本发明属于组织工程皮肤技术领域，涉及一种复合组织工程皮肤的构建方法。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，几乎覆盖全身，具有复杂的结构和功能。然而，作为人体与环境接触的第一道屏障，皮肤却极易受到损害。各类疾病如大面积烧伤、创伤、慢性皮肤溃疡及瘢痕切除等均可造成皮肤缺损，需要采用不同方法进行修复。人体本身具有一定的修复能力，可实现受损皮肤结构和功能不同程度的自我恢复。但当皮肤受损面积大、受损程度严重时，必须借助外科手术才可保证皮肤结构与功能的重建。
皮肤移植需要足够的皮源，自体移植与异体移植都具有一定的局限性，组织工程皮肤的出现解决了这个问题。皮肤组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理和技术，以修复和重建受损皮肤结构与功能为目的的一门学科，主要包括支架材料的制备、种子细胞的体外培养与扩增、人工皮肤的复合构建与移植。支架材料作为细胞外基质，为种子细胞提供获取营养、气体交换、新陈代谢的环境，在皮肤组织工程的构建中起着关键作用。适宜的支架材料不仅有利于种子细胞的增殖、分化，而且也影响获得的组织工程产品能否与机体良好结合及发挥效应。到目前为止，实验室培植的人工皮肤支架材料的各方面功能都不及正常皮肤，导致术后很容易再次撕坏，随着伤口的愈合，还可能出现瘢痕挛缩，导致更多次的手术。
脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix，ADM)是去除了可以引发宿主排斥反应的细胞成分和可溶性蛋白，从而最大限度降低免疫原性，但却完整地保留了细胞外基质中纤维网络的天然形态结构和组成成分。ADM力学性能好，抗原性低，成分、结构与正常细胞生长的微环境极其相似，是目前最有应用前景的支架材料。羊皮来源广泛，在皮肤结构、生物性状方面与人皮肤相似，且皮肤胶原种属差异性较小，不易被异体/异种免疫系统作为异体识别，适宜用作人体组织的修复与重建。
在组织工程皮肤的构建过程中，需要在支架材料上种植高密度的、具有增殖活力的种子细胞。皮肤干细胞是目前引起广泛关注的一类成体干细胞，当皮肤因外伤、疾病等原因导致损伤时，皮肤干细胞会及时增殖分化生成相关细胞，从而修复机体受损结构。利用皮肤干细胞的增殖分化特性制备人工皮肤，是目前重要的研究方向，其中，表皮干细胞(epidermal stem cells，ESCs)因具有较大的增殖和分化潜能成为近年来研究的重点之一。表皮干细胞是角质形成细胞中增殖能力最强的细胞，是潜在的多能干细胞。ESCs是皮肤组织特异性干细胞，增殖能力强，可以增殖分化为各种表皮细胞，具有维持表皮自我更新、保持正常表皮结构以及促进创面修复等作用，是皮肤发生、修复、重塑的关键性源泉，以其作为种子细胞构建组织工程皮肤，可获得与生理皮肤相类似的组织结构。
尽管目前已有许多组织工程皮肤应用于临床，但仍存在着诸多问题需要解决。如用于构建人工皮肤的种子细胞的分离、培养所需时间长，不能与临床应用相适应；目前所构建的真皮支架的生物相容性及三维孔隙结构与正常真皮基质相比还相差甚远；用于临床的复合皮肤虽能一次性覆盖皮肤缺损创面，但带有皮肤附属结构的人工皮肤仍在研究中等。随着各学科的发展，人工皮肤的研制和应用也将得到进一步的发展与完善，所面临的各个问题也将逐一被解决。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种复合组织工程皮肤的构建方法，以本发明方法构建的复合组织工程皮肤具有理想的三维立体网状结构，更接近于天然皮肤结构。
为实现上述目的，本发明采用人表皮干细胞作为种子细胞，羊脱细胞真皮基质作为支架载体，利用气液界面分离法体外培养构建复合组织工程皮肤。
具体地，本发明所述复合组织工程皮肤的构建方法是以Disapse—胰蛋白酶两步消化法从人源性皮肤中分离培养表皮干细胞，以高渗盐—NP-40—胰蛋白酶-EDTA法制备羊脱细胞真皮基质支架，将培养的表皮干细胞接种于羊脱细胞真皮基质支架上，气液界面分离培养构建复合组织工程皮肤。
