本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪支气管败血波氏杆菌病疫苗。
背景技术：
猪支气管败血波氏杆菌病,又称波氏菌病,是一种重要的猪呼吸道系统疾病,以各种急慢性的呼吸道病症为特征,极易引起其它病原菌的混合和继发感染,全世界多数养猪业发达的国家均有此病发生,给养殖业带来了严重的经济损失。猪波氏杆菌病在全世界分布广泛,在欧洲、美国、加拿大、日本的感染率都很高,全世界已经有30％-50％的猪群受到波氏杆菌的感染。我国对猪波氏杆菌进行的流行学调查显示,我国多个省份和地区爆发严重,感染率高达61.1％。随着集约化程度的不断提高,对养猪业的危害也日趋严重。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种猪支气管败血波氏杆菌病疫苗，从而弥补现有疫苗的不足。
本发明还提供一种灭活疫苗，其中抗原为灭活的猪支气管败血波氏杆菌YBB01株；
本发明所提供猪支气管败血波氏杆菌YBB01株(Bordetella bronchiseptica YBB01)，于2016年11月1日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016606。
上述的灭活疫苗，抗原的灭活采用甲醛灭活；
本发明的灭活疫苗的制备方法如下：
1)油相：采用MONTANIDETM ISA 201 VG佐剂(以下简称201佐剂)；
2)水相制备：将纯粹检验合格的YBB01株抗原，将菌泥分别重悬于灭菌的生理盐水中，均稀释至4.0×109CFU/ml灭活后，检验合格后，作为抗原；
3)乳化：将水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30～40分钟；
4)分装：定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
本发明的疫苗所使用的猪支气管败血波氏杆菌YBB01株的毒力强高、免疫原性好并具有较好的交叉保护性。本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；效力试验结果证明，YBB01株产生抗体快，重要的是免疫后能够抵御流行株的保护。
具体实施方式
申请人筛选获得了一株猪支气管波氏杆菌YBB01株，并用其制备疫苗，从而促成了本发明。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：猪支气管波氏杆菌YBB01株的筛选
1.流行病学调查 自2013年以来，发明人对猪支气管败血波氏杆菌的流行病学进行调查，并对部分猪场进行跟踪调查。调查结果发现，猪支气管败血波氏杆菌目前已在我国猪场广泛存在。
2.细菌分离 采集疑似病猪的肺脏、胸腹腔积液、心包积液等病料，接种TSA培养基，于5％CO2条件下，37℃培养24～48h，挑取单个菌落，进行培养并鉴定。
3.细菌鉴定
3.1 形态观察 取疑似菌落，涂片后革兰氏染色镜检，观察其细菌形态。
3.2 生化特性鉴定 对可疑菌落进行葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、鼠李糖、山梨醇、卫矛醇、氧化酶、脲酶、硝酸盐还原、柠檬酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、谷氨酸脱羧酶、枸橼酸、明胶、甲基红、VP、吲哚半固体等生化试验，于37℃培养24～48h，观察结果。
3.3 PCR鉴定 将上述初步鉴定的细菌进一步用PCR方法确定。用接种环取少许被检菌落于100μL无菌PBS,混匀,取1μL菌悬液作PCR模板。根据波氏杆菌fla基因(NO.AF232939)序列设计引物,P1:5′-GCTCCCAAGAGAGAAAGGCT-3′,P2:5′-GGTGGCGCCTGCCCTATC-3′,扩增片段大小为235bp,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.毒力试验 将分离的10株猪支气管波氏杆菌分别滴鼻注射8～10周龄健康易感仔猪各5头，3.0ml/头(活菌量均约为4.0×109CFU)，另取5头不攻毒作为对照。连续观察14日，记录试验猪的发病及死亡情况。试验结果表明，YBB01株毒力最强，5头仔猪发病，其中4头死亡。
5.免疫原性 根据毒力试验结果，将筛选的毒力较强的YBB01株菌株菌液分别调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，每种疫苗分别肌肉注射3～5周龄仔猪，2.0ml/头，每组5头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪采血并分离血清，使用间接血凝方法测定血清的抗体效价；并用本菌株进行滴鼻注射攻毒(活菌量均约为4.0×109CFU)。观察试验猪的发病及死亡情况。抗体检测结果表明，免疫组5/5均大于等于1:16,对照组5/5均小于等于1:4；攻毒保护结果表明，免疫组5/5保护,对照组5/5发病。
