一种岩藻多糖在制备PC‑12细胞或MKN‑45细胞活性抑制剂中的应用的制作方法

本发明涉及一种岩藻多糖在抗肿瘤中的应用，特别涉及一种岩藻多糖在制备PC-12细胞或MKN-45细胞活性抑制剂中的应用。

(二)

背景技术：

海洋藻类作为一种新的生物活性物质的来源正在迅速被研究，我国藻类资源十分丰富，特别是褐藻(Phaeophyta)资源，是海藻生产和消费大国。褐藻(Phaeophyta)是海洋藻类中的第二大种群，分为25个属，大约有1500种，是生长在海洋中的低等植物，在很多国家，褐藻(Phaeophyta)如墨角藻(Fucus)，海带(Laminaria japonica)，羊栖菜(Hizikiafusifarme)等作为食品来食用。褐藻中含有的多糖成分，如褐藻胶，岩藻多糖，褐藻淀粉等，均已在医药原料中广泛的应用。

岩藻多糖(Fucoidan)是Kylin在1913年首次从掌状海带中提取的，它是褐藻中所固有的细胞间多糖，存在于细胞壁基质中。研究表明岩藻多糖具有广泛的生物活性如抗氧化，抗肿瘤，抗凝血，抗病毒等。岩藻多糖不仅能够增强人体免疫力，还可以诱导肿瘤细胞凋亡，被认为是重要的自由基清除剂和抗氧化剂，岩藻多糖在功能性食品和药品行业具有很大的发展潜力。

岩藻多糖是以L-岩藻糖和硫酸基为主要特征的一类水溶性多糖，并伴有其他单糖(如半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖)的杂多糖。岩藻多糖结构十分复杂，一方面不同褐藻的岩藻多糖，化学组成不尽相同，除了主要成分岩藻糖、硫酸基、其他单糖(甘露糖、半乳糖、葡萄糖等)以及糖醛酸外，有些还具有乙酰基和蛋白质；另一方面不同种褐藻中的岩藻多糖的结构也不相同，并且由不同提取方法得到的岩藻多糖分子量和结构也会不同。褐藻中的岩藻多糖，单糖组成以L-岩藻糖为主，L-岩藻糖通过α-(1→2)，α-(1→3)或α-(1→4)连接构成主链，主链除了由岩藻糖构成还含有其他单糖，并且有较多的分支。硫酸基主要结合在C-2或C-4位上，平均每两个岩藻糖基含有一个硫酸基。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种岩藻多糖在制备PC-12细胞或MKN-45细胞活性抑制剂中的应用，本发明从海带中获得纯度高达71％-92％岩藻多糖的方法，提供测定岩藻多糖抗氧化及抗肿瘤活性的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种岩藻多糖在制备PC-12细胞或MKN-45细胞活性抑制剂中的应用。

进一步，所述岩藻多糖按如下方法制备：将干海带粉与溶剂混合，在60-100℃浸提1-5h，将提取液5000-10000r/min离心，取上清液50℃-70℃减压浓缩至1/2-1/15体积(优选浓缩至1/10)，然后加1M CaCl₂水溶液至无沉淀产生，搅拌4h，离心，取上清液，加入无水乙醇至乙醇体积浓度为60-90％(优选75％)，搅拌，在4℃下静置过夜，离心，沉淀冻干，得粗岩藻多糖；将粗岩藻多糖用纯水制成质量浓度为2％(m/m)的溶液，上样DEAE-52纤维素阴离子交换柱(3.2cm×22cm)，分别用纯水，1.0M NaCl水溶液，2.0M NaCl水溶液进行洗脱，分别收集三种洗脱馏分的流出液，经透析(14KDa)，冻干(6-10小时)，获得岩藻多糖；所述溶剂为体积浓度95％乙醇水溶液或纯水；所述溶剂体积用量以干海带粉质量计为25-50ml/g。

进一步，优选所述溶剂为纯水。

进一步，优选所述溶剂体积用量以干海带粉质量计为40ml/g；所述浸提条件为90℃浸提3h。

本发明取岩藻多糖的原料可以是人工养殖的海带，也可以是野生褐藻马尾藻(Scagassum)。

本发明所述纯水是指去离子水。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

1)采用本发明的制备方法制取岩藻多糖作为抗肿瘤(PC-12，MKN-45)及抗氧化剂，具备纯度高(71％-92％)，操作简单，反应条件易于控制、工艺成本低等特点。

2)本发明的制备方法制取分离得到的岩藻多糖(FCSP，FCSP-1，FCSP-2，FCSP-3)，其抗肿瘤(PC-12，MKN-45)抑制率要高于市售岩藻多糖(纯度80％，来自于陕西天然原料汇)对PC-12，MKN-45的抑制率。