更具体地，本发明是按照下述步骤构建所述复合组织工程皮肤。
1）表皮干细胞作为种子细胞的分离、培养。
以生理盐水将剔除脂肪及皮下组织的人源性皮肤清洗干净后，浸入DisapseⅡ中4℃消化；分离出表皮皮片置于胰蛋白酶-EDTA消化液中常温消化，血清终止消化；过滤，离心弃上清，培养基重悬细胞；将重悬细胞接种在预先包被有0.5g/L IV型胶原的培养皿内，置于体积分数5% CO2、37℃孵箱中培养15min，吸掉未贴壁细胞，保留贴壁细胞，重新加入培养基进行培养，待细胞长至70%～80%满时，进行传代培养；收集1～5代培养的表皮干细胞作为种子细胞。
2）羊脱细胞真皮基质支架的制备。
将除去皮下组织、保留表皮与真皮部分的羊皮浸入1mmol/L NaCl溶液中，振荡24h脱去表皮；再加入到NP-40中，常温下摇床持续震摇24h，脱去残余细胞及碎片；浸入胰蛋白酶-EDTA消化液中常温消化20min，取出，以PBS缓冲液反复冲洗，得到羊脱细胞真皮基质支架。
3）复合组织工程皮肤的构建。
将培养好的表皮干细胞接种在羊脱细胞真皮基质支架上，用培养基将真皮基质支架完全浸没，于37℃、体积分数5% CO2培养箱中培养1周后，转移至网架上，添加新鲜培养基，使培养基液面与真皮基质支架底部平齐，从而使表皮干细胞部分暴露于空气中，气液界面分离培养1周，得到复合组织工程皮肤。
本发明上述构建方法中，所使用的胰蛋白酶-EDTA消化液是含0.01wt% EDTA的0.125wt%胰蛋白酶消化液。
本发明上述构建方法中，所使用的培养基是含体积分数10%胎牛血清的K-SFM培养基。
本发明上述构建方法中，作为种子细胞用于构建复合组织工程皮肤的表皮干细胞的传代代数一般为1～5代。作为优选，本发明使用的种子细胞是传代代数未2～3代的表皮干细胞。
本发明上述构建方法中，构建复合组织工程皮肤所用表皮干细胞适宜的接种密度为1×104/cm2～1×109/cm2。优选地，本发明使用的表皮干细胞接种密度为1×106/cm2。
本发明上述构建方法中，所涉及到的在培养基中培养表皮干细胞的过程中，均应每2～3天更换一次新鲜培养基。
本发明所述构建方法的特点之一是表皮干细胞分离培养使用的消化液中胰蛋白酶含量低，减少了胰蛋白酶对细胞的损伤。同时，采用胰蛋白酶与EDTA混合，EDTA可以螯合Ca2+，抑制Ca2+依赖型钙粘蛋白介导的细胞间的黏附，缩短了消化时间。胰蛋白酶浓度的降低，也减少了中和血清的用量，从而降低了血清对表皮干细胞分化的影响。进而，本发明采用常温消化，进一步降低了胰蛋白酶的活性。
本发明所述构建方法的特点之二是利用了表皮干细胞对IV型胶原的黏附速度比其他细胞快的特点，快速分离出了表皮干细胞。本发明所述构建方法中，使用的IV型胶原的浓度为0.25～0.5g/L，优选地，所用的IV型胶原的浓度为0.5g/L。
本发明所述构建方法的特点之三是利用NP-40非离子性去垢剂来洗脱羊皮细胞。单用胰蛋白酶对羊皮细胞的洗脱效果较差，但胰蛋白酶处理联合非离子性去垢剂NP-40，能有效溶解膜蛋白，达到更好的脱细胞效果。且与SDS和Triton X-100相比，NP-40的性状温和，能够有效保留细胞外基质中的生长因子成分。
本发明所述构建方法的特点之四是采用气液界面体外培养技术，模拟在体条件，使表皮细胞处于气液分离的界面上，实现逐步分化的状态，使人工皮肤培养技术成为可能。
本发明所述构建方法的特点之五是利用异种羊皮进行脱细胞处理作为支架材料，拓展和丰富了猪脱细胞真皮基质支架以外的其它种属脱细胞支架的应用。且羊皮来源广泛，适用于特殊人群(穆斯林)。
本发明所构建的复合组织工程皮肤具有理想的三维立体网状结构，能促进细胞生长和形成新的胶原纤维，构建时间短，组织学结构完整，更接近于天然皮肤，达到了组织工程皮肤形态学的要求。
本发明复合组织工程皮肤原料来源广泛，在临床应用中有巨大潜能。
具体实施方式
下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：表皮干细胞的分离、培养和鉴定。
