重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的新型稳定制剂的制作方法

本发明涉及一种重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的新型药物制剂。

背景技术：

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其衍生物可用于治疗2型糖尿病。GLP-1可以诱发多种生物学效应，如以葡萄糖依赖方式作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌；刺激β细胞的增殖和分化，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空等。因此GLP-1类似物及其衍生物可以通过改善2型糖尿病患者的代谢紊乱，使血糖维持在恒定水平。

GLP-1(1-37)活性很低，并且GLP-1(7-37)OH及GLP-1(7-36)NH2这两种天然纯在的截断肽在体内容易被迅速清除。内源性的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)可以通过去除GLP-1N端组氨酸和丙氨酸残基而使GLP-1失活，导致GLP-1在体内的半衰期仅为2分钟。将GLP-1与大分子蛋白进行融合或者偶联，可以有效延长其在体内的半衰期。HGS公司研发的一种基于人血清白蛋白(HSA)融合技术的长效GLP-1品种，将2个拷贝的突变GLP-1序列(N末端丙氨酸替换为甘氨酸，增加了其对DPP-IV蛋白水解的耐受性)与HSA序列重组后获得融合蛋白Albiglutide，商品名Syncria。Eli Lilly公司研发的Fc融合GLP-1长效融合蛋白Dulaglutide，商品名Trulicity。上述两种融合GLP-1药物既具有GLP-1生物学活性，又大大延长了其在生物体内的半衰期，能有效增加其对糖尿病的治疗效果。

重组融合蛋白的稳定性都较差，在保存过程中会受到多种环境因素的影响，如温度、湿度、紫外线等都可以使融合蛋白发生多种物理或化学变化，造成蛋白质的聚合、分解、氧化或变性等。这些变化都可以使蛋白的活性降低，治疗效果下降甚至引起严重的毒副作用。因此，开发出稳定并适合长期保存的药物制剂显得尤为重要。

冷冻干燥是一种常用的保存蛋白质药物的技术。可将需要保护的蛋白质与其他的赋形剂、稳定剂等物质按比例溶解混合在一起，经冷冻干燥方法去除水分，形成一种疏松的粉末状物质，从而有效延长其稳定性。

技术实现要素：

本发明公开了一种包含重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的药物组合物。本发明所述的组合物包含由人胰高血糖素样肽-1类似物和人血清白蛋白形成的重组融合蛋白。在本发明的一些实施例中，所述融合蛋白多肽长度为613-639个氨基酸；其中人胰高血糖素样肽-1类似物为28个氨基酸，HSA为585个氨基酸，剩余氨基酸为连接肽。

本发明所述的组合物为含有重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的治疗制剂和药物组合物。在一些实施方式中，所述制剂设置为施用较低剂量的多肽，而在其它实施方式中，所述制剂设置为施用较高剂量的多肽。

在一些实施例中，本发明所述的重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白具有延长的保存期限。

在一些实施方式中，所述药物制剂包括至少一种药学上可接受的载体，且pH在5-8.0之间、5-7.5之间、5-7.2之间、5-7.0之间、5-6.8之间、5-6.6之间、5-6.4之间、5-6.2之间、5-6之间、6-7.5之间、6-7.2之间、6-7之间。在其它实施方式中，所述pH为4、4.2、4.4、4.5、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.5、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.5、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.5、7.6、7.8或8.0。

在一些实施方式中，所述药物制剂包含重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白，其浓度为1-150mg/ml、2.5-100mg/ml、10-50mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、120mg/ml或150mg/ml。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括至少一种药学上可接受的缓冲剂。在一些实施方式中，所述组合物中缓冲剂存在的浓度为5-50mmol/L、10-50mmol/L、15-50mmol/L、5-10mmol/L、10-20mmol/L、20-30mmol/L、15-25mmol/L或20mmol/L。在一些实施方式中，所述组合物中缓冲剂存在的浓度为5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L或60mmol/L。在一些实施方式中，所述缓冲剂是磷酸盐、柠檬酸盐、或其组合。在一些实施方式中，所述缓冲剂包括磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或其组合。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括冻干稳定剂。在一些实施方式中，所述冻干稳定剂是氨基酸。在一些实施方式中，所述氨基酸的浓度2.5-55mg/ml、4-50mg/ml、6-45mg/ml。在一些实施方式中，所述氨基酸的浓度为10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml或30mg/ml。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括赋形剂。在一些实施方式中，所述赋形剂是多元醇。在一些实施方式中，所述多元醇是甘露醇。在进一步的实施方式中，所述药物组合物包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述载体是聚山梨酯。

优选地，所述药物组合物包含以下组分：

本发明所述药物组合物配制为多种形式并以不同途径给药。例如，在一些实施方式中，所述药物组合物制备用于经口、肺、静脉内、肌肉内、皮下、或局部给药。组合物还可以用于配制特定剂型。例如，在一些实施方式中，所述药物组合物可以配制成液体、凝胶、气溶胶、油膏、乳膏、冻干制剂、粉末、块、片或胶囊。在其它实施方式中，所述药物组合物配制成控释制剂、速溶制剂、延迟释放制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、和混合的立即释放制剂。在其它实施方式中，所述药物组合物以冻干粉末提供。在其它实施方式中，所述药物组合物以冻干块提供。

