一种包载重组抗肿瘤蛋白TmSm的mPEG‑PLGA纳米颗粒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药技术领域，更具体地讲，涉及重组抗肿瘤蛋白TmSm的单甲氧基聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物(mPEG-PLGA)纳米颗粒的制备以及其作为肿瘤治疗药物的用途。

背景技术：

癌症是目前人类死亡率最高的疾病之一，由于癌细胞对放疗和化疗产生耐药性，以及容易转移等特性，使得癌症难以根治。在癌症的发生过程中，常伴有某些有利于癌细胞生长的蛋白过量表达。Survivin基因编码的survivin蛋白，是哺乳动物细胞中凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族最小的成员，在正常细胞中不表达，而在胚胎干细胞和肿瘤细胞中异常表达，并以同源二聚体形式存在。不同于IAP其他家族成员，survivin N端有一杆状病毒IAP重复序列(BIR)，由3股反平行β片层和4个α螺旋组成，C末端包含42个氨基酸，形成一个α螺旋。Survivin前体mRNA分子成熟结构包含4个主要功能区域和3个隐含外显子，通过不同的选择性剪接形成6种剪接异构体，编码6种不同的蛋白质，分别为Survivin、Survivin2B、Survivin3B、SurvivinΔEx3、Survivin3α和Survivin2α。

Survivin参与多种细胞进程，它的BIR区域在细胞有丝分裂过程中起重要作用。Survivin是迄今所发现的最强的凋亡抑制因子，它可通过抑制癌细胞中不同效应蛋白酶caspase的活性来干扰细胞凋亡。Survivin可结合X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)，形成复合物以抑制XIAP通过泛素蛋白酶体通路降解，并且能抑制Capase-9的活性。更多研究表明，survivin参与细胞自体吞噬，其下调会引起细胞凋亡。且survivin可与多种DNA损伤修复相关因子作用，从而协助核中DNA修复。Survivin蛋白具有细胞周期依赖性，其在G1期表达最低，S期含量上调，在G2/M期达最大值，提示Survivin在细胞分裂中发挥了一定的作用。核定位的Survivin与Aurora B kinase、INCENP和Borealin共同形成CPC(chromosomal passenger complex，染色体通道蛋白复合体)，在有丝分裂中，定位于染色体的着丝粒和中心纺锤体上，促进姐妹染色单体的分离并在分裂后期维持微管的稳定性，维持和促进了细胞的增殖。

利用survivin突变体的形式靶向survivin的方式称为survivin负显性突变体治疗。将survivin的第34位磷酸化位点由苏氨酸(Thr)突变为丙氨酸(Ala)后，即survivin(T34A)，废除survivin的磷酸化，导致survivin-caspase-9复合物的解离，从而激活caspase活性，导致细胞凋亡。本实验室利用HIV-TAT可以转导蛋白的特性设计了TATm-Survivin(T34A)融合蛋白即TmSm。目前，TmSm注射剂多采用冻干技术以提高药物的稳定性，但是TmSm粉针剂用药剂量较大，需要频繁用药。关键因素是生物活性物质稳定性差，难以大量富集到达肿瘤部位发挥作用。因此，要解决这个问题需引入控、缓释制剂的应用。目前，主要包括脂质体、微球、微囊注射剂、皮下埋植给药剂型、智能型给药系统和纳米技术。可生物降解的合成聚合物材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]是以聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸(PLA)为原料合成的，PLA的亲水性较差，降解慢，PGA的亲水性好，降解快，而PLGA可把两种原料的性质加以综合完善，是目前最好的生物可降解聚合物之一，因其制备的纳米颗粒具有良好的性能而备受关注，如：1)生物降解和生物相容性；2)良好的配方和生产方法，适应不同种类的药物，如疏水或亲水性小分子或大分子药物；3)在注射给药的药物传输系统方面得到美国食品及药物管理局(FDA)和欧洲药物管理局(EMA)的批准；4)可保护药物不被降解；5)可持续缓释；6)可进行表面修饰定向传递等。为了控制药物释放，可以使聚合物混合或使用不同的添加剂。例如，结构中包括至少两种不同族群的二聚体和三聚体，既有疏水性又有亲水性，这种结构在控制药物释放中医已赢得越来越多的关注。其中PEG-PLGA显示了很好的特性。聚乙二醇(PEG)的加入，会抑制血清蛋白的吸附，降低细胞识别的程度，改进载药系统的生物相容性，同时有效减少免疫原性和毒性。

