MIIP作为前列腺癌的调控分子和药物靶点的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及前列腺癌调控分子及其应用。

背景技术：

前列腺癌(prostatecancer，PCa)是男性最为常见的恶性肿瘤，在欧美国家，位居男性肿瘤发病率第一位和死亡率第二位。近年来，随着人口老龄化和诊断技术的提高，我国前列腺癌的发病率亦呈逐年上升趋势。最新统计数据显示中国人群发病率为4.3/10万，且大约5％患者首次诊断时已经出现了远处转移。PCa发病机制至今仍不完全清楚，研究表明86-98％的PCa属于激素依赖性肿瘤。

雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy，ADT)是治疗首发PCa的主要方法，但大多数PCa病人尤其是发生转移的Gleason分值高的PCa，都会进展成转移性去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)。转移性CRPC是PCa进展的最终阶段，在现有的医疗条件下，生存时间一般小于2年，是导致PCa病人死亡的首要原因。因此阐明CRPC进展的分子机制，发现有效的信号分子治疗靶点，已成为当前的研究热点。

CRPC进展的分子机制十分复杂，已有的研究揭示AR信号通路的紊乱是导致CRPC发病的主要原因。瘤内的雄激素合成、AR受体的表达上调、突变和剪切变异体，都会导致AR信号通路的敏感性增加和异常激活，导致CRPC的发生。目前基于AR信号调控通路的药物阿比特龙(Abiraterone)和恩扎鲁胺(Enzalutamide)已用于临床CRPC的治疗，二者虽能缓解CRPC的病情进展，延长病人生存时间，但并不能最终阻止CRPC的进展。说明CRPC的进展受到更多更复杂的分子调控，只有找到关键的调控分子作为治疗靶点，才能从根本上治疗CRPC。

MIIP(migration and invasion inhibitory protein)是2003年科研人员在胶质瘤研究中利用酵母双杂交发现的与IGFBP2(insulin-like growth factor binding protein 2)相互作用的一个蛋白，由于其分子量约为45kDa，又称为IIp45(invasion inhibitory protein45)。MIIP基因位于染色体1p36.2区域，全长12595bp，共含10个外显子，其编码产生的mRNA为2024bp，蛋白含388个氨基酸残基，在人体内各组织广泛表达。对全长MIIP蛋白结构分析发现其含有3个SEG(segments of low compositional complexity)域和一个RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽)模体；另有42个丝氨酸、6个苏氨酸及1个潜在的苏氨酸磷酸化位点。

关于MIIP的功能研究充分显示，MIIP基因是一个新的抑癌基因，依据如下：①MIIP基因所在的染色体区域1p36.2在多种类型肿瘤中缺失，包括胶质瘤、乳腺癌等。②在胶质瘤和肺癌组织中，MIIP表达明显低于正常组织，且其表达水平与肺癌的病理分期和预后负相关。目前认为MIIP的作用机制包括：A.MIIP结合并拮抗IGFBP-2的作用，抑制细胞迁移侵袭；B.结合并促进HDAC6降解，使后者去乙酰化酶活性受抑，从而影响微管形成、抑制细胞迁移；C.通过与Cdc20直接结合而阻断Cyclin B1的降解，使细胞停滞在有丝分裂的中期，从而抑制细胞周期进程和细胞增殖。

但目前关于MIIP在前列腺癌中的表达状态及其作用尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供MIIP作为前列腺癌的调控分子和药物靶点的应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

迁徙和浸润抑制蛋白MIIP在制备前列腺癌抗肿瘤药物中的应用。

所述抗肿瘤药物选自包含MIIP过表达载体的基因治疗药物。

迁徙和浸润抑制蛋白MIIP的激动剂在制备前列腺癌抗肿瘤药物中的应用。

迁徙和浸润抑制蛋白MIIP作为前列腺癌分子诊断标志物的应用。

迁徙和浸润抑制蛋白MIIP作为前列腺癌进展调控分子的激动剂或抑制剂的应用。

以迁徙和浸润抑制蛋白MIIP作为靶分子筛选前列腺癌治疗药物的应用。

以迁徙和浸润抑制蛋白MIIP作为检测指标评价前列腺癌治疗药物的应用。

以迁徙和浸润抑制蛋白MIIP作为靶分子筛选前列腺癌分子诊断标志物的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过实验首次发现MIIP在前列腺癌中表达降低，并且与CRPC进展相关，揭示了MIIP可以作为一种新的前列腺癌调控因子，不仅为前列腺癌的发病机制提供新的理论依据。更为重要的是，可以为前列腺癌药物研制提供新的途径，用MIIP作为靶分子筛选新的前列腺癌的治疗药物，同时也可以用MIIP作为检测指标评价前列腺癌的治疗药物。