6.交叉攻毒保护 根据毒力试验结果，将YBB01株及其他9株分离菌株菌液调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，分别制备单价灭活疫苗，颈部肌肉注射仔猪，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪分别用分离的10株同型菌株进行攻毒(4.0×109CFU)。观察14日，记录试验仔猪的发病及死亡情况。试验结果表明，YBB01组免疫组仔猪均未发病或死亡，均5/5保护；而对照组仔猪，均4/5-5/5发病。其他分离菌株免疫组攻毒后，保护率为1/5～3/5。表明YBB01株所制备的猪支气管波氏杆菌灭活疫苗能抵御YBB01株及各地方分离株的攻击而起到保护作用。
实施例2：猪支气管波氏杆菌YBB01株抗原的制备
1.菌液培养 采用发酵罐对YBB01株进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，分别加入5％新生牛血清、0.01％NAD和1％～3％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养8小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过24小时。
2.灭活 根据活菌计数结果，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，稀释至4.0×109CFU/ml，分别计量加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃搅拌灭活16小时，进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存，不超过14日。
3.半成品检验
3.1 纯粹检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验。
3.2 活菌计数 按现行《中国兽药典》附录进行计数。
3.3 灭活检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验。
实施例3：疫苗的制备
1 水相配制 检验合格的YBB01株抗原。
2 油相 MONTANIDETM ISA 201VG佐剂(以下简称201佐剂)。
3 乳化 水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30～40分钟。
3 分装 定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
4 成品检验
4.1 性状
外观 乳白色乳剂。
剂型 水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不大于0.5ml。
黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
4.2 装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
4.3 无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
4.4 安全检验 用3～5周龄健康易感仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗4.0ml，观察14日，应不出现因疫苗引起的局部或全身不良反应。
4.5 效力检验
4.5.1 血清学方法 取3～5周龄健康易感仔猪10头，其中5头颈部肌肉注射疫苗2.0ml/头，其余5头作非免疫对照。一次免疫后21日，按相同剂量和相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日对所有仔猪采血并分离血清，检测间接血凝抗体效价。免疫组5头仔猪的抗体效价均应≥1:16，对照组5头仔猪抗体效价均应≤1:4。
4.5.2 免疫攻毒法 用3～5周龄健康易感仔猪10头，随机分为A、B两组，每组5头，其中A组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2.0ml/头，B组为非免疫对照组，均颈部肌肉注射生理盐水，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同方法和相同剂量进行二次免疫，二次免疫后14日进行攻毒。A、B组试验猪滴鼻注射YBB01株菌液3.0ml(活菌量约为4.0×109CFU/头)。观察14日，免疫组猪均应至少4头保护，对照组猪均应至少4头发病。
实施例4：免疫交叉保护试验
用YBB01株制备的灭活疫苗，颈部肌肉注射仔猪，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有免疫仔猪分别用分离的10株同型菌株进行攻毒(4.0×109CFU)。观察14日，记录试验仔猪的发病及死亡情况。攻毒后，免疫组仔猪均未发病或死亡，均5/5保护；而对照组仔猪，均4/5-5/5发病。表明YBB01株所制备的猪支气管波氏杆菌灭活疫苗能抵御YBB01株及各地方分离株的攻击而起到保护作用(表1)。而且，发明人用各地方分离株制备疫苗，免疫仔猪后，再用本发明筛选的YBB01株进行攻毒实验；结果表明其它分离株疫苗的免疫效果远低于本发明YBB01株制成的灭活疫苗的效果。因此YBB01株可作为猪波氏杆菌病灭活疫苗的候选菌株。
表1：YBB01株疫苗对不同菌株的免疫交叉保护试验结果