PLGA纳米粒的制备方法有：乳化-蒸发法、盐析法、纳米沉淀法、错流过滤法、乳化-溶剂挥发法等。然而当采用某些方法制备纳米粒子时，却遇到一些问题，如使用有毒性的有机溶剂(乳化-蒸发法)、使用与生物不相容的活性化合物稳定剂和盐(盐析法)以及较低的产率和包封率(纳米沉淀法)，同时，这些方法也很难降低纳米粒子的大小，无法制备出粒径小于100nm的纳米粒子。通过高效和可再生的方式将预成型的聚合物用乳化-溶剂挥发法成功制备出纳米颗粒。目前，制备PLGA纳米粒最常用的方法是乳化-溶剂挥发法，该方法主要分两步进行，即乳液的制备和溶剂的挥发。常常是根据包载药物的性质制成W/O、O/W、W/O/W、O/W/O型乳状液。W/O/W双乳化溶剂挥发是目前制备水溶性药物、多肽、蛋白质等常用的方法。将水溶性药物分散于含PLGA等载体的有机相中，形成W/O型初乳，再分散外水相中形成W/O/W型乳，最后再除去有机溶剂即可。对O/W乳化方法进行改进的双乳化技术(W/O/W)，可用来包裹一些亲水性药物，如多肽类、蛋白质、核酸。首先，配制含有有机相溶剂的常见O/W乳化液体系，继续向体系中加入水使有机溶剂扩散到外相水中，形成纳米颗粒。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种包载重组抗肿瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA纳米颗粒。

本发明的第二个目的在于提供包载重组抗肿瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA纳米颗粒的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供包载重组抗肿瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA纳米颗粒的应用。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种包载重组抗肿瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA纳米颗粒，其特征在于，用下述制备方法制备获得：

(1)将mPEG-PLGA溶于乙酸乙酯中，将TmSm 1-10％PEG水溶液加入到PLGA溶液中，冰浴条件下超声，形成油包水型乳液；

(2)将获得的油包水型乳液加入到PVA水溶液中，将上述混合液引入高压均质机进行2-4个周期，即形成水包油包水型复乳液；

(3)在室温常压下磁力搅拌，挥发有机溶剂乙酸乙酯；

(4)将固化的纳米粒通过低温高速离心收集，超纯水清洗，洗净纳米粒表面的PVA，将离心的上清液进行收集；

(5)将上述清洗的沉淀用蔗糖重悬，先-20℃冷冻半小时，再置于-80℃过夜冷冻，最后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，去除纳米粒中的水分后，得到纳米粒成品，4℃环境下冷藏。

作为一个优选方案，TmSm与mPEG-PLGA的质量比为1：62.5。

作为一个优选方案，纳米粒粒径为181.0±0.8nm，Zeta电位分别为-26.3±0.4mV，多分散指数为0.122±0.016。

作为一个优选方案，纳米粒包封率为53.61±2.08％，载药量为8.58±0.33μg/mg。

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：一种包载重组抗肿瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将mPEG-PLGA溶于乙酸乙酯中，将TmSm 1-10％PEG水溶液加入到PLGA溶液中，冰浴条件下超声，形成油包水型乳液；

