激活素受体样激酶4在治疗心肌肥厚中的功能及应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种激活素受体样激酶4(ActivinReceptor-likeKinase4，ALK4)在治疗心肌肥厚中的功能和应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物中的应用。
背景技术：
：心肌肥厚是心肌细胞应对神经体液因子刺激及机械应力负荷改变所做出的适应性代偿反应，是一个复杂的而且合并众多因素参与调节的动态过程，同时也是高血压病、瓣膜病、心肌梗死、心肌病等大多数心血管疾病发生发展中所需要共同经历的病理过程[1]。心肌肥厚是心脏对血流动力学负荷、血管紧张素、生长因子以及激素等多种心血管刺激因素所做出的适应性代偿反应，能够使心室壁压力降低，维持甚至能够提高心脏排血量；然而长期的应激将会导致持续性病理性心肌肥大，并伴随有心脏形态和功能上的恶化，表现出炎症、纤维化及异常基因表达等变化。持续的心肌肥厚能导致扩张型心肌病、心力衰竭甚至猝死，因此心肌肥厚明显增加了心力衰竭的发病率和病死率，已经成为了心力衰竭等心血管疾病的独立危险因素及不良预后的信号[2]。近几十年来，随着我国人民生活水平的提高，饮食习惯随之改变，高血压、冠心病等常见心血管疾病的发病率不断提高，心肌肥厚继而导致的室性心律失常、心源性猝死、心肌缺血及心力衰竭等心血管事件的发生率正在逐年上升，较之前提高了6-10倍[3-5]。近年来，全世界众多学者对心肌肥厚的发生发展机制开展了大量研究，发现了一些参与心肌肥厚病理生理过程的关键基因及重要信号传导通路，并且对其中的可干预因素进行了深入研究[6-8]。然而，心肌肥厚的发生发展机制至今仍未完全明确，现有的研究及发现在临床实践中仍具有一定的局限性，尚不能形成真正有效的针对心肌肥厚的防治措施。因此，发现参与心肌肥厚的特异性分子及信号传导通路，对进一步系统阐明心肌肥厚发生发展机制，从细胞分子水平对心肌肥厚进行调控，探索新的防止心肌肥厚的治疗靶点，具有非常重要的理论和实践意义。激活素受体样激酶4(ActivinReceptor-likeKinase4，ALK4)是TGFβ超家族七个Ⅰ型受体成员之一。1993年，ALK4受体被克隆，并且发现ALK4在身体各组织器官广泛表达，主要功能是作为activin的I型受体[9]。Gu等[10]发现敲除小鼠ALK4基因后由于不能形成原肠，将导致胚胎致死，这一结果表明ALK4在胚胎发育中有重要作用。ActivinA通过与ALK4相互作用并使SMAD2发生磷酸化直接调节NKX2-1基因的启动子并激活其表达，显示ALK4在呼吸系统内胚层分化中有重要作用[11]。另有研究表明，ALK4与肿瘤的关系十分密切。在小鼠B细胞杂交瘤细胞和HepG2细胞中过表达的ALK4有助于activinA的抑制细胞增殖和促进细胞凋亡[12,13]，而SiragamV.等研究发现miR-98可通过靶向作用于ALK4和MMP-11抑制肿瘤血管生成和侵袭[14]。但目前为止，尚未见ALK4在心血管疾病，尤其是心肌肥厚中作用的相关报道。参考文献1.HeinekeJ,MolkentinJD.Regulationofcardiachypertrophybyintracellularsignallingpathways.NatRevMolCellBiol.2006；7(8):589-600.2.HillJA,OlsonEN.Cardiacplasticity.NEnglJMed.2008；358(13):1370-1380.3.ZileMR,GottdienerJS,HetzelSJ,McMurrayJJ,KomajdaM,McKelvieR,BaicuCF,MassieBM,CarsonPE.Prevalenceandsignificanceofalterationsincardiacstructureandfunctioninpatientswithheartfailureandapreservedejectionfraction.Circulation.2011；124(23):2491-2501.4.MuddJO,KassDA.Tacklingheartfailureinthetwenty-firstcentury.Nature.2008；451(7181):919-928.5.vanBerloJH,MailletM,MolkentinJD.Signalingeffectorsunderlyingpathologicgrowthandremodelingoftheheart.JClinInvest.2013；123(1):37-45.6.MailletM,vanBerloJH,MolkentinJD.Molecularbasisofphysiologicalheartgrowth:fundamentalconceptsandnewplayers.NatRevMolCellBiol.2013；14(1):38-48.7.ShahAM,MannDL.Insearchofnewtherapeutictargetsandstrategiesforheartfailure:recentadvancesinbasicscience.Lancet.2011；378(9792):704-712.8.SongK,NamYJ,LuoX,QiX,TanW,HuangGN,AcharyaA,SmithCL,TallquistMD,NeilsonEG,HillJA,Bassel-DubyR,OlsonEN.Heartrepairbyreprogrammingnon-myocyteswithcardiactranscriptionfactors.Nature.2012；485(7400):599-604.9.P.tenDijke,H.Ichijo,P.Franzen,etal.Activinreceptor-likekinases:anovelsubclassofcell-surfacereceptorswithpredictedserine/threoninekinaseactivity.Oncogene,1993,8(10):2879-2887.10.Z.Gu,M.Nomura,B.B.Simpson,etal.ThetypeIactivinreceptorActRIBisrequiredforeggcylinderorganizationandgastrulationinthemouse.GenesDev,1998,12(6):844-857.11.Y.Li,K.Eggermont,V.Vanslembrouck,etal.NKX2-1activationbySMAD2signalingafterdefinitiveendodermdifferentiationinhumanembryonicstemcell.StemCellsDev,2013,22(9):1433-1442.12.O.Hashimoto,K.Yamato,T.Koseki,etal.TheroleofactivintypeIreceptorsinactivinA-inducedgrowtharrestandapoptosisinmouseB-cellhybridomacells.CellSignal,1998,10(10):743-749.13.W.Chen,T.K.Woodruff,K.E.Mayo.ActivinA-inducedHepG2livercellapoptosis:involvementofactivinreceptorsandsmadproteins.Endocrinology,2000,141(3):1263-1272.14.V.Siragam,Z.J.Rutnam,W.Yang,etal.MicroRNAmiR-98inhibitstumorangiogenesisandinvasionbytargetingactivinreceptor-likekinase-4andmatrixmetalloproteinase-11.Oncotarget,2012,3(11):1370-1385.技术实现要素：为解决临床防治心肌肥厚疾病现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是确定ALK4基因的表达与心肌肥厚疾病之间的相互关系。提供一个用于治疗心肌肥厚疾病的靶基因ALK4的新用途，进而把ALK4基因应用于心肌肥厚疾病的治疗。本发明的目的通过下述技术方案实现：1、ALK4干扰(AdshALK4)及过表达(AdALK4)腺病毒对经AngII诱导的心肌细胞肥大模型的影响本发明通过重组腺病毒构建AdshALK4及AdALK4感染SD乳鼠原代心肌细胞，予以AngII刺激构建心肌细胞肥大模型，对照组则予以PBS，经免疫荧光监测及心肌细胞表明面积统计表明，在AngII刺激下ALK4干扰病毒明显促进心肌细胞肥大，心肌细胞表面积增大；ALK4过表达病毒显著抑制心肌细胞肥大，心肌细胞表面积减小。2、ALK4基因敲除显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能本发明选用心脏特异性Cre小鼠(α-MHC-Cre(命名WT)、心脏特异性ALK4基因敲除小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究ALK4基因敲除对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除ALK4基因所致的ALK4缺陷显著恶化心肌肥厚、纤维化及心功能。3、ALK4基因过表达显著抑制了心肌肥厚及其纤维化，改善心功能本发明选用心脏特异性ALK4转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究ALK4基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明过表达ALK4基因显著抑制心肌肥厚及纤维化，保护心功能。本发明人的研究证明了：在主动脉缩窄术造成心肌肥厚模型中，ALK4具有抑制心肌肥厚及其纤维化，改善心功能的作用。一种ALK4基因在心肌肥厚疾病中的功能，主要体现在ALK4抑制心肌肥厚及其纤维化，改善心功能。针对ALK4的上述功能，提供一种ALK4的应用，主要体现为ALK4在保护心脏、抗心脏纤维化和治疗心肌肥厚中的应用，特别是ALK4在筛选或制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。所述的应用包括：(1)ALK4直接作为保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物的有效成分。(2)利用基因工程技术，构建能表达ALK4基因的病毒载体。(3)ALK4基因作为药物靶标筛选能够促进其表达的化学物质，间接发挥保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚作用。一种保护心脏功能的药物，包含ALK4。一种抗心脏纤维化的药物，包含ALK4。一种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物，包含ALK4。一种基因药物，包含能表达ALK4基因的病毒载体，优选为腺病毒载体。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明发现ALK4基因的新功能，即ALK4基因具有抑制心肌肥厚及其纤维化，改善心功能的作用。(2)基于ALK4抑制心肌肥厚疾病发生的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物。附图说明图1是SD乳鼠原代心肌细胞用腺病毒AdshRNA、AdshALK4、AdGFP和AdALK4感染，经AngⅡ刺激后的免疫荧光图，结果表明ALK4的干扰腺病毒促进心肌细胞肥大，ALK4的过表达腺病毒抑制心肌细胞肥大(*：p＜0.05vsAdshRNA/AdGFP组，#：p＜0.05vsAdshRNA/AdGFPAngⅡ组)。图2是心脏特异性ALK4基因敲除小鼠及转基因小鼠构建策略图，其中A为ALK4基因敲除小鼠策略图，B为ALK4转基因小鼠策略图。图3是WT和ALK4-KO小鼠AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图，结果显示ALK4敲除升高HW/BW、LW/BW及HW/TL(*：p＜0.05vsWTSham组，#：p＜0.05vsWTAB组)。图4是WT和ALK4-KO小鼠AB模型4周后心脏组织HE染色、WGA染色及心肌细胞横截面积统计柱状图，结果显示ALK4敲除促进心肌细胞肥大(*：p＜0.05vsWTSham组，#：p＜0.05vsWTAB组)。