本发明涉及医疗器械技术领域，具体为一种长效促愈合人工皮肤及其制备方法。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，具有保持人体内水分、防止过度散热、透气和防止细菌侵袭的功能。如果仅是皮肤的浅层或是小面积受损，新皮肤会自体得以再生，但如果受到严重的创伤，皮肤就不能靠自己修复，通常须将身体其他部位的表层皮肤或人工皮移植到伤口上。
先进的人工皮肤大多具有表皮层和真皮层，当其植入损伤部位后，半渗透的表皮层能起到保护、透气和防止细菌侵袭等作用。而真皮层具有三维多孔支架结构，在术后几周后，随着支架不断降解，成纤维细胞和毛细血管长入三维结构，在充足的血供条件下，长入的细胞保持高的活力，细胞分泌出胶原蛋白，真皮得以重建。但现有技术所制备的人工皮肤中真皮层降解速度无法很好的满足成纤维细胞和毛细血管的长入速度，有的降解过快导致真皮层三维结构过早坍塌，而有的降解过慢不利于创面部位的修复重建。因此，人工皮肤需要构建一个降解速度可以很好匹配创面修复速度的真皮层。除此之外，现有人工皮肤促进伤口愈合效果较差，无法达到持久促进伤口愈合的目的。
因此，新型的人工皮肤不仅需要具有三维多孔结构的真皮层以及透气的表皮层，而且还需要真皮层降解速度匹配创面部位修复重建速度以及持久促进伤口愈合。
技术实现要素：
本发明的内容在于提供一种长效促愈合人工皮肤及其制备方法，以解决现有的技术缺陷。
本发明的技术方案一如下：一种长效促愈合人工皮肤，包括真皮层和表皮层，所述真皮层为由胶原和丝素蛋白组成并通过冷冻干燥而成的海绵状体，所述真皮层还均匀分布着负载生长因子的微球，所述表皮层由分布有孔的硅酮凝胶层组成，所述硅酮凝胶层由硅酮胶和固化剂组成，所述孔的孔径为1μm~3μm，所述固化剂为铂络合物，所述微球是由聚乳酸通过乳化-溶剂挥发法制备而成。
优选的，所述真皮层为三维多孔结构，所述三维多孔结构的孔隙率为80%~90%，孔径为50μm~150μm。
优选的，所述真皮层中胶原和丝素蛋白的质量比为3~1:1。
优选的，所述微球的粒径为0.5μm~1.5μm，所述生长因子为表皮生长因子（EGF）、真皮细胞生长因子（DGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）中的两种或两种以上。
优选的，所述聚乳酸由D,L-聚乳酸（PDLLA），聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）按照质量比1~2:1:1~2组成。
本发明的技术方案二如下：一种长效促愈合人工皮肤的制备方法，包括如下步骤：
S1：制备0.5mol/L的醋酸溶液：将醋酸采用去离子水进行稀释，获取0.5mol/L的醋酸溶液。
S2：制备胶原和丝素蛋白混合凝胶：在S1制得的0.5mol/L醋酸溶液中同时加入胶原和丝素蛋白，得到胶原/丝素蛋白混合凝胶。
S3：制备负载生长因子的微球：将聚乳酸加入到三氯甲烷溶液中溶解，获得30mg/ml~70mg/ml聚乳酸溶液，将所述聚乳酸溶液与PBS缓冲溶液以体积比为10:1~5:1进行混合，将混合液涡旋振荡1min得到初乳，将初乳匀速加到处于搅拌状态下的聚乙烯醇溶液中，连续搅拌2~4小时后水浴加热挥发三氯甲烷，待其挥发完全后获得负载生长因子的微球，将所述负载生长因子的微球进行洗涤、过滤、真空干燥处理，所述的PBS缓冲溶液含有生长因子，其浓度为2μg/ml~10μg/ml。
S4：制备真皮层：将S3制得的负载生长因子的微球加入S2制得的胶原/丝素蛋白混合凝胶中，搅拌均匀，加入模具中，再经冷冻干燥后固化即得到三维多孔结构的真皮层，所述三维多孔结构的孔隙率为80%~90%，孔径为50μm~150μm。
S5：在S4制得的真皮层表面涂覆一层硅酮凝胶层，硅酮凝胶层由硅酮胶固化剂组成，硅酮胶和固化剂的质量比为5~8:1，所述固化剂为铂络合物。
S6：待硅酮凝胶层固化后，用激光打孔机进行打孔，即获得一种长效促愈合人工皮肤，所述孔在硅酮凝胶膜表面分布均匀，孔径的大小为1μm~3μm。