(2)将获得的油包水型乳液加入到PVA水溶液中，将上述混合液引入高压均质机进行2-4个周期，即形成水包油包水型复乳液；

(3)在室温常压下磁力搅拌，挥发有机溶剂乙酸乙酯；

(4)将固化的纳米粒通过低温高速离心收集，超纯水清洗，洗净纳米粒表面的PVA，将离心的上清液进行收集；

(5)将上述清洗的沉淀用蔗糖重悬，先-20℃冷冻半小时，再置于-80℃过夜冷冻，最后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，去除纳米粒中的水分后，得到纳米粒成品，4℃环境下冷藏。

作为一个优选方案，TmSm与mPEG-PLGA的质量比为1：62.5。

为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：包载重组抗肿瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

作为一个优选方案，所述肿瘤是指胰腺癌。

作为一个优选方案，当肿瘤是胰腺癌时，有效剂量为3-100mg mg/mLTmSm-PLGA。

本发明制备获得的纳米粒的包封率为53.61±2.08％，载药量为8.58±0.33μg/mg。；该纳米粒粒径为181.0±0.8nm，Zeta电位分别为-26.3±0.4mV，多分散指数为0.122±0.016。

本发明载体材料为mPEG-PLGA。其中，PLGA是可生物降解的合成聚合物材料，由于其无毒、成球性好、化学稳定性高、具有控制释放能力等特点被广泛用作纳米给药系统的载体。在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。mPEG亲水基团可以有效避免内皮网状系统的捕获，体内循环系统中的滞留时间明显延长，能稳定地释放药物。

本发明有机溶剂为乙酸乙酯。作为注射颗粒，利用的乙酸乙酯相对于二氯甲烷，毒性较低。

本发明的优点在于：兼具TmSm的抗肿瘤功效和mPEG-PLGA的生物降解性优良、组织相容性好、降解产物不会在重要器官聚集的特点，促进肿瘤细胞凋亡；同时本发明可以有效提高药物疗效，减少药物刺激，降低毒副作用，延长药物作用时间实现长效缓释，增加药物的稳定性。因此，作为生物大分子药物的靶向递送有着更为广阔的应用前景。本发明的mPEG-PLGA纳米颗粒制备方法简单，适宜大规模连续生产。

附图说明

图1为重组蛋白TmSm纯化SDS-PAGE图。其中，泳道M：Marker；泳道1：诱导前菌液；泳道2：诱导后菌液；泳道3：细胞破碎后上清；泳道4：细胞破碎后沉淀；泳道5：超声洗涤后包涵体；泳道6：一次洗涤后包涵体；泳道7：二次洗涤后包涵体；泳道8：三次洗涤后包涵体；泳道9：溶解包涵体。

图2为阳离子交换柱SP Sepharose FF柱复性色谱图。

图3为重组蛋白TmSm包涵体柱上复性SDS-PAGE图。其中，泳道M：Marker；泳道1：SP上柱前(溶解后包涵体)；泳道2：流穿液；泳道3：A冲洗峰；泳道4：SP下柱后。

图4为RP-HPLC法检测TmSm蛋白纯度色谱图。

图5为复乳-溶剂挥发法结合高压均质制备TmSm-PLGA-NPs流程图。

图6为载TmSm的mPEG-PLGA纳米颗粒的SDS-PAGE图。其中，泳道M：Marker；泳道1：空白PLGA纳米粒；泳道2：33.3mg/mL TmSm-PLGA纳米粒；泳道3：66.7mg/mL TmSm-PLGA纳米粒；泳道4：0.150mg/mL TmSm。

图7为空白PLGA-NPs和TmSm-PLGA-NPs冻干图。其中，A：空白PLGA-NPs冻干前；B：空白PLGA-NPs冻干后；C：TmSm-PLGA-NPs冻干前；D：TmSm-PLGA-NPs冻干后，每一组第一个瓶子为超纯水，后面四个瓶子为1％蔗糖。