图5是WT和ALK4-KO小鼠AB模型4周后心脏组织天狼星红染色图，结果显示ALK4敲除促进心脏的纤维化(*：p＜0.05vsWTSham组，#：p＜0.05vsWTAB组)。图6是NTG和TG小鼠AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图，结果显示ALK4过表达HW/BW、LW/BW及HW/TL降低(*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组)。图7是NTG和TG小鼠AB模型4周后心脏组织HE染色、WGA染色及心肌细胞横截面积统计柱状图，结果显示ALK4过表达会抑制心肌细胞肥大(*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组)。图8是NTG和TG小鼠AB模型4周后心脏组织天狼星红染色图，结果显示ALK4过表达会抑制心脏的纤维化(*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组)。图9是WT和ALK4-KO小鼠AB模型4周后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示ALK4敲除显著恶化心功能；其中，LVEDd为左室舒张末期内径、LVESd为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率(*：p＜0.05vsWTSham组，#：p＜0.05vsWTAB组)。图10是NTG和TG小鼠AB模型4周后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示ALK4过表达显著保护心功能；其中，LVEDd为左室舒张末期内径、LVESd为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率(*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组)。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实验用动物及饲养实验动物：选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，雄性，心脏特异性Cre小鼠(α-MHC-Cre(命名WT)，背景为C57BL/6，购自JacksonLaboratory，货号005650)、心脏特异性ALK4基因敲除小鼠(ALK4-KO)、心脏特异性ALK4转基因小鼠(TG)及非转基因小鼠(NTG，同龄同窝对照非转基因小鼠)为实验对象。饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级实验动物中心。SRF级小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。【实施例1】ALK4干扰(AdshALK4)及过表达(AdALK4)腺病毒对AngII刺激的原代心肌细胞肥大的影响1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部以下75％酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mLDMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。(2)用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1-2mm3的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。(3)加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用20％小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。(4)将收集好的心肌细胞悬液，以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。(5)将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu(终浓度0.1mM)，混匀之后，加入到用0.1％明胶包被的器皿中。(6)轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5％CO2孵育48小时用PBS清洗1次，更换培养基。2.ALK4干扰(AdshALK4)及过表达(AdALK4)腺病毒对经AngII诱导的心肌细胞肥大模型的影响AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作对照)、AdshALK4(含shRNA-ALK4(沉默RNA-ALK4融合蛋白)的腺病毒)、AdGFP(含GFP(绿色荧光蛋白)的腺病毒，用作对照)及AdALK4(含GFP-ALK4(绿色荧光蛋白-ALK4融合蛋白)的腺病毒)2.1重组腺病毒构建从美国InvivoGen公司购得ALK4的表达载体，应用腺病毒表达系统AdenoVec构建重组AdGFP、AdALK4；从美国SuperArray公司购得shRNA，shALK4载体，然后应用腺病毒表达系统AdenoVec构建重组AdshRNA、AdshALK4。2.2重组腺病毒的鉴定取病毒粗提液加入裂解液，经混匀、离心后取上清液作为模板进行PCR扩增，产物通过凝胶电泳鉴定。2.3.重组腺病毒的扩增：转染前接种HEK293细胞，待细胞达到50-70％汇合时换液，加入含有重组腺病毒载体的新鲜培养液，培养90分钟后再填加新鲜培养液，培养至大约有50％的细胞从培养板上脱落时，收集细胞悬液。反复冻融以制备病毒粗提液，通过CsCl密度梯度超速离心法纯化病毒液。2.4.重组腺病毒滴度测定：在96孔板中接种HEK293细胞，24小时后加入倍比稀释的病毒液，1-10列加入稀释的病毒液，每个浓度8个重复孔，11-12列加入无病毒完全培养液，培养10天后在显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，计算每个浓度的阳性率。