种子细胞来源于小儿包皮环切手术或烧伤整形植皮手术的剩余皮片。
无菌条件下，将皮片尽可能彻底地剔除掉脂肪及皮下组织后，以生理盐水反复清洗干净，剪成2mm×2mm大小，浸入5g/L DisapseⅡ中，4℃下消化16～18h。将表皮与真皮分离，挑出表皮皮片置于含0.01wt% EDTA的0.125wt%胰蛋白酶消化液中，室温下消化15min，血清终止消化。过滤，离心(1000rpm，5min)后弃上清，用含10wt%胎牛血清的K-SFM培养基作为表皮干细胞培养基悬浮细胞。将重悬细胞以4×105个/ml的浓度接种在预先包被有0.5g/L IV型胶原的培养皿内，置于5% CO2、37℃孵箱中培养15min，吸掉未贴壁的细胞，保留贴壁细胞，重新加入新的表皮干细胞培养基进行培养，培养期间2天更换一次培养基。
待细胞长至70%～80%满时，进行传代培养，最终得到第2代表皮干细胞。
表皮干细胞形态观察：将原代培养及第二次传代培养得到的表皮干细胞置于倒置显微镜下观察细胞生长形态。3天后，有部分细胞形成较小克隆，胞体紧密相靠，胞膜互相衔接，呈典型“铺路石样”生长，是典型的表皮干细胞生长形态。
表皮干细胞鉴定：取增殖活力好的传代培养的第2代表皮干细胞进行细胞爬片，免疫组化染色检测表皮干细胞的K19和β1整合素表达，并以同一标本培养的角质形成细胞做对照。结果显示95%以上的细胞K19和β1整合素阳性表达，呈棕黄染色，表明该细胞为表皮干细胞。
实施例2：羊脱细胞真皮基质支架的制备。
选用健康成年白羊的羊皮，除去皮下组织，保留表皮与真皮部分，并去除皮肤中的毛发成分，制成0.4mm厚的皮片。将皮片裁剪成3cm×3cm 大小的方块状，取小方块浸入1mmol/L NaCl溶液中，37℃恒温振荡24h脱去表皮，以PBS缓冲液反复冲洗干净。再加入到0.1wt%的NP-40中，常温下摇床持续震摇24h，脱去残余的细胞及其碎片后，以PBS缓冲液反复冲洗干净。然后再浸入0.25wt%的胰蛋白酶-EDTA消化液中20min，用PBS缓冲液中反复冲洗干净，得到羊脱细胞真皮基质支架。
得到的羊脱细胞真皮基质支架储存于无菌PBS缓冲液中，密封，4℃保存，或置于-80℃超低温冰箱中保存。
扫描电镜观察：取脱细胞真皮基质支架，以0.1mol/L PBS缓冲液清洗后，固定于2wt%多聚甲醛与2.5wt%戊二醛中，乙醇梯度脱水，用加有无水CaCl2的丙酮脱水3次，再用加有无水CaCl2的乙酸异戊酯置换3次后，放置在样品盒中临界点干燥，真空喷金。扫描电镜下观察显示，未见细胞成分残存，胶原纤维保持良好的天然三维网络结构。
将羊脱细胞真皮基质支架的石蜡切片以苏木精-伊红染色后，显示表皮已去除，真皮内未见细胞、细胞碎屑存在，可见细胞外基质样结构存在，胶原完整，排列规则。
实施例3：复合组织工程皮肤的构建。
将实施例2制备的羊脱细胞真皮基质支架真皮面朝上，平铺在35mm培养皿内，取实施例1扩增的第2代增殖力强的表皮干细胞，用胰蛋白酶消化20min，血清终止，以1×106/cm2的密度接种于上述铺好的羊脱细胞真皮基质支架上，添加足量含体积分数10%胎牛血清的K-SFM培养基，使真皮基质支架完全浸没，于37℃、5% CO2培养箱中浸没式培养1周，期间每2天换液一次。之后，将浸没式培养得到的组织工程皮肤转移至不锈钢网架上，添加新鲜的含体积分数10%胎牛血清的K-SFM培养基，使培养基的液面与真皮基质支架底部平齐，从而使表皮干细胞部分暴露于空气中，气液界面分离培养，每2天换液一次，继续培养1周左右，得到复合组织工程皮肤。
倒置显微镜下连续观察，开始培养基清澈透明无污染，并可见真皮基质支架周围细胞增殖明显，培养2～3天后，培养基变黄，提示细胞增殖代谢旺盛。
分别对浸没式培养和气液分离培养的工程皮肤进行苏木精-伊红染色检测。浸没式培养1周时，脱细胞真皮基质支架表面覆盖一层融合的表皮细胞，但很薄，细胞分层少，以后表皮逐渐增厚。将样品转至气液分离界面再培养1周后观察可见，表皮干细胞分裂增殖为多层，并与真皮的胶原纤维紧密连接，具有理想的三维立体网状结构，组织学结构完整，更接近于天然皮肤，达到了组织工程皮肤形态学的要求。