3)采用本发明制备的岩藻多糖作为抗肿瘤(PC-12，MKN-45)及抗氧化剂，也可以用于食品添加剂产品可制成粉剂、水剂、针剂等剂型。

(四)附图说明

图1为FCSP，FCSP-1，FCSP-2，FCSP-3的羟基自由基清除活性图，a为FCSP的羟基自由基清除活性，b为FCSP-1的羟基自由基清除活性，c为FCSP-2的羟基自由基清除活性，d为FCSP-3的羟基自由基清除活性。

图2为FCSP，FCSP-1，FCSP-2，FCSP-3抗肿瘤(PC-12、MKN-45)抑制率图，a为FCSP，FCSP-1，FCSP-2，FCSP-3抗PC-12抑制率，b为FCSP，FCSP-1，FCSP-2，FCSP-3抗MKN-45抑制率。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：水煮法工艺优化提取岩藻多糖

(1)溶剂体积对多糖得率的影响：分别称取15份1.00g干海带粉(80目)，分五批。每一批加入纯水的体积为25.0mL，30.0mL，35.0mL，40.0mL，45.0mL，50.0mL。在90℃下，水浴2h。离心，取上清液，用纯水纯水定容至250.0mL，作为储备液，60℃下减压烘干计算多糖得率。取2.0mL储备液，用纯水定容至100.0mL，作为待测液，使用硫酸苯酚法测定多糖含量。

(2)时间对多糖得率的影响：分别称取15份1.00g干海带粉(80目)，分五批，分别加入纯水35mL。每一批设置提取时间分别为1h，2h，3h，4h，5h。温度为90℃，料液比为1:35。离心，取上清液，用纯水定容至250.0mL，作为储备液，60℃下减压烘干计算多糖得率。取2.0mL储备液，用纯水定容至100.0mL，作为待测液，使用硫酸苯酚法测定多糖含量。

(3)温度对多糖得率的影响：分别称取15份1.00g干海带粉(80目)，分五批，分别加入纯水35mL。每一批温度设置为60℃，70℃，80℃，90℃，100℃。料液比1:35，时间3h。离心，取上清液，用纯水定容至250.0mL，作为储备液，60℃下减压烘干计算多糖得率。取2.0mL储备液，用纯水定容至100.0mL，作为待测液，使用硫酸苯酚法测定多糖含量。

上述待测液分别使用硫酸苯酚法测定多糖含量(参照Dubois,M.,et al.(2002).Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances.Analytical Chemistry,28(3):p.350-356.)，以多糖储备液减压蒸干得到固体质量与投料质量之比计算多糖得率。

表1水煮法提取，料液比，提取时间，提取温度对岩藻多糖提取的影响

在单因素提取优化基础上，以多糖含量和多糖得率为评价指标，采用L₉(3³)正交设计，研究A(提取温度，℃)、B(提取时间，h)、C(料液比)对岩藻多糖水煮法提取的影响，确定最佳提取工艺条件。

表2为本发明正交试验的表头设计

表3为正交试验数据确定最佳提取工艺条件

本发明中海带岩藻多糖的水煮最佳提取工艺条件为A₃B₂C₃，即提取温度90℃，提取时间3h，料液比为1:40。在此条件下，岩藻多糖得率最大。显著性分析(表4)。

表4显著性分析

实施例2：水煮法提取岩藻多糖以及分离纯化

(1)称取干海带粉(80目)40.0g，加入1600mL水(即料液比1:40)，在90℃下，提取3h，然后在8000rpm下离心10min，过滤，滤渣加入1600ml水在同样条件下重新再提取一次，取离心后的上清液，两次合并，即为提取液。将提取液体积浓缩至1/10，然后加1M CaCl₂水溶液至无沉淀产生，搅拌4h，离心，取上清液，加入无水乙醇至乙醇体积浓度为75％，搅拌，在4℃下静置过夜，离心，沉淀冻干，得粗岩藻多糖FCSP4.5g。

(2)称取步骤(1)1.0g粗岩藻多糖FCSP，用纯水配置浓度为2％(m/m)的溶液，上样DEAE-52纤维素阴离子交换柱(3.2cm×22cm)，分别用纯水，1.0M NaCl水溶液，2.0M NaCl水溶液进行洗脱，得到馏分FCSP-1，馏分FCSP-2，馏分FCSP-3，每个馏分用硫酸苯酚法检测，然后用14KDa的透析袋截留透析10h，取截留液冻干，即为岩藻多糖。

表5岩藻多糖馏分成分含量

实施例3：岩藻多糖抗氧化活性

(1)DPPH自由基清除实验：称取4mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，用无水乙醇定容至100mL，浓度为0.1mM。配置0.1mL样品溶液(实施例2制备的粗岩藻多糖FCSP，馏分FCSP-1，馏分FCSP-2，馏分FCSP-3用纯水配制浓度0.20-3.00mg/mL，表6)，分别加入3mL、0.1mM的DPPH/乙醇溶液，在暗处30℃下培养30min，在紫外波长517nm处，测吸光度。DPPH/乙醇溶液作为空白对照。