病毒滴度采用Spearman-KarberMethod计算：滴度(pfu/ml)＝10(x+0.8)，x＝各浓度阳性率总和。前提条件：阴性对照无CPE和生长抑制现象；最小稀释浓度组均有CPE；最大稀释浓度组均无CPE。2.5.重组腺病毒作用的鉴定：用2×108pfu/virus浓度的AdALK4和AdGFP及AdshALK4和AdshRNA感染6孔培养板中培养心肌细胞(约80％汇合度)，24小时后收集细胞，加入蛋白裂解液裂解50分钟后收集上清，取50μg样品经10％SDS-PAGE电泳分离后，用ALK4特异性抗体做WesternBlot分析。根据ALK4蛋白的表达，确定腺病毒AdALK4和AdGFP及AdshALK4和AdshRNA是否能发挥预期作用。腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12小时后用1μM血管紧张素II(AngII)(购自Sigma公司，A9525)或对照PBS刺激48小时，然后进行免疫荧光试验。结果表明，AdshALK4腺病毒感染后的心肌细胞表面面积较AdshRNA对照组增加，而经AdALK4腺病毒感染的心肌细胞表面面积则比对照组AdGFP明显降低(图1)。即ALK4的干扰腺病毒促进心肌细胞肥大，ALK4的过表达腺病毒抑制心肌细胞肥大。【实施例2】心脏特异性ALK4基因敲除小鼠以及ALK4转基因小鼠的构建：(1)心脏特异性ALK4基因敲除小鼠的构建(构建策略见图2A)：根据基因信息，利用CRISPRDesign(网址：http://crispr.mit.edu/)分别在内含子1和2中各设计一个CRISPR的打靶位点。靶序列分别为：ALK4-sgRNA1：ggTCCATCCAAATGGGTCCTGCTGGALK4-sgRNA2：ggCTCAGGGCATGAAGCGTTTTTGG此外还设计了一个用于同源修复的供体质粒(DonorVector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子2和3以及两个同向的loxp序列。①打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。②条件性敲除骨架载体pBluescriptSK(+)-2loxp的构建：分别合成4条寡聚单链核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2两条双链。将pBluescriptIISK(+)载体用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)双酶切后连接入loxp1退火双链，再将测序正确的载体用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)双酶切，连接入loxp2退火双链，得到条件性敲除骨架载体，命名为pBluescriptSK(+)-2loxp。③供体载体的构建：根据引物设计原则，设计如下引物(表1)用于扩增供体载体的左右同源臂(LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。扩增得到的产物经表1中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到供体载体。表1构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点引物名称引物序列酶切位点ALK4LA-FCCGCTCGAGCTACCTGCCTGCCTCACAGTXhoIALK4LA-RATGGACGTCTGCTGGGTGGACGGAGTCTAatIIALK4M-FTCTACCGGTGGACCCATTTGGATGGAGTAGAgeIALK4M-RCCGGAATTCTTTTGGTGAGGCCATCATCGTEcoRIALK4RA-FCGACGCGTACGCTTCATGCCCTGAGATMluIALK4RA-RATAAGAATGCGGCCGCCGGGGAAACAAAGTCACACNotI④打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分(负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA)分别进行转录。对于Cas9蛋白，将其表达载体(pST1374-Cas9)用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGEmMACHINE试剂盒(AM1345，Ambion)进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒(Ambion)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)进行纯化。⑤ALK4-floxed条件性敲除小鼠的制作将上述成熟的mRNA产物与供体质粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得ALK4-floxed纯合小鼠。⑥心脏特异性ALK4基因敲除小鼠的制作将上述ALK4-floxed小鼠与心脏特异性α-MHC-Cre(购自JacksonLaboratory，货号005650)转基因小鼠交配，筛选得到ALK4floxed/floxed/α-MHC-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到心脏细胞特异性ALK4基因敲除小鼠。(2)心脏特异性ALK4转基因小鼠的构建(构建策略见图2B)：转基因载体构建信息：用上游引物，即5’-AGCTTTGTTTAAACGCCACCATGGCGGAGTCGGCCGGAGCCTCCTCCTTCTTC-3’；下游引物，5’-CTAGCTAGCTTAAATCTTCACATCTTCCTGCACGC-3’，扩增小鼠ALK4全长基因(NCBI，GeneID：11479，CCDS27846.1)，把cDNA插入pCAG-CAT-LacZ载体，这个载体包含一个CMV增强子和一个鸡的β-actin基因(CAG，chickenβ-actingene)的启动子，并且连接到氯霉素乙酰转移酶基因(CAT，chloramphenicolacetyltransferase)，loxP位点位于CAT两侧。