优选的，步骤S2中所述胶原/丝素蛋白混合凝胶浓度为10%~30%，其中胶原与丝素蛋白的质量比为3~1:1。
优选的，步骤S3中所述聚乳酸由D,L-聚乳酸（PDLLA），聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）按照质量比1~2:1:1~2组成。
优选的，步骤S3中所述胶原/丝素蛋白混合凝胶与负载生长因子的微球的质量比为5~3:1。
优选的，所述微球的粒径为0.5μm~1.5μm，所述生长因子为表皮生长因子（EGF）、真皮细胞生长因子（DGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）中的两种或两种以上。
本发明的有益效果为：
（1）方法简单，制备时间短，所需的原料来源丰富，价格低廉，生产成本低，长效促愈合人工皮肤由真皮层和表皮层组成，完全模拟人体皮肤结构；
（2）长效促愈合人工皮肤具有高的孔隙率、适宜真皮细胞长入的孔径尺寸以及良好的力学性能，促进细胞生长，伤口愈合；
（3）长效促愈合人工皮肤的真皮层中的胶原与丝素蛋白降解速度不同，根据需要可以调节胶原与丝素蛋白的混合比使得真皮层降解速度匹配创面部位修复重建速度，从而达到更快的促进伤口愈合的目的；
（4）长效促愈合人工皮肤的真皮层中负载生长因子的微球因其三个组分D,L-聚乳酸（PDLLA），聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）的降解速度不同，可以通过调节三者的比例达到按需释放生长因子来达到长效促进伤口愈合的目的。
具体实施例
实施例一：
一种长效促愈合人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备0.5mol/L的醋酸溶液：将醋酸采用去离子水进行稀释，获取0.5mol/L的醋酸溶液。
S2：制备胶原和丝素蛋白混合凝胶：在S1制得的0.5mol/L醋酸溶液中同时加入胶原和丝素蛋白，得到20%胶原/丝素蛋白混合凝胶，其中胶原与丝素蛋白的质量比为1:1。
S3：制备负载生长因子的微球：将D,L-聚乳酸（PDLLA），聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）三个组分按2:1:1加入10ml的三氯甲烷中搅拌获得50mg/ml聚乳酸溶液，将10ml 50mg/ml聚乳酸溶液与1ml 5μg/ml含有生长因子的PBS缓冲溶液进行混合，将混合液涡旋振荡1min得到初乳，将2ml初乳以30滴/分钟的速度滴加到处于搅拌状态下的4ml聚乙烯醇溶液中，连续搅拌3小时后水浴加热挥发三氯甲烷，待其挥发完全后获得负载生长因子的微球，将所述负载生长因子的微球进行洗涤、过滤、真空干燥处理。
S4：制备真皮层：将S3制得的负载生长因子的微球按质量比1:4加入S2制得的胶原/丝素蛋白混合凝胶中，搅拌均匀，加入模具中，再经冷冻干燥后固化即得到三维多孔结构的真皮层，其中三维多孔结构的孔隙率为80%，孔径为100μm。
S5：在S4制得的真皮层表面涂覆一层硅酮凝胶层，硅酮凝胶层由硅酮胶固化剂组成，硅酮胶和固化剂的质量比为5:1，所述固化剂为铂络合物。
S6：待硅酮凝胶层固化后，用激光打孔机进行打孔，即获得3D打印人工皮，所述孔在硅酮凝胶膜表面分布均匀，其中孔径的大小为2μm，即获得长效促愈合人工皮肤。
实施例二
一种长效促愈合人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备0.5mol/L的醋酸溶液：将醋酸采用去离子水进行稀释，获取0.5mol/L的醋酸溶液。
S2：制备胶原和丝素蛋白混合凝胶：在S1制得的0.5mol/L醋酸溶液中同时加入胶原和丝素蛋白，得到20%胶原/丝素蛋白混合凝胶，其中胶原与丝素蛋白的质量比为1:1。