计算公式DPPH清除率(％)＝(1-As/Ac)

As是样品吸光值，Ac是用无水乙醇做空白吸光值。

表6为岩藻多糖FCSP作为抗氧化剂DPPH自由基清除率

(2)羟基自由基清除实验：配置样品浓度为1.00-4.50mg/mL(实施例2制备的粗岩藻多糖FCSP，馏分FCSP-1，馏分FCSP-2，馏分FCSP-3用纯水配制)，移取0.5mL样品于0.5mL水杨酸-乙醇体系(9.0mM)中，然后加入7.5mM FeSO₄(溶剂是水)(1.0mL)，质量浓度0.1％H₂O₂(溶剂是水)(1.0mL)，在37℃水浴下保持30min，在紫外波长510nm处，测定吸光度。

FCSP，FCSP-1，FCSP-2，FCSP-3的羟基自由基清除活性如图1。

清除率(％)＝(Ac-As)/Ac

As是样品吸光值，Ac是用无水乙醇做空白吸光值。

结果如图1，FCSP抑制效率最高，其EC50是3.4mg/mL。FCSP-1,FCSP-2,FCSP-3在4.5mg/mL时，羟基自由基抑制率分别为20.26±0.08％,17.57±0.11,19.89±0.07％。

实施例4：岩藻多糖抗肿瘤活性

(1)细胞复苏：从液氮罐中取出冷冻的鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞(由浙江大学药学院提供)，37℃水浴解冻，将鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞转移到含10mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培养基的15mL离心管中，3000r/min，离心1min，倒掉液体，加入5mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培养基，并吹散细胞，随后转移到细胞培养瓶中，将培养瓶放置在37℃，含有5％的CO₂培养箱中培养24h；(2)细胞培养：将步骤(1)中培养24h的细胞进行换液，倒掉培养基，加入5mLPBS清洗，倒掉PBS，再加入5mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培养基，放置在37℃，含有5％的CO₂培养箱中培养24h；(3)细胞传代：将步骤(2)中培养的细胞进行传代，倒掉培养基，加入5mLPBS清洗，倒掉PBS，加入1mL胰酶，进行消化，直到细胞变圆脱离培养瓶壁，转移出胰酶，再加入15mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培养基，再分别转移出5mL培养基到两瓶培养瓶中，将三瓶培养瓶放置在培养箱中，放置在37℃，含有5％的CO₂培养箱中培养48h；(4)细胞种板：将步骤(3)中培养的细胞转移到96微孔板中，5×10⁴个/mL，每孔100μL含10％胎牛血清的DMEM-1640培养基，放置在37℃，含有5％的CO₂培养箱中培养24h；(5)细胞加药：将步骤(4)中的培养基转移出来，加入200μL样品溶液(样品溶液是将实施例2制备的粗岩藻多糖FCSP，馏分FCSP-1，馏分FCSP-2，馏分FCSP-3用含10％胎牛血清DMEM-1640培养基溶解制成终浓度分别为62.5μg/mL，125μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL的样品溶液)，放置在37℃，5％的CO₂培养箱中培养24h；(6)加MTT：向步骤(5)中细胞加入15μL MTT(5mg/mL)进行染色，放置在37℃，含有5％的CO₂培养箱中培养4h，然后将培养基转移出去，加入150μL DMSO，振荡10min，在紫外波长570nm处测定吸光度，结果见图2。

同样条件下，将上述鼠嗜铬细胞瘤PC-12换成人胃癌细胞MKN-45(由浙江大学药学院提供)，将含10mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培养基换成含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，以市售岩藻多糖为对照，结果见图2。

细胞抑制率(％)＝(1–As/Ac)×100％As样品组570nm吸光值，Ac空白组570nm吸光值。

结果表明，在浓度为1000μg/mL时，馏分FCSP-2对PC-12、MKN-45的抑制率分别为58.93±3.93％、42.18±0.55％，而市售岩藻多糖(纯度80％，来自于陕西天然原料汇)抑制率分别为33.27±1.26％，20.87±2.78％。FCSP、FCSP-1和FCSP-3对PC-12也有较高的抑制率(33.34±2.02％、35.17±0.47％、50.06±0.77％)。FCSP-3对MKN-45的抑制率最高为45.18±1.44％。因此，本发明制备的岩藻多糖(FCSP-2)对(鼠嗜铬细胞瘤(PC-12)，人胃癌细胞(MKN-45)的抑制活性比市场上岩藻多糖对这两种细胞的抑制活性高25％，22％。