本发明属于生物和医药领域，具体地涉及一种具有强免疫原性的的肿瘤坏死因子α（TNF-α）疫苗的制法和用途。
背景技术：
肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 作为一种重要的免疫调控分子，在细胞的生长、分化以及死亡等生理和病理过程中发挥重要的作用。TNF-α是一种主要由单核细胞或巨噬细胞产生的细胞因子，不仅能选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节功能。近年来研究发现，多种人类疾病和体内TNF-α的表达水平高有关，例如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和恶性肿瘤等。抑制TNF-α的功能已被证实可有效治疗上述疾病。事实上，在过去10年-15年中，美国FDA已批准5种TNF-α抑制剂，用于治疗包括类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、克罗恩病等自身免疫性疾病。这些抑制剂全部为单克隆抗体，包括Remicade、Humira、Simponi、Cimzia和Enbrel。这些药物是目前世界上最畅销的生物制剂。2014年，Humira、Remicade和Enbrel的销售额分别达到125.4亿美元、92.4亿美元和85.38亿美元。
单克隆抗体药物具有一些缺点，包括用药剂量大（100 mg），使用频繁（2-4次/月），费用昂贵，以及会产生抗药性抗体，因此在中国只有不到10%的患者能够长期使用。预防型疫苗是人类医疗史上最伟大的发明，在上个世纪挽救了上百万的生命。近年来针对针对自体蛋白的治疗型疫苗也迅速发展，到目前已有20多个针对高血脂、高血压、肥胖、自身免疫性疾病和肿瘤等慢性疾病的疫苗进入临床试验。与单克隆抗体相比，疫苗用药剂量少（100 ug），使用不频繁（2-3次/年），费用相对较低以及不产生抗药性抗体。因此研发靶向TNF-α的疫苗被认为在保持抗体药物治疗疾病的效果的同时，可有效解决单克隆抗体药物的各种缺点。
目前多种以TNF-α为靶点的疫苗已经进展到不同的阶段治疗。由于免疫耐受机制的存在，自体蛋白单独注射免疫并不能诱导产生抗体。为自体蛋白提供外源Th表位已被证实可有效帮助打破免疫耐受，赋予自体蛋白免疫原性。在mTNF-α分子中通过插入非天然的硝基酪氨酸从而引入外源的Th表位。结果证实该抗原可成功打破小鼠的免疫耐受，诱导产生针对mTNF-α的中和抗体。但是用该方法构建的抗原，TNF-α保留生物活性，因此免疫时会引起副作用。2006年Le Buanec等将hTNF-α通过戊二醛化学偶联到载体蛋白钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet emocyanin, KLH)上，通过甲醛可有效灭活TNF-α的活性。但是遗憾的是，该抗原在II期临床试验中并没能诱导产生的针对hTNF-α的中和抗体。因此开发新的针对TNF-α的疫苗具有重要意义，而这些疫苗的制备需要解决两个问题：（1）去除TNF-α的生物活性，降低抗原的毒副作用；（2）保留抗原的免疫原性，在体内能有效诱导产生中和TNF-α的抗体。
hTNF-α蛋白上的个别氨基酸残基影响其生活活性。本研究室前期研究发现，在氨基酸序列87位和145位进行氨基酸替换（Y87H/A145R）后，突变蛋白的生物活性相对于野生型hTNF-α的0.000897%，即活性几乎丧失，但是在小鼠体内其免疫原性跟野生型hTNF-α的相当。因此该突变蛋白是一个非常好的抗原，可用于TNF-α疫苗设计。
P64K蛋白是一种脑膜炎球菌外膜蛋白，由593个氨基酸组成，相对分子量约70 kDa。近年来研究发现P64K无论是与弱抗原共价结合还是在基因水平上融合表达，都是一种很由前途的弱抗原载体。加拿大York Medical公司与古巴分子免疫学中心合作开发了表皮生长因子（EGF）疫苗，该疫苗由人EGF化学偶联重组P64K蛋白构成，能有效刺激人体免疫系统产生抗EGF抗体，从而抑制恶性肿瘤。重组P64K蛋白是近年研发的一种新型抗原载体，相对于传统的载体蛋白，如TT、牛血清白蛋白，具有更好的免疫增强效果，而且性质均一稳定，能通过基因工程方法大量表达。因此，具有非常广阔的应用前景。
本研究将hTNF-α在Y87H/A145R突变的蛋白（简称为hTNF-YA）与P64K载体蛋白化学偶联构成靶向hTNF-α的抗原，并评价该抗原与佐剂联用后在小鼠体内的免疫原性。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种含佐剂的抗TNF-α的蛋白质疫苗，包括TNF-α抗原、P64K以及液体佐剂。
具体的，人TNF-α在Y87H/A145R突变的蛋白（hTNF-YA）是重组表达获得的重组蛋白，P64K作为载体蛋白，液体佐剂是氢氧化铝佐剂。
本发明的另一个目的是提供生产含佐剂的抗TNF-α的蛋白质疫苗的制备方法，步骤包括基因重组分别获得hTNF-YA和P64K蛋白，用化学偶联剂将hTNF-YA与细菌外膜蛋白化学偶联，最后添加液体佐剂。
