一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法及其应用与流程

本发明属于动物疾病防治技术领域，尤其涉及一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，还涉及一种上述制备方法所制得的灭活疫苗，还涉及一种上述灭活疫苗的应用。

背景技术：

水貂出血性肺炎是由铜绿假单胞菌(又称绿脓杆菌，Pseudomonas aeruginosa)感染引起的一种高度致死性传染病，又称铜绿假单胞菌肺炎，多发于每年7至9月份，以水貂出血性肺炎、败血症为主要特征，发病急，死亡快，常呈地方性暴发流行，致死率极高。本病世界各地均有发生，是危害水貂养殖业的重要传染病之一。该菌可通过患病水貂形成的飞沫及气溶胶传播，以呼吸困难、口鼻出血、突发性死亡为主要特征，死后典型症状为口鼻流出血样泡沫，剖检肺脏呈弥漫性出血。

铜绿假单胞菌，又称绿脓杆菌，属于γ变性菌门假单胞菌科，为需氧或兼性厌氧菌的革兰氏阴性杆菌。目前对铜绿假单胞菌分型常用方法是血清学分型，国际血清分型系统根据菌体O抗原将其分为20个不同的血清型。日本科学家Homma根据O抗原将铜绿假单胞菌分为A～N群，并且根据此系统形成的试剂盒在国际社会形成广泛应用。铜绿假单胞菌为条件致病菌，广泛存在于环境中，接种疫苗是预防该病的有效方法，同时避免了使用抗生素导致菌株产生耐药性。目前铜绿假单胞菌疫苗主要针对人医领域，在兽医领域较少，而且针对水貂出血性肺炎的灭活疫苗仅仅局限于区域流行B型G型的二联苗。因此开发出一种免疫范围广的水貂出血性肺炎肺炎疫苗以解决血清型问题、减少免疫接种次数从而减少免疫应急具有重要的现实意义和经济意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种免疫范围广的水貂出血性肺炎灭活疫苗的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.6～0.8之间，再37℃扩大培养12h，然后25℃避光静止培养三天以上直至呈绿色荧光；

(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速160-180r/min，灭活处理72小时，涂板检验菌液是否彻底灭活；

(3)配苗：将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液离心，取上清液，向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液中的蛋白质沉淀，离心，取沉淀的蛋白质，将沉淀的蛋白质用无菌生理盐水溶解，调整多组份蛋白浓度为500ug/ml，加入佐剂，4度过夜，即得。

铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9是通过大连瓦房店水貂养殖区临床分离得到(任何公众均可通过常规手段分离获得)，这是通过提取测序比对得知。

本发明中，上清液疫苗的蛋白浓度是通过BCA蛋白定量试剂盒检测，BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司。

为检验本发明的步骤(1)所得的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9的上清液的毒性情况，将离心的上清液0.05ml小鼠皮下多点注射，实验结果为小鼠3天后均出现死亡。通过蛋白电泳可以观察到离心的上清液中有多种组分蛋白。

将本发明步骤(2)所得的灭活后的上清液室温培养72小时后取适量灭活后的上清液涂布LB固体培养基，检验是否有铜绿假单胞菌存活。将本发明步骤(2)所得的灭活后的上清液室温培养72小时后取适量灭活后的上清注射到昆明小鼠腿部肌肉，检测上清液中的毒素蛋白是否完全灭活。结果表明，本发明步骤(2)所得的灭活后的上清液中无铜绿假单胞菌存活，步骤(2)所得的灭活后的上清液中的毒素蛋白已完全灭活。

进一步地，步骤(3)中的佐剂为基于铝的佐剂，优选地，所述基于铝的佐剂为氢氧化铝胶体佐剂，可购自Sigma公司。具体地，氢氧化铝胶体佐剂的终浓度为0.5mg/ml。

本发明还公开了一种上述制备方法所制得的水貂铜绿假单胞菌上清液灭活疫苗。

目前防治水貂铜绿假单胞菌的疫苗都是以菌体作为灭活疫苗研发二联苗，而且针对水貂出血性肺炎的灭活疫苗仅仅局限于区域流行的B型G型的二联苗制备来减少免疫应急。由于铜绿假单胞菌上清液释放有脓杆菌合成或分泌的可溶性毒性产物如外毒素A、胞外酶(S、T、U和Y等)、蛋白酶、色素、耐热溶血素、杀细胞素、磷脂酶C等，本发明以铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9的上清液代替菌体，极大解决了血清型差异问题，具有免疫范围广，降低成本，减少免疫接种次数从而减少应急，增加经济收入的效果。