本发明所述人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白中，人血清白蛋白的N端可以直接与人胰高血糖素样肽的C端相连，也可以通过柔性的连接肽使两个蛋白相连。

本发明的含人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的药物制剂可经过下列方法制备获得：1)按配比将人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白、药学上可接受的水溶性赋形剂、药学上可接受的保护剂及pH值调节剂与注射用水混匀，调节pH值至约6.0-7.0；2)将步骤1)配制好的药液除菌、过滤、分装后，置于冻干机中冷冻干燥。

所述步骤2)具体为：将步骤1)配制好的药液除菌过滤分装于适宜大小的西林瓶中，待冻干机板层温度预先冷冻到-10℃以下后，将冻干西林瓶样品放入冻干箱，在-35℃以下保温2-3小时。冷凝期温度降至-45℃后，开始抽真空，真空度低于80pa后，升板层温度到-18℃。当可见水线消失后开始梯度逐级升温，最后升制品温度到30℃，当制品温度上升至30℃时保持3-5小时。

所述冻干机板层温度预先冷冻到-10℃以下，使待冻干制品进冻干箱后温度迅速降低，形成细小的无定型状态，易于水分的去除并减少对活性大分子结构的破坏。

所述升板层温度到-45℃，维持真空度小于80Pa，当可见水线消失后开始梯度逐级升温，可确保冻干制品外观饱满，颗粒细腻，同时缩短冻干周期，减少生产能耗。

本发明通过重组技术获得GLP-1/HSA融合蛋白，并经配制、灌装、冻干获得药物制剂，该药物制剂可用于2型糖尿病的治疗。

附图说明

图1不同pH缓冲液对重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白影响的SEC-HPLC检测结果

图2几种辅料对冻干后重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白影响的SEC-HPLC检测结果

图3几种辅料不同制剂组合在25℃下对冻干后重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白影响的SEC-HPLC检测结果

具体实施例

为了进一步阐明本发明，提供了下列例子，这些例子仅是为了进一步说明本发明，并不意味着作为一种限制。

实施例1

重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白制备：菌种接种于YPD培养基，30℃220～280rpm振荡培养至菌体湿重约50g/L，按10％接种量进罐，培养20h后连续流加甲醇开始诱导，诱导4h后将温度降低到22℃，50h后结束诱导，用10000g离心15min收集发酵上清液。纯化采用BLUE亲和、PHE疏水、DEAE离子交换和凝胶排阻四步层析。首先将发酵上清液用20mmol/L pH7.0磷酸钠溶液稀释3倍，过Blue Sepharose Fast Flow亲和层析柱用2M NaCl，20mmol/L pH6.5磷酸钠溶液洗脱目的蛋白。向所收蛋白溶液中加入(NH4)2SO4，过PHE Sepharose Fast Flow层析柱，经再平衡后，用5mmol/L pH6.5磷酸钠缓冲液洗脱蛋白。将收到的蛋白再用5mmol/L pH6.5磷酸钠缓冲液稀释2倍后过离子交换层析柱，采用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，直接用PBS洗脱目的蛋白。最后通过Sephadex G25coarse凝胶层析柱脱盐置换到5mmol/L pH6.5磷酸钠缓冲液中。

详细过程可参见专利ZL201310331182.6。

实施例2

考察pH对重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白组合物稳定性的影响。

采用分子排阻HPLC评估重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的纯度。采用分子排阻柱(7.8mm*30cm)用由磷酸盐及硫酸盐组成的等度流动相分析样品。通过计算检测波长214nm时主峰面积和全部峰面积的比例确定纯度。各组含重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白1.0mg/ml，甘露醇30mg/ml，组氨酸10mg/ml，聚山梨酯80 1mg/ml，不同pH的20mmol/L的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液或磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液，pH 4.0到pH8.0，每组间隔0.5。各组样品经无菌过滤后分装至无菌无热源西林瓶中。于25℃加速考察，采用SEC-HPLC检测。

表1不同pH缓冲液SEC-HPLC检测结果

试验表明(表1，图1)，蛋白在pH 4.0-pH 5.5和pH 7.5-pH 8.0时，经30天加速，聚体增加明显。

实施例3赋形剂的选择

筛选了一些适合于人体使用的赋形剂辅料，研究其在冻干时对重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白制剂成型的影响。各组含重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白溶液超滤至20mmol/L pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，蛋白浓度为50.0mg/ml，添加各赋形剂辅料，种类及浓度详见表2。样品溶液过滤除菌后分装于无菌西林瓶，装量为1.0ml，半加塞，冻干。将冻干的制品进行外观检查，采用SEC-HPLC检测蛋白聚体。

表2几种辅料冻干后赋形结果及SEC-HPLC结果

结果表明，从赋形效果来看甘露醇作为赋形剂，其外观为白色疏松体，水溶性较好，且经SEC-HPLC检测(图2)，聚体含量较低。而山梨醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖及海藻糖成型性较差，表现为严重塌陷或萎缩。