具体地，化学偶联剂是带有两个活性醛基的戊二醛；偶联的细菌外膜蛋白是P64K蛋白，以该蛋白为载体的其它一些疫苗已被临床试验，是安全有效的。
本发明还有一个目的是提供一种增强抗TNF-α疫苗的免疫原性的方法，包括步骤：（1）采用TNF-α全蛋白，富含线性和非线性B细胞表位；（2）引入P64K，作为载体蛋白，可有效递送抗原到MHC类分子尚；（3）引入佐剂氢氧化铝，其是成熟的人体用佐剂，安全性是可靠的。
本发明还提供这种含佐剂的抗TNF-α疫苗的用途。
相比与现有技术，本发明将hTNF-YA与P64K偶联，并添加安全的佐剂氢氧化铝。在不引起毒副作用的基础上，疫苗可诱发机体产生有效的免疫反应，从而为TNF-α相关疾病，包括类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病和强直性脊柱炎等提供治疗基础。上述疫苗可能显著提高疫苗的免疫原性，激发强烈的免疫反应，从而延长病人的生存期，改善生活质量。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了hTNF-YA-P64K疫苗在小鼠体内能产生显著的针对hTNF-α的抗体反应。该结果说明所制备的疫苗具有较好的免疫原性。
具体实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，发现将hTNF-YA蛋白与P64K化学偶联，抗原保留有免疫原性，可以有效激发小鼠产生针对人TNF-α的抗体。在此基础上完成了本发明。
代表性蛋白
肿瘤坏死因子α(TNF-α)
肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha) 主要由被激活的单核细胞或巨噬细胞分泌，在参与系统性炎症的同时也是引起急性期反应的细胞因子之一。
单个TNF-α分子由两个β折叠片层组成，其中每一个均为外侧亲水氨基酸丰富而内侧疏水氨基酸丰富。三个单体TNF-α组成三聚体，其中间形成了疏水氨基酸孔道，显著区别于两端极性氨基酸。单体分子的N端和C端在三聚体底部，在三聚体顶部出现单体分子的内部二硫键。三聚体形式是其生物活性的基础。
人TNF-α氨基酸序列（CAD20719）如下所示：
1 MVRSSSRTPS DKPVAHVVAN PQAEGQLQWL NRRANALLAN
41 GVELRDNQLV VPSEGLYLIY SQVLFNNFTV SFWLRVPKVS
81 ASHLEVSYQT KVNLLSAIKS PCQRETPEGA EAKPWYEPIY
121 LGGVFQLEKG DRLSAEINRP DYLDFAESGQ VYFGIIAL
P64K蛋白
P64K蛋白是一种脑膜炎球菌外膜蛋白，由593个氨基酸组成，相对分子量约70 kDa。
其氨基酸序列如下所示：
>tr|Q9JZ09|Q9JZ09_NEIMB Dihydrolipoyl dehydrogenase OS=Neisseria meningitidis serogroup B (strain MC58) GN=lpdA2 PE=1 SV=1
MALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLETDKATMDVPAEVAGVVKEVKVKVGDKISEGGLIVVVEAEGTAAAPKAEAAAAPAQEAPKAAAPAPQAAQFGGSADAEYDVVVLGGGPGGYSAAFAAADEGLKVAIVERYKTLGGVCLNVGCIPSKALLHNAAVIDEVRHLAANGIKYPEPELDIDMLRAYKDGVVSRLTGGLAGMAKSRKVDVIQGDGQFLDPHHLEVSLTAGDAYEQAAPTGEKKIVAFKNCIIAAGSRVTKLPFIPEDPRIIDSSGALALKEVPGKLLIIGGGIIGLEMGTVYSTLGSRLDVVEMMDGLMQGADRDLVKVWQKQNEYRFDNIMVNTKTVAVEPKEDGVYVTFEGANAPKEPQRYDAVLVAAGRAPNGKLISAEKAGVAVTDRGFIEVDKQMRTNVPHIYAIGDIVGQPMLAHKAVHEGHVAAENCAGHKAYFDARVIPGVAYTSPEVAWVGETELSAKASGRKITKANFPWAASGRAIANGCDNGFTKLIFDAETGRIIGGGIVGPNGGDMIGEVCLAIEMGCDAADIGKTIHPHPTLGESIGMAAEVALGTCTDLPPQKKK
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的人TNF-α蛋白与完整破伤风毒素化学偶联产物 hTNF-TT，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。
本发明的组合物可以是单价的(仅含有一个突变位点或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多个突变位点或多种单突变位点蛋白组合或多核苷酸)。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(1)药物组合物
