的上部，第二部件位于多入口涡流混合器的中部，第三部件位于多入口涡流混合器的下部。第一部件、第二部件和第三部件通过螺栓密封连接。第一部件的四个通道分别通过连接部件与外部管道连接。第三部件的通道也通过连接部件与外部管道连接。图2B-1为第一部件的仰视图。如图所示，第一部件上设置有螺孔和通道；通道的上下两端分别位于第一部件的上表面和下表面。图2B-2为第二部件的俯视图。如图所示，第二部件上设置有螺孔；在第二部件的上表面凹陷设置有横截面为圆形的导流区域和涡流混合区域；导流区域通过在第二部件的上表面设置的槽与涡流混合区域流体连通；涡流混合区域的中心有平行于第二部件轴向的通道。图2B-3为第三部件的俯视图。如图所示，第三部件设置有通道和螺孔；通道的上下两端分别位于第三部件的上表面和下表面。图2B-4为导流区域和涡流混合区域的放大图。图中，虚线圆形标出的部分为涡流混合区域，以及连接导流区域与涡流混合区域的槽。图2B-5为涡流混合区域的结构示意图，实线箭头表示液体流动的方向。图2所示的多入口涡流混合器中，第二部件的四个导流区域各自位于第一部件的四个通道的正下方。液体经第一部件的通道流入第二部件的导流区域，之后进入涡流混合区域，再经位于涡流混合区域中心的通道流入第三部件的通道。本发明的纳米颗粒能够引起免疫应答，因此，在一个方面，本申请还提供了一种免疫原性组合物，其包含本发明的纳米颗粒。在一个优选的实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的辅料，例如赋形剂、防腐剂、抗菌剂和/或额外的免疫佐剂。在一个优选的实施方案中，所述免疫原性组合物为疫苗。在一个优选的实施方案中，所述免疫原性组合物用于预防和/或治疗受试者中与EV71感染相关的疾病，例如手足口病。优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。在一个优选的实施方案中，所述免疫原性组合物还包含第二免疫原性物质。例如，所述免疫原性组合物还包含除EV71VP1蛋白以外的EV71的其他结构蛋白。例如，所述免疫原性组合物还包含灭活或减活的EV71。例如，所述免疫原性组合物还包含EV71以外的其他致病微生物(包括活的、灭活的或减毒的)。例如，所述免疫原性组合物还包含EV71以外的其他致病微生物的部分。在一个方面，本申请提供了本发明的纳米颗粒用于制备免疫原性组合物(例如疫苗)的用途，所述免疫原性组合物(例如疫苗)用于预防和/或治疗受试者中与EV71感染相关的疾病，例如手足口病。在一个优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。在一个方面，本申请提供了制备本发明的免疫原性组合物的方法，包括使用本发明的纳米颗粒。在一个优选的实施方案中，所述方法包括：将本发明的纳米颗粒与药学上可接受的辅料(例如赋形剂、防腐剂、抗菌剂和/或额外的免疫佐剂)进行混合。在一个方面，本申请提供了一种预防和/或治疗受试者中与EV71感染相关的疾病的方法，包括给受试者施用本发明的纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)。在一个优选的实施方案中，所述与EV71感染相关的疾病为手足口病。在一个优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。在一个方面，本申请提供了一种引发或增强受试者对EV71的免疫应答的方法，包括给受试者施用本发明的纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)。在一个优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。在一个方面，本申请提供了本发明的纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)用于引发或增强受试者对EV71的免疫应答的用途。在一个优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。发明的有益效果本发明的纳米颗粒具有以下有益效果中的一个或多个：(1)本发明的纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象；(2)本发明的纳米颗粒中，EV71VP1蛋白和免疫佐剂具有较高的包封率；(3)本发明的纳米颗粒施用于动物后，能产生较强的体液免疫，使细胞免疫明显增强，并能引起一定的局部粘膜免疫，免疫效果优于现有的含铝佐剂的疫苗；(4)本发明的纳米颗粒能够通过简单的方法连续制备，品质稳定，易于产业化生产。下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是，本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明图1示例性地描述了本发明的制备纳米颗粒的方法中的步骤2，实线箭头表示液体流动的方向。如图所示，步骤2包括使包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含EV71VP1蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液分别通过通道1、通道2、通道3和通道4到达混合区域中进行混合，得到纳米颗粒。图2示例性地描述了用于制备本发明的纳米颗粒的多入口涡流混合器。