ALK4的表达由CAG启动子驱动得到。将构建的pCAG-CAT-ALK4-polyA载体通过显微注射构造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到ALK4-floxed转基因小鼠。心脏特异性ALK4转基因小鼠由ALK4-floxed转基因小鼠和α-MHC-Cre(购自JacksonLaboratory，货号005650)小鼠杂交繁殖得到。【实施例3】心肌肥厚模型获得1.实验动物分组：雄性背景C57BL/6心脏特异性Cre小鼠(α-MHC-Cre(WT)、心脏特异性ALK4基因敲除小鼠(ALK4-KO)及心脏特异性ALK4转基因小鼠(TG)和非转基因小鼠(NTG)，通过主动脉缩窄术(AB)建立心肌肥厚模型。随机分为8组，分组如下：C57BL/6背景野生型小鼠假手术组(WTSham)及AB术组(WTAB)、ALK4基因敲除小鼠假手术组(ALK4-KOSham)及AB术组(ALK4-KOAB)、非转基因小鼠假手术组(NTGSham)及AB术组(NTGAB)、心脏特异性ALK4转基因小鼠假手术组(TGSham)及AB术组(TGAB)。2.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄(AB)手术，模型操作流程：2.1术前准备(1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药(3％戊巴比妥钠)量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间)。(2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。(3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。2.2主动脉弓降支结扎术取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75％酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。假手术组(Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚模型组。2.3术后护理主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。ALK4基因敲除小鼠及野生型小鼠术后4周、非转基因小鼠及心脏特异性ALK4转基因小鼠术后4周分别进行各项指标的检测。【实施例4】小鼠心肌肥厚模型心肌肥厚及纤维化检测1.取材(1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10％甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10％KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。(2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10％KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。(3)相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值(HW/BW)，肺重与体重的比值(LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值(HW/TL)。2.病理学检测2.1制备石蜡标本切片主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。2.2苏木精-伊红(HE)染色主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL70％酒精充分混合均匀)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水)1min→水洗1min→伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-ProPlus6.0软件圈细胞面积。2.3麦胚凝集素染色(WGA染色)主要步骤为：将石蜡切片置于烘箱烘烤60min→二甲苯脱蜡5min，3次→100％乙醇5min，2次→95％乙醇5min→70％乙醇5min→双蒸水浸洗5min，2次→PBS洗5min，2次→甩尽玻片上水分，用免疫组化笔在组织周围画圈→50μg/mlWGA-FITC，湿盒内孵育30min→PBS洗5min，3次→DAPI复染8min→使用水溶性封片剂封片，置于4℃冰箱内避光保存。于荧光显微镜400倍下拍照，并使用ImageProPlus6.0软件测算圆形或近似圆形的左室单个心肌细胞横截面积。要求统计每组不少于5只小鼠，每只小鼠不少于100个细胞。2.4天狼星红(PSR)染色主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2％磷钼酸2min→0.1％天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。WT和ALK4-KO小鼠AB模型后的表型结果见图3、图4、图5。Sham(假手术)组中WT小鼠和ALK4-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；WT小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，ALK4-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较WT小鼠升高(图3)。HE及WGA染色切片可观察到：Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，ALK4-KO小鼠的心脏明显大于WT组小鼠；Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，ALK4-KO组则比WT组细胞肥大明显，差异有统计学意义(图4)。