本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明hTNF-TT。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约 0.001 毫克/千克至 1000 毫克/千克，较佳地约 0.01 毫克/千克至 100 毫克/千克体重的突变蛋白。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的hTNF-YK-P64K)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH 缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明hTNF-YK-P64K)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等； (2)水包油型乳剂配方，例如：(a) MF59(参见 WO 90/14837)， (b) SAF，
和(c) RibiTM佐剂系统(RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) (3) 皂素佐剂；(4) Freund 完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5) 细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素 LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH 缓冲物质等可存在于这类运载体中。更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。
(iii)给药途径和剂量
一旦配制成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。
当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的突变蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。应以“有效量”给予突变蛋白疫苗，即突变蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。
代表性的疾病包括(但并不限于)：类风湿性关节炎、银屑病、炎症性肠炎等。
在各疫苗剂份中所选用的抗原蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约 1μg-1000mg，较佳地为 1μg-100mg，更佳地 10μg-50mg 蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。
此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。
本发明的第一方面，提供了一种强化抗TNF-α的蛋白质疫苗的免疫原性的方法。该方法的原理是：（1）使用完整的人TNF-α蛋白作为抗原组分，具有更多的B细胞表位；（2）引入P64K作为载体蛋白，可有效递呈抗原到MHC类分子上，帮助打破机体免疫耐受，增强抗原的免疫原性；（3）氢氧化铝是人体内广泛使用的免疫佐剂，可增强Th2免疫反应，诱导产生抗体，其安全性可靠。
本发明的第二方面，提供了一种抗TNF-α的蛋白质疫苗。该疫苗采用本发明的第一方面所述的方法进行设计。在疫苗分子中，人TNF-α含有多个B细胞表位，且人TNF-α在Y87H/A145R突变的蛋白可有效去除毒性，为了叙述方便，在实施例中，本发明将该突变蛋白用“hTNF-YA”表示；细菌外膜蛋白为P64K；将偶联后的蛋白质抗原表示为“hTNF-YA-P64K”。
本发明的第三方面，提供了一种生产抗TNF-α的蛋白质疫苗的方法，其制造方法如下：
1 hTNF-YA基因构建、蛋白表达和纯化
以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物Y87H-R和T7-F进行PCR扩增，获得hTNFY87H-上基因片段；用引物Y87H-F和T7-R进行PCR扩增，获得hTNFY87H-下基因片段。PCR产物进行电泳检测和凝胶回收。将回收的hTNFY87H-上基因片段和hTNFY87H-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物进行PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000 bp到1200 bp之间，符合带SUMO标签的Y87H基因的理论值1100 bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNFY87H基因片段。