图8为空白PLGA-NPs和TmSm-PLGA-NPs透射电镜图。其中，A：空白PLGA-NPs透射电镜图；B：TmSm-PLGA-NPs透射电镜图。

图9为空白PLGA-NPs和TmSm-PLGA-NPs粒径分布和Zeta电位图。其中，A：空白PLGA-NPs粒径分布图；B：空白PLGA-NPs Zeta电位图；C：TmSm-PLGA-NPs粒径分布图；D：TmSm-PLGA-NPs Zeta电位图。

图10为TmSm-PLGA-NPs的载药量和包封率的测定结果。

图11为37℃时PLGA载药体系中TmSm在不同pH条件下(7.4，6.5，5.0)的释放情况。

图12为Blank PLGA和TmSm-PLGA纳米粒对SW1990的细胞存活。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.重组蛋白TmSm的表达、纯化及指标检测

试剂与试剂盒：异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl B-D-I-Thiogalactopyranoside，IPTG)、氨苄青霉素购自Sigma-Aldrich公司(美国)，SP Sepharose FF阳离子交换柱购置于GE公司(美国)，蛋白分子量标准品Premixed Protein Marker(Low)，蛋白上样缓冲液4×Protein SDS PAGE Loading Buffer，购置于宝生物工程有限公司(大连)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。

菌株和质粒：

E.coli BL21(DE3)(Invirogen，USA)作为质粒表达菌株。重组质粒pRSET-B-TATm-Survivin(T34A)为本实验室所构建。

试剂配制：

氨苄青霉素(Amp)母液(50mg/mL)配制：用电子天平准确称量氨苄青霉素粉剂0.5g，加入10mL超纯水定容，充分溶解，将溶液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，每1mL分装1支，-20℃保存，备用。培养大肠杆菌时，每1mLLB培养基中加入1μL氨苄青霉素溶液(1：1000)。终浓度为50μg/mL。

异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)母液(1M)配制：用电子天平准确称量2.38g IPTG溶解于10mL超纯水中，配制成238mg/mL的水溶液，用0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，分装1mL/支，-20℃保存，备用。诱导时每1mL LB培养基中加入1μL IPTG母液。终浓度为1mmol。

LB培养基的配制：根据《分子克隆实验指导》配制每升培养基中加入950mL去离子水，10g蛋白胨，10g NaCl，5g酵母膏，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/L NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1L。随后121℃高压灭菌20min。

5×蛋白电泳缓冲液(Tris-甘氨酸)：称取Tris碱15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加双蒸水定容至1L。

15％蛋白电泳分离胶：量取ddH₂O 2.3mL，30％丙烯酰胺5.0mL，Tris-HCI(pH 6.8)2.5mL，10％SDS 100μL，10％APS 100μL，TEMED 100μL，混合均匀。

5％蛋白电泳浓缩胶：量取ddH₂O 3.15mL，30％丙烯酰胺0.75mL，Tris-HCI(pH 6.8)0.57mL，10％SDS 45μL，10％APS 45μL，TEMED 4.5μL，混合均匀。

考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝(R-250)2g，量取乙醇200mL，冰醋酸100mL，去离子水750mL，滤纸过滤，室温保存。

PBS缓冲液：8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄，定容至1L，用NaOH溶液或浓HCl溶液调pH至7.4，倒入HT瓶中，盖上盖子(但不拧紧)，在121℃下灭菌20min，拧紧封口，备用。

0.2M pH6.5磷酸盐缓冲母液(PB)：根据《分子克隆第二版》配制，先配制0.2mol/L Na₂HPO₄ 1L，称取28.392g Na₂HPO₄(Mw＝141.96)，用超纯水定容至1L。配制0.2mol/L NaH₂PO₄ 1L，称取27.598g NaH₂PO₄.H₂O(Mw＝137.99)，用超纯水定容至1L。Na₂HPO₄和NaH₂PO₄按31.5mL：68.5mL的比例混合。