图2A为第一部件、第二部件和第三部件组装后并连接了外部管道的状态；图2B-1为第一部件的仰视图；图2B-2为第二部件的俯视图；图2B-3为第三部件的俯视图。图2B-4为导流区域和涡流混合区域的放大图。图中，虚线圆形标出的部分为涡流混合区域，以及连接导流区域与涡流混合区域的槽。图2B-5为涡流混合区域的结构示意图，实线箭头表示液体流动的方向。图3显示了实施例1制得的纳米颗粒的形态。图3A显示了包裹EV71VP1蛋白和CpG的壳聚糖-肝素纳米颗粒在透射电镜下的形态；图3B显示了包裹EV71VP1蛋白和TNF-α的壳聚糖-肝素纳米颗粒在透射电镜下的形态。如图所示，两种纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象。图4为实施例2的粒径测试结果。图4A为包裹EV71VP1蛋白和CpG的壳聚糖-肝素纳米颗粒的粒径分布图；图4B为包裹EV71VP1蛋白和TNF-α的壳聚糖-肝素纳米颗粒的粒径分布图。如图所示，两种纳米颗粒均具有较窄的粒径分布，粒径分布对称。图5显示了实施例4中，对小鼠进行第一次免疫后的第14天(图5A)、第二次免疫后的第14天(图5B)、第三次免疫后的第14天(图5C)和第28天(图5D)，各组小鼠血清中IgG的滴度。实验结果表明，本发明的包含EV71VP1蛋白和特定免疫佐剂(例如CpG或TNF-α)的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，能够增强体液免疫，提高抗体的滴度。本发明的纳米颗粒的免疫效果明显优于铝佐剂与EV71VP1的混合物，与市售EV71疫苗(含铝佐剂和灭活EV71病毒)的免疫效果相当，甚至优于市售EV71疫苗。图6显示了实施例4中，第三次免疫后的第28天，小鼠血清中IgG2a/IgG1的比值。如图所示，E组(施予CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒)和F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)小鼠血清中IgG2a/IgG1均高于C组(施予铝佐剂和EV71VP1的混合物)，并具有显著性差异(P<0.05)。E组和F组小鼠血清中IgG2a/IgG1均高于G组(施予市售含铝佐剂和灭活EV71病毒的疫苗)。实验结果表明，使用本发明的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，能够促进T细胞的极化，增强细胞免疫的效果。图7显示了实施例4中，第三次免疫后的第28天，小鼠的小肠灌洗液中IgA滴度。如图所示，E组(施予CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒)和F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)小鼠血清中IgA的滴度均高于C组(施予铝佐剂和EV71VP1的混合物)，并具有显著性差异(P<0.05)。E组和F组小鼠血清中IgG2a/IgG1均高于G组(施予市售含铝佐剂和灭活EV71病毒的疫苗)。同时，E组和F组小鼠血清中IgA滴度均高于G组(施予市售含铝佐剂和灭活EV71病毒的疫苗)。实验结果表明，使用本发明的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，在肠道能引起一定的粘膜免疫。图8显示了用抗原刺激各组小鼠免疫后的淋巴细胞后，淋巴细胞的增值指数。结果显示，E组(施予CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒)的淋巴细胞增殖指数与C组(施予铝佐剂和EV71VP1的混合物)相比有显著差异；而F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)的淋巴细胞增殖指数与C组相比，有极显著差异(P<0.001)。实验结果表明，本发明的纳米颗粒对小鼠免疫后，淋巴细胞再次遇到抗原，能够增殖分化，从而增强免疫效果。本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中表1序列号(SEQIDNO:)描述1EV71VP1蛋白的氨基酸序列2CpGODN的核苷酸序列序列信息序列1(SEQIDNO:1):267aaGDRVADVIESSIGDSVSRALTHALPAPTGQNTQVSSHRLDTGKVPALQAAEIGASSNASDESMIETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLEGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMRFDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPDSRESLAWQTATNPSVFVKLSDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGTSKSKYPLVVRIYMRMKHVRAWIPRPMR序列2(SEQIDNO:2):20bpTCCATGACGTTCCTGACGTT具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1纳米颗粒的制备1.试剂：EV71VP1蛋白为商购(由大肠杆菌表达系统产生，再经过溶解和复性获得)，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。