蜂胶乙醇提取物的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及蜂胶乙醇提取物的应用。

背景技术：

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一类以肠道炎症为主要特征的疾病，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)。炎症性肠病的发病原因目前尚未完全明确，临床上炎症性肠病常表现为反复发作而治愈难度很大。目前普遍认为其发病机制主要与宿主因素和外界因素之间复杂的相互作用密切相关。导致炎症性肠病发病的主要因素包括肠道微环境紊乱、免疫失调、外界环境改变、宿主的遗传因素等。据统计，全球炎症性肠病患者约500万人，其中美国约有140万人，欧洲约有300万人。

溃疡性结肠炎在临床较为常见，且近年来在我国的发病率呈上升趋势。该病病程长，病变范围位于结直肠的黏膜层，主要的病理表现为结直肠充血、水肿、溃疡、糜烂。当前，治疗溃疡性结肠炎的主要策略是抑制肠粘膜炎症，使用的药物主要是抗炎药，包括糖皮质激素、水杨酸类、抗生素类、免疫抑制剂如环磷酰胺等。尽管这些药物治疗方法在很多患者中取得了积极的治疗效果，但仍有相当数量的患者临床症状得不到完全改善，因此针对溃疡性结肠炎的治疗仍需研究开发新的药物治疗方法。

蜂胶是由意大利蜂(Apis mellifera L.)的工蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶粘性物质。蜂胶是一种历史十分悠久的传统天然药物，现已收录于《中华人民共和国药典》(2010年版，一部)。同其他蜂产品一样，蜂胶具有广泛的药理学活性，如抗菌、抗病毒、抗原虫、抗氧化、抗癌、麻醉、创伤修复、消炎、免疫调节、预防龋齿、心血管保护等。而也正是由于蜂胶具有多重药理活性，蜂胶产品在市场上受到广大消费者的青睐，现已广泛应用于医药、保健食品、化妆品等领域。由于中华蜜蜂(Apis cerana cerana)并没有采集蜂胶的习性，我国历史上对于蜂胶的生产和应用并不是很多。相对来说，我国针对蜂胶方面的开发利用要比国外晚很多。但20世纪90年代以来，我国研究者开始对蜂胶的成分、性质、药理和临床应用等进行了大量的研究工作，蜂胶及蜂胶产品近十多年来已成为我国蜂产品研究和开发的热点。

现有技术中，利用蜂胶在制备治疗各类疾病药物中的应用基本上都利用蜂胶与其他中草药配伍组分，以期达到解决治疗各类疾病的用途，未见利用蜂胶提取物在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用的报道。

技术实现要素：

本发明通过乙醇提取富集蜂胶有效成分，进行了蜂胶乙醇提取物的应用研究，发现蜂胶乙醇提取物具有显著的预防或治疗炎症性肠病，尤其是溃疡性肠炎的活性，对于预防和治疗溃疡性结肠炎药物、食品、保健品的开发和应用具有广泛的应用价值。

发明人将蜂胶乙醇提取物按一定量掺入棕榈油中，而后参照美国AIN-93M标准配方制备啮齿动物颗粒料，预饲SD大鼠一周后，通过连续7天饮水添加3％的硫酸葡聚糖(dextran sodium sulfate，DSS)诱导SD大鼠溃疡性结肠炎产生，对大鼠进行疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)、结肠长度、体重、大鼠结肠病理学等进行评估，综合评价抗溃疡性结肠炎活性。

研究发现：一定浓度的蜂胶乙醇提取物能降低DSS诱导的急性溃疡性结肠炎模型动物DAI评分，改善动物疾病严重程度，减轻溃疡性结肠炎所致小鼠结肠长度缩短，更重要的是，DSS可对肠粘膜造成严重影响，黏膜和黏膜下层多处可见溃疡及炎性渗出物，并伴随着水肿和大量中性粒细胞浸润，而蜂胶乙醇提取物干预可使大鼠结肠上述病理症状有着明显程度的减轻，表现为结肠黏膜腺体排列整齐，肉眼少见水肿，基本未见溃疡和炎性渗出物。上述研究证明，本发明的蜂胶乙醇提取物可以减轻DSS诱导的溃疡性结肠炎模型动物炎症反应，改善动物疾病严重程度。