以hTNFY87H基因片段为模板，用引物A145R-R和T7-F进行PCR扩增，获得hTNFY87H/A145R-上基因片段；用引物A145R-F和T7-R进行PCR扩增，获得hTNFY87H/A145R-下基因片段。PCR产物通过电泳检测和凝胶回收。将回收的hTNFY87H/A145R-上基因片段和hTNFY87H/A145R-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物进行PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000 bp到1200 bp之间，符合带SUMO标签的Y87H/A145R基因的理论值1100 bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNFY87H/A145R基因片段。
用内切酶BamH I及Nde I对pET28a空质粒进行线性化处理：反应体系50 μL，条件为37℃，4 h，酶切产物进行凝胶电泳检测，结果显示条带位于5200 bp-5500 bp，符合pET28a质粒线性化后预期大小的位置，从琼脂糖凝胶回收，得到线性化的pET28a质粒。
取2 μL ExnaseTm II、4 μL 5 CE II buffer、线性化pET28a质粒60 ng（2μL），hTNFY87H/A145R基因片段120 ng（6μL），反应体系加ddH2O补足至20 μL，37℃孵育30 min，然后立即置于冰上5 min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E. Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000 bp到1200 bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNFY87H/A145R基因的预期大小(约1100 bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序,序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNFY87H/A145R质粒。
取上述测序正确的菌种对应质粒1μL，热激法转化50 μL E. Coli BL21感受态细胞，取300 μL于LB固体平板（Kan 50 μg/mL）涂布均匀，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆接种于 25 mL LB培养基（Kan 50 μg/mL），37℃、180 r/min振摇培养过夜。将过夜菌按1:500（v:v）转接至 2L TB培养基（Kan 50 μg/mL），37℃、200 r/min振摇培养4-5h，当OD600nm达到0.6时加入1mL的1 mol/L IPTG，25℃、180 r/min振摇培养20-24 h。室温8000 r/min离心5 min收集菌体并称重。
每1 g菌体充分重悬于20 mL上样缓冲液（500 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris，20 mmol/L Imidazole，pH 8.0）进行超声裂解。超声条件设置：超声3s，停5s，功率1%，时间10 min。超声液4℃，12000 r/min 离心40 min后取上清液备用。将Ni-IDA亲和层析柱用平衡液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH 8.0）冲洗10个柱体积以上直至基线冲平。上清液以2 mL/min流速上样，然后用洗杂液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，50 mmol/L Imidazole，pH 8.0）冲洗20个柱体积至紫外峰稳定且低于20mAU，用洗脱液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，500 mmol/L Imidazole，pH 8.0）洗脱蛋白，当紫外峰上升至50mAU时开始收集，并于再次下降到50mAU时停止收集。
将SUMO蛋白酶（2mg/mL）与蛋白洗脱液按体积比1:100充分混匀后，于透析袋中（3.5 kDa孔径，购自Thermo公司），将透析袋置于4L PBS（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，pH 7.4）中4℃透析。每隔12小时更换一次PBS（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，pH 7.4）溶液，重复2次。最后一次更换溶液后第12小时检测酶切是否充分。取透析样40 μL，加入10μL 5 变性还原缓冲液，充分混匀后再进行沸水浴五分钟，进行12% SDS-PAGE蛋白电泳，上样10μL，浓缩胶90 V电压电泳, 之后电压120 V，总时间约90min，蛋白胶的制备及Running buffer配制参考Bio-Rad标准配方。考马斯亮蓝染色后确定蛋白酶切完全，再次准备过Ni-IDA亲和层析柱，AKTA连接方法与试剂配制按照方法8。以2 mL/min流速上样，当紫外峰上升至40mAU时开始收集，并于再次下降到40mAU时停止收集。