20mmol/L pH6.5磷酸盐缓冲液(PB)：取100mL 0.2mol/L pH6.5磷酸盐缓冲母液(PB)，用超纯水定容至900mL，通过pH仪用NaOH溶液或H₃PO₄溶液调节pH至6.5(初始为pH 6.47)，倒入HT瓶中，盖上盖子(但不拧紧)，在121℃下灭菌20min，拧紧封口，备用。

超声裂解液：20mmol/L PB，50mmol/L NaCl。量取500mL 20mmol/L PB，称取1.461g NaCl溶解，通过pH仪用NaOH溶液或H₃PO₄溶液调节pH至6.5。

包涵体洗涤液：20mmol/L PB，50mmol/L NaCl，2mol/L尿素，pH 6.5。量取500mL 20mmol/L PB，称取1.461g NaCl，60.06g尿素溶解。通过pH仪用NaOH溶液或H₃PO₄溶液调节pH至6.5。

包涵体洗涤液：20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，0.5％Triton X-100，0.5mol/L尿素，1mol/L氯化钠，2.5mmol/L EDTA，pH10.0。

包涵体溶解液：20mmol/L PB，50mmol/L NaCl，8mol/L尿素，pH 6.5。量取500mL 20mmol/L PB，称取1.461g NaCl，240.24g尿素溶解。通过pH仪用NaOH溶液或H₃PO₄溶液调节pH至6.5。

SP Sepharose FF阳离子交换层析缓冲液：

缓冲液A：20mmol/L pH6.50磷酸盐，8mol/L尿素，pH6.50。100mL配制方法：取10mL的0.2mol/L pH6.50的磷酸盐缓冲液，加入双蒸水40mL，加入48g的尿素充分溶解后，定容至100mL。而后加入微量的磷酸调节pH至6.50，过微滤膜后使用。

缓冲液B：20mmol/L pH6.50磷酸盐，2mol/L尿素，pH6.50。100mL配制方法：取10mL 0.2mol/L pH6.50的磷酸盐缓冲液，加入双蒸水30mL，再加入12g的尿素溶解后定容至100mL，并用少量的浓NaOH溶液调节pH至6.50，过微滤膜后使用。

缓冲液C：20mmol/L pH6.50磷酸盐，2mol/L尿素，1mol/L NaCl缓冲液，pH6.50。100mL配制方法：取10mL的0.2mol/L pH6.50的磷酸盐缓冲液，加入双蒸水30mL，而后加入5.844g NaCl溶解后，再加入12g尿素溶解，定容至100mL后用少量的浓NaOH溶液调节pH至6.50，过膜后使用。

透析液A：20mmol/L PB，2mol/L尿素，1mol/L NaCl，10％甘油，1mmol/L精氨酸，pH 6.5。

透析液B：20mmol/L PB，1mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，10％甘油，1mmol/L精氨酸，pH 6.5。

透析液C：20mmol/L PB，0.25mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，10％甘油，1mmol/L精氨酸，pH 6.5。

Bradford法测蛋白浓度相关溶液：

BSA蛋白标准液(mg/mL)：将10mg BSA溶解于10mL无菌水中，分装成1mL每管。

Bradford工作液：准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，加入50mL 95％的乙醇，100mL 85％的磷酸，用去离子水定容至1L，棕色瓶避光保存。常温可放置一个月。

RP-HPLC法测蛋白纯度：

缓冲液A：0.08％TFA乙腈：水＝5:95，过微滤膜。

缓冲液B：0.1％TFA乙腈：水＝95:5。

缓冲液C：纯乙腈。三种缓冲液进行超声，除去气泡。其中TFA为三氟乙酸。

重组蛋白TATm-Survivin(T34A)在大肠杆菌中的表达：从-20℃中取出保藏的菌BL21/pRSET-B-TATm-Survivin(T34A)，取50μL菌液置于5mL的含10μL50mg/mL Amp(100μg/mL)LB培养基的LB培养基中，37℃，200rmp，过夜培养；取过夜培养的菌液1mL于100mL含200μL 50mg/mL Amp(100μg/mL)的LB培养基摇瓶中，37℃，200rmp培养3.5h左右，(取1mL菌液用于SDS-PAGE)至OD600＝0.6左右，加IPTG(75μL)(终浓度为0.75mmol/mL)后转入30℃，200rmp培养4h；4h后，收集菌液(1mL)，用SDS-PAGE电泳鉴定产物表达情况，证明目的蛋白成功表达，结果如图1所示。