附图说明

图1为部分前列腺癌患者(Patients)癌组织与癌旁组织中MIIP表达水平比较；其中：ANT(adjacent non-cancerous tissues)：癌旁组织，CT(cancerous tissues)：前列腺癌组织。

图2为MIIP对CRPC细胞恶性表型的影响；其中：A.免疫印迹检测的MIIP过表达质粒或小干扰核糖核酸(siRNA)转染后MIIP表达水平；B.MIIP表达调控对细胞生长的影响；C.MIIP表达调控对细胞克隆形成的影响；D.MIIP表达调控对细胞侵袭能力的影响。

图3为MIIP稳定敲减对小鼠成瘤恶性表型的影响；其中：A.瘤体体积比较结果；B.肿瘤生长速度比较；C.前列腺癌荷瘤鼠模型肿瘤组织中细胞增殖比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明公开了迁徙和浸润抑制蛋白MIIP在前列腺癌中的调控机制和作为药物靶点的应用。

本发明通过以下实验：(1)在前列腺癌人群样本中检测MIIP；(2)MIIP过表达和MIIP shRNA敲减载体的构建，MIIP cDNA和MIIP shRNA的慢病毒包装，MIIP稳定过表达和MIIP shRNA稳定敲减前列腺癌细胞株的建立，前列腺癌细胞生物学行为检测；(3)MIIP shRNA稳定敲减前列腺癌荷瘤鼠模型构建，荷瘤鼠肿瘤生长以及瘤组织细胞增殖的检测。结果发现，在部分前列腺癌患者中，MIIP在癌组织中的表达较癌旁组织明显降低；细胞水平研究证实在CRPC细胞系PC-3、DU-145、C4-2中分别过表达MIIP，可显著的抑制细胞生长、克隆形成和侵袭能力；同时在PC-3和DU-145中采用siRNA敲减MIIP，则显著增强细胞生长、克隆形成和侵袭能力。这些结果表明MIIP可明显抑制CRPC的恶性表型。动物水平研究发现，注射MIIP稳定敲减的CRPC细胞系(PC-3-shMIIP和DU-145-shMIIP)行裸鼠成瘤实验，与正常组相比，实验组呈现肿瘤生长速度增加、侵袭性增强等恶性表型。因此，本发明指出，MIIP在前列腺发生进展过程中，尤其在CRPC恶性演化过程中发挥极其重要的作用，为前列腺癌提供了新的发病机制理论依据和治疗靶点。

本发明中除非另外说明，将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学和重组DNA技术。这些技术在文献中有完整的解释。参见，A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers,Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:a Laboratory Manual),第二版，1989。

(1)免疫印迹(Western Blot,WB)检测前列腺癌病人癌组织中MIIP蛋白的表达水平。

病人组织标本来自西京医院泌尿外科，采用强RIPA裂解液(碧云天)裂解细胞，裂解前加入蛋白酶抑制剂PMSF和Cocktail(Sigma)。所有操作冰上进行，超声破碎8秒，提取的蛋白于-80℃保存，蛋白分装防止反复冻融。跑胶前加入上样缓冲液，混匀，直接上样。10％SDS PAGE胶分离MIIP蛋白，分子量大小约42.8kD。以GAPDH(Sigma)作为内参。具体实验结果见图1，可见MIIP在前列腺癌组织中的表达较癌旁组织明显降低。

(2)构建MIIP shRNA稳定敲减和MIIP过表达前列腺癌细胞株，检测MIIP对前列腺癌细胞恶性表型的影响

1)MIIP shRNA和MIIP过表达载体构建和慢病毒包装

首先从上海吉凯化学技术有限公司订购MIIP siRNA，参照前期实验中应用并证实有效的siRNA序列，选择其中2对针对MIIP的RNAi靶序列(siRNA1、siRNA2)，合成正向与反向寡核苷酸；退火以后形成寡核苷酸双链，经过酶切、连接克隆入pLKO.1-TRC载体(购自Addgene公司,货号:10878)，构建为pLKO.1-MIIP shRNA(酶切位点：AgeⅠ，EcoRⅠ)，该重组质粒与包装质粒psPAX2和pMD2.G(Addgene)共转染入细胞293T(购自：中科院细胞库，目录号：GNHu17)进行病毒包装，产生pLKO.1-sh MIIP病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。收集含有pLKO.1-sh MIIP病毒颗粒的上清液，-80℃保存，可直接用于细胞感染。