CpGODN1826为商购，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。其他试剂均为商购。2.制备过程：(1)将壳聚糖(分子量47KDa，脱乙酰化度90％)分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积分数为1％的乙酸，过夜搅拌，用滤纸过滤后，得到壳聚糖溶液，壳聚糖浓度为0.45mg/mL。(2)将肝素分散于灭菌的蒸馏水中，磁力搅拌下，搅拌5min，用0.22μm滤膜过滤后，得到肝素溶液，肝素浓度为0.3mg/mL。(3)将EV71VP1蛋白溶解于蒸馏水中，用0.22μm滤膜过滤后，得到EV71VP1蛋白溶液，EV71VP1蛋白的浓度为30μg/mL。(4)将CpGODN1826溶解于蒸馏水中，磁力搅拌下，搅拌5min，用0.22μm滤膜过滤后，得到CpG溶液，CpG浓度为43.2μg/mL。(5)将壳聚糖溶液、肝素溶液、EV71VP1蛋白溶液和CpG溶液分别装入四支注射器中，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器的注射孔分别与塑料管1-4各自的一端密封连接，塑料管的另一端分别通过连接部件与多入口涡流混合器第一部件的四个通道密封连接。多入口涡流混合器的第一部件、第二部件和第三部件通过螺栓密封连接，并且第三部件的通道通过连接部件与塑料管5的一端密封连接，塑料管5的另一端连接收集容器。各个通道内的溶液的体积均为5mL。(5)开启高压泵，使壳聚糖溶液、肝素溶液、EV71VP1蛋白溶液和CpG溶液同时以20mL/min的流速经塑料管1-4进入多入口涡流混合器，并在第二部件的涡流混合区域混合，得到溶液A，经塑料管5流至收集容器中。(6)将溶液A用100KD的超滤管，在4℃、15000g/min的条件下超滤浓缩10min，获得包裹EV71VP1蛋白和CpG的壳聚糖-肝素纳米颗粒的溶液(命名为CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒溶液)。3.将TNF-α溶解于蒸馏水中，磁力搅拌下，搅拌5min，用0.22μm滤膜过滤后，即得到TNF-α溶液，TNF-α的浓度为0.2μg/mL。按照步骤(1)-(6)的操作和参数，将CpG溶液换为TNF-α溶液，制备得到包裹EV71VP1蛋白和TNF-α的壳聚糖-肝素纳米颗粒的溶液(命名为CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒溶液)。4.参照步骤(1)-(6)的操作和参数，仅使用壳聚糖溶液和肝素溶液，制备不含抗原和免疫佐剂的壳聚糖-肝素纳米颗粒的溶液(命名为CS+Heparin纳米颗粒溶液)，用于对照实验。5.参照步骤(1)-(6)的操作和参数，使用壳聚糖溶液、肝素溶液和EV71VP1蛋白溶液，制备包裹EV71VP1蛋白、不含免疫佐剂的壳聚糖-肝素纳米颗粒的溶液(命名为CS+VP1+Heparin纳米颗粒溶液)，用于对照实验。实施例2.纳米颗粒的形态表征、粒径测试和电位测试：1.形态表征：使用透射电镜观察包裹EV71VP1蛋白和CpG的壳聚糖-肝素纳米颗粒，以及包裹EV71VP1蛋白和TNF-α的壳聚糖-肝素纳米颗粒，两种纳米颗粒的形态分别如图3A和3B所示。如图所示，两种纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象。2.粒径测试和Zeta电位测试：利用马尔文粒径仪(带有动态光散射检测器)对包裹EV71VP1蛋白和CpG的壳聚糖-肝素纳米颗粒，以及包裹EV71VP1蛋白和TNF-α的壳聚糖-肝素纳米颗粒的平均粒径和Zeta电位进行测试，结果如表2所示。表2图4A和4B分别为包裹EV71VP1蛋白和CpG的壳聚糖-肝素纳米颗粒，以及包裹EV71VP1蛋白和TNF-α的壳聚糖-肝素纳米颗粒的粒径分布图。如图所示，两种纳米颗粒均具有较窄的粒径分布，粒径分布对称。实施例3纳米颗粒中EV71VP1蛋白和免疫佐剂的包封率的计算1.取CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒溶液，在4℃、60000g条件下离心20min，取上清，记录体积后，采用EV71VP1Elisa试剂盒，检测上清中游离EV71VP1蛋白的含量，按照如下公式计算纳米颗粒中EV71VP1蛋白的包封率。EV71VP1蛋白的包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的EV71VP1蛋白的总量；w1为上清中游离的EV71VP1蛋白的总量。2.取CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒溶液，在4℃、60000g条件下离心20min，取上清，记录体积后，用Nanodrop分光光度计检测上清中游离CpG的含量，按照如下公式计算纳米颗粒中CpG的包封率：CpG的包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的CpG的总量；w1为上清中游离的CpG的总量。3.取CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒溶液，在4℃、60000g条件下离心20min，取上清，记录体积后，采用EV71VP1Elisa试剂盒，检测上清中游离EV71VP1蛋白的含量，按照如下公式计算颗粒中EV71VP1蛋白的包封率：EV71VP1蛋白的包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的EV71VP1蛋白的总量；w1为上清中游离的EV71VP1蛋白的总量。4.取CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒溶液，在4℃、60000g条件下离心20min，取上清，记录体积后，采用TNF-αElisa试剂盒，检测上清中游离TNF-α的含量，按照如下公式计算颗粒中TNF-α的包封率：TNF-α的包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的TNF-α的总量；w1为上清中游离的TNF-α的总量。包封率的测定结果如表3所示。表3从表3的结果可以看出，本发明的上述两种纳米颗粒中，EV71VP1蛋白的包封率和免疫佐剂的包封率均较高，有利于纳米颗粒引起强的免疫效果。实施例4纳米颗粒在小鼠体内的免疫效果评价1.免疫方式将4-6周雌性BALB/c小鼠分为A、B、C、D、E、F、G七组，每组6只。采用足底注射的注射方式，按照表4中的免疫方案对小鼠进行免疫，每两周免疫一次，共免疫3次。表42.免疫效果评价(1)小鼠血清中IgG检测分别在第一次免疫后的第14天、第二次免疫后的第14天、第三次免疫后的第14天和第28天进行眼眶采血，分离血清，Elisa检测血清中IgG的滴度。检测过程：1)将1μg/mL的EV71VP1抗原包被在96孔板中，每孔100μL，4℃过夜包被。2)过夜包被的板，用PBST洗3次，每次200μL，用4％脱脂奶粉在室温下封闭2h。3)取2μL免疫血清或阴性对照血清，稀释至200μL，再依次倍比稀释，加入到包被抗原的孔中，室温下孵育2h。4)清洗5次，加工作浓度的IgG-HRP，每孔100μL，室温孵育2h。5)清洗5次，每孔加100μLTMB底物，黑暗下孵育20min，用200μL2MH2S04终止反应，450nm处检测OD值。6)计算滴度，若标本孔的平均吸收值(P)与阴性对照(A组)平均吸收值(N)的比值(即P/N)大于2.1，则判定标本孔为阳性。检测结果如图5A-5D所示。图5A显示了第一次免疫后的第14天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度高于C组，并且具有显著性差异(P＜0.05)。图5B显示了第二次免疫后的第14天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，E组(施予CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒)和F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度均高于D组(施予CS+VP1+Heparin纳米颗粒)。F组小鼠的血清IgG滴度高于C组(施予铝佐剂和EV71VP1的混合物)，并且具有极显著差异(P＜0.01)。图5C显示了第三次免疫后的第14天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，与C组(施予铝佐剂和EV71VP1的混合物)小鼠的血清IgG滴度相比，E组(施予CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒)和F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度更高，并且均有极显著差异(P<0.001)。F组小鼠的血清IgG滴度接近于G组(施予市售含铝佐剂和灭活EV71病毒的疫苗)。图5D显示了第三次免疫后的第28天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，与C组(施予铝佐剂和EV71VP1的混合物)小鼠的血清IgG滴度相比，E组(施予CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒)和F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度更高，并且均有极显著差异(P<0.01)。F组小鼠的血清IgG滴度略高于G组(施予市售含铝佐剂和灭活EV71病毒的疫苗)。E组与G组小鼠的血清IgG滴度接近。实验结果表明，本发明的包含EV71VP1和特定免疫佐剂(例如CpG或TNF-α)的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，能够增强体液免疫，提高抗体的滴度。本发明的纳米颗粒的免疫效果明显优于铝佐剂与EV71VP1的混合物。本发明的纳米颗粒与市售含铝佐剂和灭活EV71病毒的疫苗的免疫效果相当，甚至优于市售疫苗。(2)小鼠血清中IgG亚型检测。第三次免疫后的第28天，对小鼠进行眼眶采血，分离血清，Elisa检测血清中IgG2a和IgG1的滴度，计算IgG2a/IgG1的比值，结果如图6所示。如图所示，E组(施予CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒)和F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)小鼠血清中IgG2a/IgG1均高于C组(施予铝佐剂和EV71VP1的混合物)，并具有显著性差异(P<0.05)。