本发明还公开了一种上述制备方法所制得的上清液灭活疫苗在防治水貂出血性肺炎中的应用：肌肉注射本发明的上清液多组分蛋白灭活疫苗，免疫剂量按照500ug每只。

为检验本发明所制得的上清液灭活疫苗的安全性，进行了安全性检查：将本发明所制得的水貂铜绿假单胞菌上清液灭活疫苗分别免疫小鼠和水貂，三天后观察，结果无任何临床症状。

抗体检测：特异性抗体水平检测、特异性分泌细胞检测结果表明，本发明所制得的铜绿假单胞菌上清液多组份蛋白灭活疫苗与常规的菌体灭活疫苗特异抗体水平无显著差异，特异性分泌细胞无显著差异。

为检验本发明所制得的上清液灭活疫苗的免疫保护效力，进行了保护率实验，结果表明，在感染铜绿假单胞菌15天后，铜绿假单胞菌上清液多组份疫苗免疫水貂存活率100％。

应用发病率：实验于诸城市大森林特种动物养殖区进行，实验结果表明，本发明的上清液多组份致病蛋白疫苗对水貂具有良好的保护作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明制备的上清液多组份致病蛋白疫苗与常规的菌体灭活疫苗经安全性性检查、特异性抗体水平及水貂保护率比较无显著差异。本发明以铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9的上清液代替菌体，极大解决了血清型差异问题，具有免疫范围广，降低成本，减少免疫接种次数从而减少应急，增加经济收入的效果，并且对水貂具有良好的保护作用。

附图说明

图1为特异性抗体水平检测结果图示；

图2为特异性细胞分泌抗体检测结果图示；

图3为ZHDL9强毒株攻毒保护实验结果图示。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明制备灭活疫苗所用的铜绿假单胞菌ZHDL9及检验所用的铜绿假单胞菌ZHDL9是通过大连瓦房店水貂养殖区临床分离得到(任何公众均可通过常规手段分离获得)，通过提取测序比对得知。

实施例1

一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.62时，再37℃扩大培养12h，然后25℃避光静止培养三天以上直至呈绿色荧光；

(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速160r/min，灭活处理72小时，涂板检验菌液是否彻底灭活；

(3)配苗：将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液13000rpm离心，取上清液，向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液中的蛋白质沉淀，离心，取沉淀的蛋白质，将沉淀的蛋白质用无菌生理盐水溶解，调整多组份蛋白浓度为500ug/ml，加入佐剂，4度过夜，即得。所述氢氧化铝胶体佐剂可购自Sigma公司。

实施例2

一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.62时，再37℃扩大培养12h，然后25℃避光静止培养三天以上直至呈绿色荧光；

(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速170r/min，灭活处理72小时，涂板检验菌液是否彻底灭活；

(3)配苗：将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液离心，取上清液，向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液中的蛋白质沉淀，离心，取沉淀的蛋白质，将沉淀的蛋白质用无菌生理盐水溶解，调整多组份蛋白浓度为500ug/ml，加入佐剂，4度过夜，即得。所述氢氧化铝胶体佐剂可购自Sigma公司，氢氧化铝胶体佐剂的终浓度为0.5mg/ml。

实施例3

一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.76时，再37℃扩大培养12h，然后常温(25℃)避光静止培养三天以上直至呈绿色荧光；

(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速180r/min，灭活处理72小时，涂板检验菌液是否彻底灭活；

(3)配苗：将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液离心，取上清液，向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液中的蛋白质沉淀，离心，取沉淀的蛋白质，将沉淀的蛋白质用无菌生理盐水溶解，调整多组份蛋白浓度为500ug/ml，加入佐剂，4度过夜，即得。

上清液毒性检测实验

为检验本发明的步骤(1)所得的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9的上清液的毒性情况，将实施例1-实施例3的步骤(1)离心所得的上清液分别0.05ml小鼠皮下多点注射，实验结果为小鼠3天后均出现死亡。通过蛋白电泳可以观察到步骤(1)离心所得的上清液中有多种组分蛋白。

实验用小鼠购自哈药集团三精制药有限公司，为6周齢雌性SPF级昆明小鼠20±2g。

上清液灭活疫苗的灭活情况检测实验

将实施例1-实施例3的步骤(2)所得的灭活后的上清液分别室温培养72小时后分别取适量灭活后的上清液涂布LB固体培养基，分别检验是否有铜绿假单胞菌存活。将本发明实施例1-实施例3的步骤(2)所得的灭活后的上清液分别室温培养72小时后分别取适量灭活后的上清注射到昆明小鼠腿部肌肉，检测上清液中的毒素蛋白是否完全灭活。