MIIP过表达系统采用Thermo Scientific公司的pLEX-MCS慢病毒包装系统。采用PCR技术和分子克隆技术购建pLEX-MCS-MIIP过表达载体(酶切位点：SpeⅠ,XhoⅠ)。扩增重组质粒，分别与另2种辅助/包装质粒混合物(TLP4616/TLP4617，Thermo Scientific)共转染293T细胞，进行病毒包装，产生pLEX-MCS-MIIP病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。收集含有pLEX-MCS-MIIP病毒颗粒的上清液，-80℃保存，可直接用于细胞感染。

2)MIIP shRNA和MIIP过表达稳定细胞株的建立

①细胞培养

本实验选用细胞包括激素非依赖性/CRPC细胞系(C4-2、DU-145、PC3)以及人胚肾细胞(293T细胞)，常规培养。其中C4-2是LNCaP(来源于PCa患者淋巴结转移灶)移植于瘤鼠并经去势筛选而获得，为AR阳性；DU-145和PC3分别来源于CRPC患者的脑和骨转移灶，均为AR阴性。细胞系DU-145、PC3和293T均购自中科院细胞库(目录号：TCHu222、SCSP-532和GNHu17)，C4-2源自第四军医大学西京医院泌尿外科。(参考文献：[1]Murphy G,editor.Models for prostate cancer.37.New York:Liss；1980,pp.115-132.[2]Gibas Z,et al.A high-resolution study of chromosome changes in a human prostatic carcinoma cell line(LNCaP).Cancer Genet.Cytogenet.11:399-404,1984.[3]Papsidero LD,et al.Prostate antigen:a marker for human prostate epithelial cells.J.Natl.Cancer Inst.66:37-42,1981.[4]Stone KR,et al.Isolation of a human prostate carcinoma cell line(DU 145).Int.J.Cancer 21:274-281,1978.[5]Kaighn ME,et al.Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line(PC-3).Invest.Urol.17:16-23,1979.[6]Chen TR.Chromosome identity of human prostate cancer cell lines,PC-3 and PPC-1.Cytogenet.Cell Genet.62:183-184,1993.[7]El Etreby MF,et,al,Antitumor activity of mifepristone in the human LNCaP,LNCaP-C4,and LNCaP-C4-2 prostate cancer models in nude mice.Prostate.2000 Feb 1；42(2):99-106.[8]Xie BX,et,al.The radiation response of androgen-refractory prostate cancer cell line C4-2 derived from androgen-sensitive cell line LNCaP.Asian J Androl.2010 May；12(3):405-14.doi:10.1038/aja.2009.91.)

②药物浓度的筛选

转染后细胞筛选用的药物主要有博莱霉素和嘌呤霉素。建立稳定细胞系之前，需要确定能够在7-10天杀死细胞的最佳药物浓度。方法如下：在24孔板中接种细胞，细胞密度达到50％-70％融合时，将药物按照递增的浓度，加至培养孔内。观察细胞死亡情况，隔一天换液，确定杀伤细胞的最佳浓度用于后续筛选稳定细胞株。

③病毒感染与稳定细胞株的建立

分别在CRPC细胞系C4-2、DU-145和PC3中过表达或敲减MIIP：细胞培养过夜，达到约70％汇合时用于病毒转染。取已制备好的包含pLEX-MCS-MIIP或pLKO.1-shMIIP的病毒上清液，以1:1体积比加入正在培养的处于对数生长期的细胞，24小时后加入最优浓度药物筛选，建立MIIP过表达的稳定细胞系(MIIP组)和MIIP敲减的稳定细胞系(MIIP siRNA1组、MIIP siRNA2组)；同时以pLEX-MCS(Vector)或pLKO.1-scramble shRNA(NC)感染和筛选的细胞作为相应的对照组，参见图2A。