实施例4氨基酸对制剂稳定性的影响试验

氨基酸有利于抑制冻干过程中聚体的产生。筛选了一些适合于人体使用的氨基酸，研究其对重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的影响。各组含重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白溶液超滤至20mmol/L pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，蛋白浓度为30.0mg/ml，添加各氨基酸辅料，种类及浓度详见表3。样品溶液过滤除菌后分装于无菌西林瓶，装量为1.0ml，半加塞，冻干。置于25℃恒温培养箱中进行加速考察，采用SEC-HPLC检测。

表3不同氨基酸缓冲液SEC-HPLC检测结果

结果表明，组氨酸和精氨酸作为辅料经25℃加速30天蛋白聚体含量增加不明显。其余氨基酸聚体异常增加。

根据上述结果及实施例2，最终选择甘露醇与组氨酸，甘露醇与精氨酸，同时以pH 6.0和pH 7.0等处方进行进一步筛选，重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白浓度15mg/ml。并在25℃加速条件下连续观察3个月，考察其外观、SEC-HPLC聚体含量。

表4几种辅料不同制剂组合保存于25℃下检测结果

表4、图3表明，各制剂处方在保存过程中外观均为白色饱满疏松体，加水迅速溶解。在抑制聚体增加方面，添加组氨酸显著好于添加精氨酸，pH6.0在加速过程中聚体增加显著少于pH7.0。

实施例5渗透压考察

重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白拟皮下注射给药，因此对制品渗透压要求较高。正常人体的渗透压摩尔浓度为280mOsmol/kg～320mOsmol/kg。各组重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白浓度为150mg/ml，如表5分别添加缓冲液及辅料，考察各组渗透压。

表5几种辅料不同浓度渗透压检测结果

结果显示，甘露醇40mg/ml与组氨酸5mg/ml混合已经接近人体生理渗透压，再通过添加不同磷酸盐(PB)来微调处方渗透压，详见表6。

表6几种辅料混合后渗透压检测结果

表6表明：甘露醇40mg/ml，组氨酸5mg/ml及20mmol/L PB混合接近人体渗透压。

实施例6表面活性剂的选择

表面活性剂可减少蛋白分子间的相互作用，抑制不溶性微粒的产生。配制甘露醇40mg/ml，组氨酸5mg/ml，20mmol/L PB以及不同浓度的聚山梨酯80，重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白浓度15mg/ml，过滤除菌后分装于无菌西林瓶，装量为1.0ml，半加塞，冻干。具体组分如表7。冻干后进行外观观察，并送检不溶性微粒。

表7不同浓度聚山梨酯80添加后检测结果

结果表明添加聚山梨酯80对冻干制品的外观没有影响。且当聚山梨酯80浓度高于0.6mg/ml时可以明显抑制不溶性微粒的产生。

实施例7冻干制剂制备过程

称取适量的组氨酸、甘露醇、聚山梨酯80、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠加注射用水搅拌溶解，再加入适量高浓度重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白溶液，配制各组制剂处方如下：

表8各组制剂处方

配制好的溶液用0.22μm的PVDF或PES亲水性滤膜过滤。

除菌过滤后的溶液在无菌条件下分装和进冻干箱。待冻干机板层温度预先冷冻到-10℃以下，将半加塞的样品迅速放入冻干箱。制品平均温度在-35℃以下保温2小时后，开始冷凝器降温。冷凝器温度降至-45℃后，开始抽真空，真空度低于80Pa后，升板层温度到-18℃，维持真空度。当视窗中样品水印消失并且制品平均温度接近板层温度后，开始升高板层温度，最后设板层温度到30℃，当制品平均温度升到30℃后保持3-5小时，整个冻干过程控制在48小时内。冻干结束后，轧盖密封。

实施例8制品长期稳定性考察

采用考马斯亮蓝的SDS-PAGE来评估在变性条件下重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的纯度。分析前，使用没有还原剂的样品缓冲液稀释样品。每块凝胶上加上分子质量标记和标准品。电泳后，凝胶使用考马斯亮蓝染色并用光密度分析纯度。

考察CHO细胞内cAMP(环化腺苷酸)的变化来判定重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的活性。在试验中，将96孔的微板中接入5000细胞/孔，在37℃下加入相应浓度的重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白并孵育4.5小时，孵育后分别加入Luciferase Assay System底物，将重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白工作参考品和供试品的RLU数值分别取平均值，以重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白浓度的对数值为横坐标，RLU数值平均值为纵坐标，通过Origin70分析软件进行四参数拟合，绘制量效曲线，获得EC50值。以下列公式计算比活：

供试品比活(U/mg)＝工作参考品比活(4.46×10³U/mg)×供试品相对活性。

按照实施例7处方1至处方5制备样品，考察制剂处方长期稳定性(保存于2-8℃)。送检SEC-HPLC纯度，非还原SDS-PAGE，生物学活性及不溶性微粒，检测结果见表9。

表9连续三批长时间稳定性考察结果

从结果可以看出在4-8℃时，稳定性考察12个月各处方组均可以保持稳定。