取流穿峰40 μL并加入10 μL 5 变性还原缓冲液充分混匀，进行沸水浴5 min。将上述处理后样本进行SDS-PAGE电泳检测，上样10μL、分离胶浓度12%，前20min电压90 V，之后电压120 V，总时间约90min，蛋白胶的制备及变性还原缓冲液配制参考Bio-Rad标准配方。考马斯亮蓝染色后用凝胶成像系统内置软件分析蛋白纯度。使用BCA定量法，采用3kD孔径的超滤管进行浓缩。直至将目的蛋白浓度调节至为0.5-1mg/mL。在超净台中，将制备好的蛋白溶液每管1mL分装到1.5mL EP管中冻存在-70℃冰箱中以备后续实验使用。
本部分所用的各引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（如下表）：
引物名称 序列5’- 3’
T7-F TAATACGACTCACTATAGGG
T7-R GCTAGTTATTGCTCAGCGG
Y87H-F CGCCGTCTCCCACCAGACCAAGG
Y87H-R CCTTGGTCTGGTGGGAGACGGCG
A145R-F CTTTCGCGAGTCTGGGCAGG
A145R-R CCTGCCCAGACTCGCGAAAG
2 P64K重组蛋白的基因构建和表达纯化
参考熊向华等的方法制备重组P64K蛋白。具体操作如下：将脑膜炎奈瑟氏球菌煮沸10分钟，吸取1 μL作为模板；5 μL 10×PCR缓冲液；1.5 μL 10 mmol/L dNTP；上下游引物各 2 μL；38.3 μL ddH2O。经94度预变性5 分钟后加入0.2 μL DNA聚合酶进行PCR。PCR产物进行电泳检测；特异性条带从凝胶中回收，得到P64K基因片段。
用内切酶Nco I及Eco RI分别对P64K基因片段和对pET28a空质粒进行线性化处理：反应体系50 μL，条件为37℃，4 h，酶切产物进行凝胶电泳检测，结果显示条带位于5200 bp-5500 bp，符合pET28a质粒线性化后预期大小的位置，从琼脂糖凝胶回收，得到线性化的pET28a质粒。
取2 μL ExnaseTm II、4 μL 5 CE II buffer、线性化pET28a质粒60 ng（2μL），P64K基因片段120 ng（6μL），反应体系加ddH2O补足至20 μL，37℃孵育30 min，然后立即置于冰上5 min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E. Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有P64K上下游引物的体系中，进行PCR反应并电泳检测PCR产物。将出现符合目标大小的特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序,序列正确，得到pET28a- P64K质粒。
取上述测序正确的菌种对应质粒1μL，热激法转化50 μL E. Coli BL21感受态细胞，取300 μL于LB固体平板（Kan 50 μg/mL）涂布均匀，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆接种于 25 mL LB培养基（Kan 50 μg/mL），37℃、180 r/min振摇培养过夜。将过夜菌按1:500（v:v）转接至 2L TB培养基（Kan 50 μg/mL），37℃、200 r/min振摇培养4-5h，当OD600nm达到0.6时加入1mL的1 mol/L IPTG，25℃、180 r/min振摇培养20-24 h。室温8000 r/min离心5 min收集菌体并称重。
每1 g菌体充分重悬于20 mL上样缓冲液（500 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris，20 mmol/L Imidazole，pH 8.0）进行超声裂解。超声条件设置：超声3s，停5s，功率1%，时间10 min。超声液4℃，12000 r/min 离心40 min后取上清液备用。将Ni-IDA亲和层析柱用平衡液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH 8.0）冲洗10个柱体积以上直至基线冲平。上清液以2 mL/min流速上样，然后用洗杂液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，50 mmol/L Imidazole，pH 8.0）冲洗20个柱体积至紫外峰稳定且低于20mAU，用洗脱液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，500 mmol/L Imidazole，pH 8.0）洗脱蛋白，当紫外峰上升至50mAU时开始收集，并于再次下降到50mAU时停止收集。