因此，本发明的技术方案是：蜂胶乙醇提取物在制备用于预防或治疗炎症性肠病药物、食品、保健品中的应用。

其中，以槲皮素当量计，所述蜂胶乙醇提取物中含有124.92±9.74mg/g的总黄酮；以没食子酸当量计，所述蜂胶乙醇提取物中含有233.98±0.85mg/g的总酚酸。

进一步优选地，以所述蜂胶乙醇提取物的总重量计，所述蜂胶乙醇提取物中含有如下重量百分比的黄酮类活性成分：白杨素(chrysin)7.5％～8.5％，松属素(pinocembrin)4.5％～5.0％，高良姜素(galangin)3％～4％，还含有如下重量百分比的芳香酸类活性成分：咖啡酸(caffeic acid)1.0％～1.5％，阿魏酸(ferulic acid)0.05％～0.15％，咖啡酸苯乙酯(CAPE)2.0％～2.5％。

优选地，本发明所述的蜂胶乙醇提取物是采用浓度80-95％(v/v)的乙醇为溶剂提取得到的。

进一步优选地，本发明所述的蜂胶乙醇提取物是采用浓度95％(v/v)的乙醇提取得到的。

本发明所述的蜂胶乙醇提取物可采用本领域公知的蜂胶为原料，优选地，本发明所述的蜂胶乙醇提取物是以杨树型蜂胶为原料提取得到的；进一步优选地，本发明所述的蜂胶乙醇提取物是以中国杨树型蜂胶为原料提取得到的。

以乙醇为溶剂对蜂胶进行有效成分提取可采用本领域常规的技术手段，本发明优选采用超声提取法。

所述超声提取法的操作为：取蜂胶，向所述蜂胶中加入乙醇，超声提取；提取结束后，取上清液，除去所述上清液中的溶剂，干燥，即得。

优选地，所述超声提取法的操作参数为：超声频率为50-70KHz，超声功率为500-700W，提取温度为35-45℃，提取时间为2.5-3.5h。

优选地，所述蜂胶与乙醇的质量体积比为1:(8-12)(g：mL)；进一步优选地，当采用95％(v/v)乙醇时，蜂胶与乙醇的质量体积比为1:10(g：mL)。

优选地，先将所述蜂胶研磨成粉状，然后再加入乙醇超声提取。

本领域技术人员可以理解，超声提取后的蜂胶渣可继续按照上述方法进行多次提取(如2-4次)，以充分富集蜂胶内的有效成分。同时，超声所得的提取液优选经过滤后，取滤液再进行后续的除溶剂、干燥处理。

作为本发明最佳的技术方案，蜂胶乙醇提取物的制备方法为：取蜂胶，将其研磨成粉末状，按照1：10的固液比(g：mL)加入95％(v/v)乙醇，采用频率60KHz，功率600W的超声波，于40℃条件下超声提取3h，过滤，收集清液，重复上述操作3次，集中收集滤液，采用50℃减压旋转蒸发仪回收溶剂，干燥直至提取物恒重，即得。

采用上述方法得到的蜂胶乙醇提取物为树脂状团块，黄褐色或灰褐色，具芳香气味，有粘性，低温下变硬、变脆，加热可熔化。以蜂胶乙醇提取物总重量计，该方法制备得到的蜂胶乙醇提取物中含有：8.18％白杨素，4.78％松属素，3.58％高良姜素；1.34％咖啡酸，0.1％阿魏酸和2.35％咖啡酸苯乙酯。

优选地，本发明所述炎症性肠炎为溃疡性结肠炎。

进一步优选地，所述溃疡性结肠炎是由DSS诱导产生的。

本领域技术人员可以理解，可以根据实际需要将所述药物或保健品制备成本领域公知的各种剂型，如固体制剂中的片剂、胶囊剂、丸剂等，液体制剂中的注射剂、溶液剂等，半固体制剂中的凝胶剂，气体制剂中的气雾剂、喷雾剂等。或者，可以根据实际需要将所述食品制备成本领域公知的种类，如饼干、面包等。