(3)前列腺癌细胞生物学行为检测

1)MTT法检测细胞生长

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度加入96孔板(2×10³/孔)，5％CO₂、37℃孵育细胞24h，每孔加入20μL新配制的MTT(0.5mg/mL)，37℃继续孵育4h，弃MTT液，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm处测量各孔的吸光值。每组设6个重复，连续测5-7天，绘制细胞生长曲线，参见图2B，可以看出，过表达MIIP抑制细胞生长，而敲减MIIP促进细胞生长。

2)克隆形成实验

取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，将细胞悬浮在培养液中备用。将细胞悬液作梯度倍数稀释，取100-200细胞数均匀接种于60mm培养皿。置37℃、5％CO₂静置培养2-3周，出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加甲醇固定15min，适量Giemsa应用染色液染10-30min，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，肉眼计数克隆数或计算克隆形成率，参见图2C，可以看出，过表达MIIP抑制细胞克隆形成，而敲减MIIP促进细胞克隆形成。

3)Transwell检测细胞迁移和侵袭能力

将Matrigel与无血清的DMEM培养液以1:6混合，铺于Transwell小室中，37℃孵箱放置2h，使其凝固；各组细胞以胰酶消化，细胞计数，制备2×10⁴/mL单细胞悬液，每个Transwell小室接种100μL；24孔板中加入含有血清的DMEM新鲜培养液，将Transwell小室放入24孔板中，37℃孵箱继续培养24h；擦除上层未穿膜的细胞及Matrigel，乙醇固定，Giemsa染色，倒置显微镜下随机选取10个视野并计数，取均值，参见图2D，可以看出，过表达MIIP抑制细胞侵袭。

根据以上实验，可以得出，在CRPC细胞系中分别过表达MIIP，发现MIIP可显著抑制癌细胞的生长、克隆形成和侵袭能力；而采用siRNA敲减MIIP，则促进细胞生长、克隆形成和侵袭能力。这些结果表明了MIIP对前列腺癌细胞增殖、迁徙和浸润过程的调控作用，通过对MIIP的表达调控可明显抑制CRPC的恶性表型。

(4)前列腺癌荷瘤鼠模型中验证MIIP的在体功能

1)前列腺癌荷瘤鼠模型建立

选取5-7周龄，体重18-22g的雄性裸鼠为实验对象(10只/组)，于皮下接种MIIP稳定敲减的CRPC细胞系(PC-3-shMIIP和DU-145-shMIIP)，建立前列腺癌荷瘤鼠模型。具体如下：将上述MIIP稳定敲减的CRPC细胞以1×10⁷接种于裸鼠后肢近端皮下。

2)荷瘤鼠肿瘤生长以及标本采集

a)肿瘤生长曲线

每日常规监测荷瘤鼠的饮食、行为表现和肿瘤形成情况。隔日用卡钳测量肿瘤的大小以监测其体积V变化，V＝d×D²×0.5(d:肿瘤的长径,D:肿瘤的短径)。5周后处死小鼠，取瘤组织称重，并根据测量结果绘制出肿瘤生长曲线，不同组别之间进行t检验统计分析。参见图3A、B，可以看出，MIIP shRNA稳定敲减前列腺癌荷瘤鼠模型(shRNA1组由siRNA1敲减，shRNA2组由siRNA2敲减)中，瘤体重量较对照组Scramble增加，肿瘤生长速度加快。

b)Ki-67染色检测细胞增殖

标本收集处死小鼠的同时，留取部分瘤组织制作石蜡切片。常规处理并固定，以10％BSA/PBS室温封闭1h，加入抗Ki-67抗体，温育1h，洗涤后滴加生物素标记二抗，室温1h，滴加过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白，再加入0.1％DAB+0.05％H₂O₂，处理10-30min，苏木精复染，显色。显微镜下观察，计数阳性细胞比例，参见图3C，Ki-67染色揭示MIIP shRNA稳定敲减前列腺癌荷瘤鼠模型，与对照组Scramble相比细胞增殖加快。

以上实验揭示了MIIP在前列腺癌细胞成瘤过程中的调控作用，在CRPC细胞系中稳定敲减后，小鼠成瘤恶性表型明显增强。

总之，本发明发现MIIP在前列腺癌病人瘤组织样本中表达显著降低，细胞学实验和荷瘤裸鼠实验都证实MIIP具有抑制前列腺癌进展的功能。揭示MIIP可作为一个调控前列腺癌进展和(或)CRPC演化的关键调控分子。以MIIP作为靶向分子可用于筛选前列腺癌治疗、预防药物以及相关分子诊断标志物。