取流穿峰40 μL并加入10 μL 5 变性还原缓冲液充分混匀，进行沸水浴5 min。将上述处理后样本进行SDS-PAGE电泳检测，上样10μL、分离胶浓度12%，前20min电压90 V，之后电压120 V，总时间约90min，蛋白胶的制备及变性还原缓冲液配制参考Bio-Rad标准配方。考马斯亮蓝染色后用凝胶成像系统内置软件分析蛋白纯度。使用BCA定量法，采用3kD孔径的超滤管进行浓缩。直至将目的蛋白浓度调节至为0.5-1mg/mL。在超净台中，将制备好的蛋白溶液每管1mL分装到1.5mL EP管中冻存在-70℃冰箱中以备后续实验使用。
本部分所用的各引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（如下表）：
引物名称 序列5’- 3’
T7-F TAATACGACTCACTATAGGG
T7-R GCTAGTTATTGCTCAGCGG
P64K上游引物 CATGCCATGGCTTTAGTTGAATTGAA
P64K下游引物 GGGAATTCTTATTTTTTCTTTTGCGGAG
3 hTNF-YA-P64K抗原制备：采用双功能偶联剂戊二醛进行偶联。上述重组表达的hTNF-YA和P64K溶解于PBS后，在偶联瓶中混匀，向混合液中缓慢的滴加0.25%戊二醛溶液，于4 oC反应4小时，然后反应液于4 oC对PBS透析，获得化学偶联的hTNF-YA-P64K。
4 收集抗原：使用截断值至少100 kDa（优选300 kDa）的滤膜进行切向流过滤，使得分子量小于100 kDa（优选300 kDa）的物质从所述产品中去除。
5 动物免疫：雌性6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠购自维通利华北京公司，并按照AAALAC指南要求进行饲养。免疫前，以PBS（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，pH 7.4）将hTNF-YK-P64K稀释至0.5 mg/mL，再与氢氧化铝佐剂按体积比1:1进行混合至蛋白终浓度250 μg/mL。30只小鼠，随机分为3组，每组10只，分别用PBS和hTNF-YA-P64K/氢氧化铝免疫接种。接种方法和剂量为：小鼠腋下淋巴结部位选取4个点进行皮下注射，每次每只小鼠200μL。每两周加强免疫一次，在第三次免疫7天后，从各小鼠眼眶取血，室温静置2 h，4000 r/min离心10 min后，弃沉淀并取上部血清-20℃备用。
6 免疫反应检测：用包被缓冲液（50 mmol/L 碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6）将野生型hTNF-α蛋白稀释至浓度为100 ng/100 µL，然后转移到聚苯乙烯96孔板上（每孔加 100 µL）4℃孵育过夜。用PBST（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，0.15%(v:v) Tween-20，pH 7.4）每孔300µL洗板6次，每次5分钟。再加入300 µL含5%（m/v）脱脂奶粉的封闭液（溶于PBST），37℃孵育2小时进行封闭。用PBST（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，0.15%(v:v) Tween-20，pH 7.4）每孔300µL洗板6次，每次5分钟，然后用含5%（m/v）脱脂奶粉的封闭液（溶于PBST）将方法14中收集的抗血清稀释100倍，之后每孔加100 µL，37℃孵育1小时，用PBST（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，0.15%(v:v) Tween-20，pH 7.4）每孔300µL洗板6次，每次5分钟。将二抗（羊抗鼠- IgG-辣根过氧化物酶交联物）用含5%（m/v）脱脂奶粉的封闭液（溶于PBST）稀释8000倍，向每孔加入100μL稀释后的二抗，37℃孵育1小时。用PBST（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，0.15%(v:v) Tween-20，pH 7.4）每孔300µL洗板6次，每次5分钟。每孔加100μL底物溶液TMB（购自碧云天公司生物技术），37℃中放置15min，然后加入25 µL 2 mol/L的H2SO4终止反应。用酶标仪测定OD450nm值。
PBS：0.12、0.12、0.18、0.09、0.14、0.11、0.1、0.09、0.07、0.11
hTNF-YA-P64K：2.15、2.22、2.08、2.14、2.11、1.68、2.4、2.22、2.10、1.88
依据上述OD450nm结果，使用GraphPad Prism 5.0软件作图1。从结果可知，以野生型hTNF-α蛋白作为包被抗原，将各突变蛋白免疫组的小鼠抗血清作为一抗孵育时，hTNF-YA-P64K抗血清中的抗体能识别野生型hTNF-α蛋白，说明该抗原保留了免疫原性。