本领域技术人员同样可以理解，在以本发明的蜂胶乙醇提取物为主要活性成分制备用于预防或治疗炎症性肠炎的药物、食品、保健品时，可根据实际需要加入常规的助剂，如流平剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、助溶剂、润滑剂等。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

本发明涉及到的原料和试剂均可市购获得。

附图说明

图1是实施例1的蜂胶乙醇提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎SD大鼠DAI的影响；

图2是实施例1的蜂胶乙醇提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎SD大鼠结肠长度的影响；

图3是实施例1的蜂胶乙醇提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎SD大鼠结肠组织形态的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作；实施例1中采用的蜂胶为2012年夏天采集的中国蜂胶，植物来源为杨树(Populus×canadensis)。

实施例1

蜂胶乙醇提取物的制备方法：称取100g蜂胶，采用研磨机研磨成粉状，用1L 95％(v/v)乙醇提取蜂胶样本，40℃超声3h(频率600KHz，功率600W)。超声后的上清液用4号滤纸过滤取出残留杂质。将残留杂质重新采用95％(v/v)乙醇浸润超声3h，收集过滤清液，重复如上操作，共提取3次。之后，集中收集全部的滤液，采用50℃减压旋转蒸发仪蒸发回收。最后，采用烘箱烘烤干燥直至提取物恒重，得到蜂胶乙醇提取物，将提取物保存于-20℃冰箱直至使用。

实施例2

(1)实验动物为雄性SPF级SD大鼠(45只，8周龄，体重190±20g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心，培养环境为12h光照+12h黑暗，温度23℃，相对湿度50％～70％，自由采食和饮水。

(2)大鼠在经过一周的适应性饲养后，随机分为5组：空白对照组(n＝5)；模型组(n＝10)；蜂胶低剂量组(n＝10，日粮中添加0.1％蜂胶)；蜂胶中剂量组(n＝10，日粮中添加0.2％蜂胶)；蜂胶高剂量组(n＝10，日粮中添加0.3％蜂胶)。日粮配方参考美国AIN-93M标准配方(表1)。

表1：动物日粮配方

(3)实验大鼠经过1周实验日粮饲喂后，开始疡性结肠炎的诱导。除空白对照组饮用蒸馏水外，其余40只大鼠饮用均饮用含3％DSS，持续7d。7d后替换为正常蒸馏水。DSS饮水开始后直到实验结束，进行大鼠疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)评估。每日观察2次，按表2标准根据体重下降、大便性状、隐血情况和动物总体状况评分相加，得出每只大鼠的疾病活动指数。

表2-1：疾病活动指数

¹整体状况包括：活力、行为、姿势等；

²评分解释:0＝正常；1＝轻微；2＝中度；3＝严重；

(4)经过7d恢复期后处死大鼠，取整段结肠测量长度，而后取1.5cm远端结肠组织样本采用10％福尔马林固定，并采用石蜡包埋，切片采用苏木精-伊红染色法对结肠组织进行染色。切片在尼康光学显微镜(Nikon eclipse 80i)下观察并拍照。

结果发现：

(1)蜂胶对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎疾病活动指数的影响结果见附图1。由图可见，与正常对照组比，模型组大鼠从第4天开始出现明显的溃疡性结肠炎症状，包括精神状态下降、腹泻、便血等症状，DSS开始后第8天DAI指数达到高峰。与DSS模型组相比，0.2％和0.3％蜂胶处理即对大鼠疾病活动指数有一定影响。造模第7天起，0.3％蜂胶处理组即能显著降低大鼠疾病活动指数。

(2)蜂胶对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎结肠长度的影响结果见附图2。由图可见，与正常对照组比，模型组大鼠结肠长度减短。与DSS模型组相比，0.3％蜂胶处理组即能显著提升大鼠的结肠长度。

(3)各组大鼠结肠组织切片如附图3所示，光镜结果表明，与对照组完整结肠黏膜结构相比，DSS可对肠粘膜造成严重影响，黏膜和黏膜下层多处可见溃疡及炎性渗出物，并伴随着水肿和大量中性粒细胞浸润。与DSS组相比，0.3％蜂胶干预可使大鼠结肠上述病理症状有着明显程度的减轻。结肠黏膜腺体排列整齐，肉眼少见水肿，基本未见溃疡和炎性渗出物。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。