实验用昆明小鼠购自哈药集团三精制药有限公司，为6周齢雌性SPF级昆明小鼠20±2g。

结果表明，本发明实施例1-实施例3的步骤(2)所得的灭活后的上清液中无铜绿假单胞菌存活，步骤(2)所得的灭活后的上清液中的毒素蛋白已完全灭活。

安全性检查实验

为检验本发明所制得的上清液灭活疫苗的安全性，进行了安全性检查：将本实施例1-实施例3的所制得的水貂铜绿假单胞菌上清液灭活疫苗分别免疫小鼠和水貂，三天后观察，结果无任何临床症状。

实验用小鼠购自哈药集团三精制药有限公司，为20±2g清洁级昆明小鼠。

实验用水貂购自诸城市大森林特种动物养殖区，为2～5月龄健康易感激素水貂。

抗体检测实验

本实验中，水貂铜绿假单胞菌上清液多组分疫苗组所用疫苗为本发明实施例2所制得的水貂铜绿假单胞菌上清液灭活疫苗。向实验水貂肌肉注射本发明实施例2所得的上清液多组分蛋白灭活疫苗，免疫剂量按照500ug每只。

铜绿假单胞菌菌体疫苗组所用疫苗的具体制备方法如下：

(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.75时，再37℃扩大培养12h，得铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液；

(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速160-180r/min，灭活处理72小时；

(3)将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9离心(13000rpm)，收集沉淀细菌，再用PBS磷酸缓冲溶液或生理盐水悬浮沉淀，调节细菌细胞浓度至10⁸～10⁹cells/ml。取样，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长。

铜绿假单胞菌菌体疫苗组的处理为：向实验水貂肌肉注射铜绿假单胞菌菌体疫苗组的疫苗(即为常规菌体灭活疫苗)，免疫剂量按照500ug每只。空白对照组不接种任何疫苗、注射500ug生理盐水。

由图1和图2可见，特异性抗体水平检测、特异性分泌细胞检测结果表明，本发明实施例2所得的铜绿假单胞菌上清液多组份蛋白灭活疫苗与常规的菌体灭活疫苗(铜绿假单胞菌菌体疫苗组)相比特异抗体水平无显著差异，特异性分泌细胞无显著差异。

实验用水貂购自诸城市大森林特种动物养殖区，为2～5月龄健康易感激素水貂。

保护率实验

为检验本发明所制得的上清液灭活疫苗的免疫保护效力，进行了保护率实验。

水貂铜绿假单胞菌上清液多组分疫苗组(第一组)所用疫苗为本发明实施例2所制得的水貂铜绿假单胞菌上清液灭活疫苗。

铜绿假单胞菌菌体疫苗组(第二组)所用疫苗的具体制备方法如下：

(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.75时，再37℃扩大培养12h，得铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液；

(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速160-180r/min，灭活处理72小时；

(3)将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9离心(13000rpm)，收集沉淀细菌，再用PBS磷酸缓冲溶液或生理盐水悬浮沉淀，调节细菌细胞浓度至10⁸～10⁹cells/ml。取样按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长。

对照组(第三组)为不接种任何疫苗的处理组(生理盐水代替)。

免疫30天后，对各实验组和对照组的水貂感染铜绿假单胞菌。

实验处理见表1：

表1铜绿假单胞菌上清液多组份灭活疫苗与菌体灭活疫苗特异抗保护性实验

结果：在感染铜绿假单胞菌第一天，所有实验组没有出现死亡。在感染的第二天，对照组的水貂开始萎靡、食欲减退，第三天后出现出血性死亡。在感染15天后，铜绿假单胞菌上清液多组份疫苗组存活率显著高于铜绿假单胞菌菌体疫苗组(p<0.05)，铜绿假单胞菌菌体免疫水貂存活率80％，铜绿假单胞菌上清液多组份疫苗免疫水貂存活率100％。

实验用水貂购自诸城市大森林特种动物养殖区，为2～5月龄健康易感水貂。

应用发病率实验

实验于诸城市大森林特种动物养殖区进行，实验过程中观察并记录实验情况，实验结果见表2：

表2应用发病率实验

实验结果表明：本发明制备的上清液多组份致病蛋白疫苗与常规的菌体灭活疫苗经安全性性检查、特异性抗体水平及水貂保护率比较无显著差异。本发明以铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9的上清液代替菌体，极大解决了血清型差异问题，具有免疫范围广，降低成本，减少免疫接种次数从而减少应急，增加经济收入的效果，并且对水貂具有良好的保护作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。