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；AB术后ALK4-KO小鼠心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量大于WT组小鼠(图5)。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚及纤维化，ALK4-KO小鼠的心肌肥厚及纤维化程度明显大于WT小鼠。图6、图7、图8是NTG和ALK4-TG小鼠AB模型后的表型结果。同样NTG小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠(图6)。AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠。HE及WGA染色切片可观察到：TG小鼠AB术后心肌细胞横截面积大于Sham组，显著小于NTG小鼠AB组(图7)。PSR染色可见，TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量均小于NTG小鼠AB组(图8)。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚及纤维化，ALK4-TG小鼠的心肌肥厚及纤维化程度小于NTG小鼠。【实施例4】心肌肥厚模型小鼠超声检测心功能1前期准备(1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。(2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0％异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。2心功能检测小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司)。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、短轴缩短率(FS)。本实施例运用M型超声心动图检测评价心肌肥厚和心功能。图9是WT和ALK4-KO小鼠AB模型后心功能检测结果图。与WTSham组相比，WT小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVEDd、LVESd均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，ALK4-KO小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度比WT小鼠明显。说明ALK4-KO小鼠的心功能更显著恶化、心肌肥厚程度更严重，这些结果均与ALK4-KO小鼠心肌肥厚更为显著的结果一致。图10是NTG和ALK4-TG小鼠AB模型后的超声检测结果。与NTGSham组相比，NTG小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标LVEDd、LVESd增大，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度则明显小于NTG组。这些结果与TG小鼠心肌肥厚被抑制的结果一致。由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，ALK4基因缺陷显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，ALK4基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此ALK4基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是ALK4基因能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>武汉大学<120>激活素受体样激酶4在治疗心肌肥厚中的功能及应用<160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>ALK4-sgRNA1<400>1ggtccatccaaatgggtcctgctgg25<210>2<211>25<212>DNA<213>ALK4-sgRNA2<400>2ggctcagggcatgaagcgtttttgg25<210>3<211>54<212>DNA<213>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>loxp1-R<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>29<212>DNA<213>ALK4LA-F<400>7ccgctcgagctacctgcctgcctcacagt29<210>8<211>28<212>DNA<213>ALK4LA-R<400>8atggacgtctgctgggtggacggagtct28<210>9<211>30<212>DNA<213>ALK4M-F<400>9tctaccggtggacccatttggatggagtag30<210>10<211>30<212>DNA<213>ALK4M-R<400>10ccggaattcttttggtgaggccatcatcgt30<210>11<211>27<212>DNA<213>ALK4RA-F<400>11cgacgcgtacgcttcatgccctgagat27<210>12<211>35<212>DNA<213>ALK4RA-R<400>12ataagaatgcggccgccggggaaacaaagtcacac35<210>13<211>53<212>DNA<213>扩增小鼠ALK4全长基因上游引物<400>13agctttgtttaaacgccaccatggcggagtcggccggagcctcctccttcttc53<210>14<211>35<212>DNA<213>扩增小鼠ALK4全长基因下游基因引物<400>14ctagctagcttaaatcttcacatcttcctgcacgc35当前第1页1 2 3