菌体破碎及包涵体洗涤：将培养液4℃，8000rmp离心10min，获得湿菌体；湿菌体用10mL细胞破碎液重悬，4℃，8000rmp离心10min；将湿菌体用细胞破碎液重悬，倒入高压均质机中，1000mpa压力下破碎菌体(破碎3次)；将破碎的菌体4℃，10000rmp离心15min，弃去上清，收集沉淀，得到的沉淀为粗包涵体(在上清液和沉淀中分别取样，用于SDS-PAGE)；将粗包涵体重悬于10mL包涵体洗涤液中洗涤，冰浴下400rmp搅拌10min。洗涤后于12000rpm，4℃下离心10min，弃去上清，收集沉淀。重复此步3次，收集沉淀为精制包涵体；将精制包涵体溶解于10mL包涵体溶解液中，冰浴下400rmp搅拌4h，于12000rpm，4℃下离心20min，去掉少量不溶物，上清即为溶解的包涵体，于4℃保存。

SP Sepharose FF柱上复性：将5mL SP Sepharose FF预装柱，以阳离子上柱缓冲液A冲洗5个柱体积，速率3mL/min；将0.22μm膜过滤的TmSm包涵体溶液8mL上柱，用缓冲液A继续冲洗直至吸光值回到基线，去除未结合的杂蛋白，速率3mL/min；以缓冲液A和缓冲液B组成的线性梯度缓冲液(0％-100％B)冲洗15个柱体积，速率2mL/min；用缓冲液B继续冲洗SP柱直至吸光值回到基线；而后则更换阳离子柱洗脱液C进行洗脱，速率2mL/min，收集洗脱峰，SDS-PAGE检测纯度。

将透析袋按照通用流程预处理，将收集的蛋白放入透析袋中。透析袋按照1：10的体积放入透析液A中，透析6h。随后取出，放入透析液B中，透析6h。随后取出，放入透析液C中，透析6h。以上都在冰浴或者4℃下进行。将透析的溶液于12000rpm，4℃下离心20min，随后取上清用3KDa的超滤管4℃，5000rmp离心超滤，倒去滤液重复数次浓缩蛋白，随后-20℃保存蛋白。将浓缩的TmSm蛋白利用Bradford法测蛋白浓度。

SDS-PAGE蛋白电泳：

(1)将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，准备2个干净的50mL烧杯。

(2)把玻璃板在灌胶支架上固定好。

(3)按比例配好15％分离胶，用移液枪快速加入，大约5cm左右，之后加少许20％乙醇，静置30min。凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。

(4)倒出20％乙醇并用滤纸把剩余的20％乙醇吸干，按比例配好5％浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置30min。

(5)拔出样梳后，在上槽内加入1×蛋白缓冲液(用5×蛋白缓冲液稀释)，没过锯齿。

(6)样品准备：取蛋白样品30μL与4×上样缓冲液10μL(最终稀释成1×上样缓冲液loading buffer)(当需要进行非还原电泳时用非还原的上样缓冲液)混合，煮沸10min，离心。