E组和F组小鼠血清中IgG2a/IgG1均高于G组(施予市售含铝佐剂和灭活EV71病毒的疫苗)。实验结果表明，使用本发明的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，能够促进T细胞的极化，增强细胞免疫的效果。(3)小鼠肠道中IgA滴度检测。第三次免疫后的第28天，取各组小鼠盲肠以上16cm的小肠部分，用2mL含蛋白酶抑制剂的PBS反复冲洗5次，用Elisa检测所获的小肠灌洗液中IgA滴度，结果如图7所示。如图所示，E组(施予CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒)和F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)小鼠血清中IgA的滴度均高于C组(施予铝佐剂和EV71VP1的混合物)，并具有显著性差异(P<0.05)。E组和F组小鼠血清中IgG2a/IgG1均高于G组(施予市售含铝佐剂和灭活EV71病毒的疫苗)。同时，E组和F组小鼠血清中IgA滴度均高于G组(施予市售含铝佐剂和灭活EV71病毒的疫苗)。实验结果表明，使用本发明的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，在肠道能引起一定的粘膜免疫。(4)淋巴细胞增殖检测实验过程：1)第三次免疫后的第28天，取各组小鼠脾脏，研磨后将所获得的1mL细胞悬液沿管壁加到2mL商购的淋巴细胞分离液上，500g离心30min，取云雾状白膜层。2)使用PBS清洗3次后，用1640完全培养基将细胞稀释成3×106个/mL的细胞悬液，向96孔培养板中，每孔加100μL细胞悬液，每组三个复孔。3)向每孔中加终浓度为10μg/mL的EV71VP1蛋白刺激细胞，37℃培养箱中培养72h，每孔中加40μL的celltiter96，37℃培养箱中孵育4h，490nm处测吸光值。4)结果判定：取三个复孔的平均值A，淋巴细胞增殖指数(proliferationindex，PI)＝实验组A值/对照组A值。图8显示了用抗原刺激各组小鼠免疫后的淋巴细胞后，淋巴细胞的增值指数。结果显示，E组(施予CS+VP1+CpG+Heparin纳米颗粒)的淋巴细胞增殖指数与C组(施予铝佐剂和EV71VP1的混合物)相比有显著差异；而F组(施予CS+VP1+TNF-α+Heparin纳米颗粒)的淋巴细胞增殖指数与C组相比，有极显著差异(P<0.001)。实验结果表明，本发明的纳米颗粒对小鼠免疫后，淋巴细胞再次遇到抗原，能够增殖分化，从而增强免疫效果。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。序列表<110>中山大学<120>包含EV71VP1蛋白的纳米颗粒及其制备方法<130>IDC160134<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>267<212>PRT<213>Enterovirus71<400>1GlyAspArgValAlaAspValIleGluSerSerIleGlyAspSerVal151015SerArgAlaLeuThrHisAlaLeuProAlaProThrGlyGlnAsnThr202530GlnValSerSerHisArgLeuAspThrGlyLysValProAlaLeuGln354045AlaAlaGluIleGlyAlaSerSerAsnAlaSerAspGluSerMetIle505560GluThrArgCysValLeuAsnSerHisSerThrAlaGluThrThrLeu65707580AspSerPhePheSerArgAlaGlyLeuValGlyGluIleAspLeuPro859095LeuGluGlyThrThrAsnProAsnGlyTyrAlaAsnTrpAspIleAsp100105110IleThrGlyTyrAlaGlnMetArgArgLysValGluLeuPheThrTyr115120125MetArgPheAspAlaGluPheThrPheValAlaCysThrProThrGly130135140GluValValProGlnLeuLeuGlnTyrMetPheValProProGlyAla145150155160ProLysProAspSerArgGluSerLeuAlaTrpGlnThrAlaThrAsn165170175ProSerValPheValLysLeuSerAspProProAlaGlnValSerVal180185190ProPheMetSerProAlaSerAlaTyrGlnTrpPheTyrAspGlyTyr195200205ProThrPheGlyGluHisLysGlnGluLysAspLeuGluTyrGlyAla210215220CysProAsnAsnMetMetGlyThrPheSerValArgThrValGlyThr225230235240SerLysSerLysTyrProLeuValValArgIleTyrMetArgMetLys245250255HisValArgAlaTrpIleProArgProMetArg260265<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>CpGODN<400>2tccatgacgttcctgacgtt20当前第1页1 2 3