S3：制备负载生长因子的微球：将D,L-聚乳酸（PDLLA），聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）三个组分按1:1:1加入10ml的三氯甲烷中搅拌获得50mg/ml聚乳酸溶液，将10ml 50mg/ml聚乳酸溶液与1ml 5μg/ml含有生长因子的PBS缓冲溶液中进行混合，将混合液涡旋振荡1min得到初乳，将2ml初乳以30滴/分钟的速度滴加到处于搅拌状态下的4ml聚乙烯醇溶液中，连续搅拌3小时后水浴加热挥发三氯甲烷，待其挥发完全后负载生长因子的微球，将所述负载生长因子的微球进行洗涤、过滤、真空干燥处理。
S4：制备真皮层：将S3制得的负载生长因子的微球按质量比1:4加入S2制得的胶原/丝素蛋白混合凝胶中，搅拌均匀，加入模具中，再经冷冻干燥后固化即得到三维多孔结构的真皮层，其中三维多孔结构的孔隙率为80%，孔径为100μm。
S5：在S4制得的真皮层表面涂覆一层硅酮凝胶层，硅酮凝胶层由硅酮胶固化剂组成，硅酮胶和固化剂的质量比为5:1，所述固化剂为铂络合物。
S6：待硅酮凝胶层固化后，用激光打孔机进行打孔，即获得3D打印人工皮，所述孔在硅酮凝胶膜表面分布均匀，其中孔径的大小为2μm，即获得长效促愈合人工皮肤。
实施例三
一种长效促愈合人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备0.5mol/L的醋酸溶液：将醋酸采用去离子水进行稀释，获取0.5mol/L的醋酸溶液。
S2：制备胶原和丝素蛋白混合凝胶：在S1制得的0.5mol/L醋酸溶液中同时加入胶原和丝素蛋白，得到20%胶原/丝素蛋白混合凝胶，其中胶原与丝素蛋白的质量比为1:1。
S3：制备负载生长因子的微球：将D,L-聚乳酸（PDLLA），聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）三个组分按1:1:2加入10ml的三氯甲烷中搅拌获得50mg/ml聚乳酸溶液，将10ml 50mg/ml聚乳酸溶液与1ml 5μg/ml含有生长因子的PBS缓冲溶液中进行混合，将混合液涡旋振荡1min得到初乳，将2ml初乳以30滴/分钟的速度滴加到处于搅拌状态下的4ml聚乙烯醇溶液中，连续搅拌3小时后水浴加热挥发三氯甲烷，待其挥发完全后负载生长因子的微球，将所述负载生长因子的微球进行洗涤、过滤、真空干燥处理。
S4：制备真皮层：将S3制得的负载生长因子的微球按质量比1:4加入S2制得的胶原/丝素蛋白混合凝胶中，搅拌均匀，加入模具中，再经冷冻干燥后固化即得到三维多孔结构的真皮层，其中三维多孔结构的孔隙率为80%，孔径为100μm。
S5：在S4制得的真皮层表面涂覆一层硅酮凝胶层，硅酮凝胶层由硅酮胶固化剂组成，硅酮胶和固化剂的质量比为5:1，所述固化剂为铂络合物。
S6：待硅酮凝胶层固化后，用激光打孔机进行打孔，即获得3D打印人工皮，所述孔在硅酮凝胶膜表面分布均匀，其中孔径的大小为2μm，即获得长效促愈合人工皮肤。
实施例四
一种长效促愈合人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备0.5mol/L的醋酸溶液：将醋酸采用去离子水进行稀释，获取0.5mol/L的醋酸溶液。
S2：制备胶原和丝素蛋白混合凝胶：在S1制得的0.5mol/L醋酸溶液中同时加入胶原和丝素蛋白，得到20%胶原/丝素蛋白混合凝胶，其中胶原与丝素蛋白的质量比为2:1。
S3：制备负载生长因子的微球：将D,L-聚乳酸（PDLLA），聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）三个组分按1:1:1加入10ml的三氯甲烷中搅拌获得50mg/ml聚乳酸溶液，将10ml 50mg/ml聚乳酸溶液与1ml 5μg/ml含有生长因子的PBS缓冲溶液中进行混合，将混合液涡旋振荡1min得到初乳，将2ml初乳以30滴/分钟的速度滴加到处于搅拌状态下的4ml聚乙烯醇溶液中，连续搅拌3小时后水浴加热挥发三氯甲烷，待其挥发完全后负载生长因子的微球，将所述负载生长因子的微球进行洗涤、过滤、真空干燥处理。
S4：制备真皮层：将S3制得的负载生长因子的微球按质量比1:4加入S2制得的胶原/丝素蛋白混合凝胶中，搅拌均匀，加入模具中，再经冷冻干燥后固化即得到三维多孔结构的真皮层，其中三维多孔结构的孔隙率为80%，孔径为100μm。
S5：在S4制得的真皮层表面涂覆一层硅酮凝胶层，硅酮凝胶层由硅酮胶固化剂组成，硅酮胶和固化剂的质量比为5:1，所述固化剂为铂络合物。
S6：待硅酮凝胶层固化后，用激光打孔机进行打孔，即获得3D打印人工皮，所述孔在硅酮凝胶膜表面分布均匀，其中孔径的大小为2μm，即获得长效促愈合人工皮肤。
实施例五
一种长效促愈合人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备0.5mol/L的醋酸溶液：将醋酸采用去离子水进行稀释，获取0.5mol/L的醋酸溶液。
S2：制备胶原和丝素蛋白混合凝胶：在S1制得的0.5mol/L醋酸溶液中同时加入胶原和丝素蛋白，得到20%胶原/丝素蛋白混合凝胶，其中胶原与丝素蛋白的质量比为3:1。
S3：制备负载生长因子的微球：将D,L-聚乳酸（PDLLA），聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）三个组分按1:1:1加入10ml的三氯甲烷中搅拌获得50mg/ml聚乳酸溶液，将10ml 50mg/ml聚乳酸溶液与1ml 5μg/ml含有生长因子的PBS缓冲溶液中进行混合，将混合液涡旋振荡1min得到初乳，将2ml初乳以30滴/分钟的速度滴加到处于搅拌状态下的4ml聚乙烯醇溶液中，连续搅拌3小时后水浴加热挥发三氯甲烷，待其挥发完全后负载生长因子的微球，将所述负载生长因子的微球进行洗涤、过滤、真空干燥处理。
S4：制备真皮层：将S3制得的负载生长因子的微球按质量比1:4加入S2制得的胶原/丝素蛋白混合凝胶中，搅拌均匀，加入模具中，再经冷冻干燥后固化即得到三维多孔结构的真皮层，其中三维多孔结构的孔隙率为80%，孔径为100μm。
S5：在S4制得的真皮层表面涂覆一层硅酮凝胶层，硅酮凝胶层由硅酮胶固化剂组成，硅酮胶和固化剂的质量比为5:1，所述固化剂为铂络合物。
S6：待硅酮凝胶层固化后，用激光打孔机进行打孔，即获得3D打印人工皮，所述孔在硅酮凝胶膜表面分布均匀，其中孔径的大小为2μm，即获得长效促愈合人工皮肤。
实施例六
为验证本发明长效促愈合人工皮肤是否达到预期的发明效果，对实施例一至实施例三得到的长效促愈合人工皮肤进行生长因子缓释实验。
检测方法：将实施例一至实施例三制得的0.1g 长效促愈合人工皮肤加入PBS缓冲溶液中，并放置于37℃、100rad/min下振荡1D、3D、5D、1W、2W和3W，然后在各时间点取PBS缓冲溶液，用紫外分光光度计检测生长因子的吸光度并根据生长因子的标准曲线计算各时间点缓释量。结果如下表1所示：
表1生长因子缓释试验结果
从上表可以看出，本发明制备的长效促愈合人工皮肤具有持久促愈合效果，而且从实施例六可以看出，当负载生长因子微球的三个组分D,L-聚乳酸（PDLLA），聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）质量比为1:1:1时，其缓释效果是最好的。
实施例六
对比例：真皮层组成成分为单独的丝素蛋白，不加胶原。
实验组：为实施例一的方法制备而成的长效促愈合人工皮肤。
将上述实施例一、实施例四和实施例五所制备的长效促愈合人工皮肤与对比例进行伤口修复实验，对比实验组和对比例对创面的修复效果。实验结果如表2所示：
表2 伤口修复实验结果
由上表可知，实施例中所制备的长效促愈合人工皮肤和对比例均能对伤口创面完整修复，但是与对比例相比，实施例一、实施例四和实施例五所需的时间明显较短，说明本发明所制得的长效促愈合人工皮肤具有明显的促进伤口愈合的作用，而且当真皮层中胶原与丝素蛋白的质量比为2:1时，其促进伤口愈合的作用最突出。
以上对本发明的特定实施例进行了说明，但本发明的保护内容不仅仅限定于以上实施例，在本发明的所属技术领域中，只要掌握通常知识，就可以在其技术要旨范围内进行多种多样的变更。