(7)上样根据蛋白浓度可选择5-30μL，蛋白样品上样20μL，蛋白marker上样10μL。

(8)接通电源，恒压80V跑30min。

(9)接着换电压到120V，待溴酚蓝跑出胶后(40-50min左右)关闭电源。

(10)凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色30h左右。

(11)脱色：染色后的凝胶板用水漂洗数次，再加入脱色液或水置于微波炉中高火加热15min进行快速脱色。

(12)脱色后，将凝胶板用水漂洗数次，置于生物电泳图像分析系统中进行蛋白电泳图像拍摄。

RP-HPLC法检测TmSm蛋白纯度：

色谱柱：C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)

流动相：缓冲液A：0.08％TFA乙腈：水＝5:95。缓冲液B：0.1％TFA乙腈：水＝95:5。缓冲液A：B＝60％：40％

柱温：25℃

检测波长：280nm

检测流速：0.2mL/min

上样量：20μL

洗脱方式：在室温条件下，进行梯度洗脱。

纯度计算：按面积归一化法计算，以目标峰的峰面积占总积分面积的百分比作为纯度数据。

(1)过SP FF阳离子柱收集的洗脱液进行透析，将透析上清超滤脱盐，再加入PBS缓冲液进行换液，换液后的TmSm蛋白溶液测定蛋白浓度。

(2)将换液后的TmSm蛋白溶液用石英比色皿进行全波长扫描(200-400nm)，记录最大吸收峰处的吸收波长。

(3)利用C18柱进行纯度测定，记录色谱图。

实施例2.TmSm-PLGA-NPs的制备及指标检测

试剂：单甲氧基聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物mPEG5000-PLGA50/5028000购置于济南岱罡生物工程有限公司，乙酸乙酯购置于上海化学试剂有限公司，PEG8000购置于北京拜尔迪生物技术有限公司，聚乙烯醇PVA购置于上海凌峰化学试剂有限公司，BCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒购置于生工生物工程有限公司(上海)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。

试剂配制：

1％PVA溶液：称取1g PVA，用超纯水加热溶解，定容至100mL。

5％PEG8000水溶液：称取0.5g PEG8000，用超纯水溶解，定容至10mL。

10％蔗糖：称取1g蔗糖，用超纯水溶解，定容至10mL。

PLGA纳米颗粒制备：25mg mPEG-PLGA溶于2mL乙酸乙酯中，将200μL 1mg/mL TmSm 5％PEG水溶液加入到PLGA溶液中，冰浴条件下超声l min(功率为100W，超1s，停1s，60次)，形成油包水(W1/O)型乳液。将获得的(W1/O)型乳液加入到20mL 1％PVA水溶液中，将上述混合液引入高压均质机(100MPa)进行两个周期，即形成水包油包水(W1/O/W2)型复乳液。在室温常压下800rmp磁力搅拌4h，挥发有机溶剂乙酸乙酯。然后，将固化的纳米粒通过低温高速离心(4℃，12100r/min，20min)收集，用5mL超纯水清洗3次，洗净纳米粒表面的PVA。其中，将离心的上清液进行收集。将上述清洗的沉淀用2mL 1％蔗糖重悬，置于西林瓶中，先-20℃冷冻半小时，再置于-80℃过夜冷冻，最后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，去除纳米粒中的水分后，得到纳米粒成品，4℃环境下冷藏。其中，利用加超纯水代替1％蔗糖作为对照，进行冷冻干燥。空白PLGA纳米颗粒制备是利用200μL 5％PEG水溶液作为内水相，其他条件不变。

纳米颗粒的载药量和包封率的测定：将离心洗涤过程中的上清液收集，并用50mL容量瓶定容到50mL，采用Micro BCA法测定未被包进纳米粒中的TmSm含量，并计算纳米粒的包封率。由以下公式计算纳米颗粒的载药量和包封率：

BCA法微量蛋白质浓度测定

A试剂准备

(1)按照以下公式计算所需的BCA工作液总体积。

BCA工作液总体积＝(标准曲线测定点数+样品数)×重复次数×每个样品所需的BCA工作液体积

(2)根据所需的BCA工作液总体积，定量取溶液A：溶液B：溶液C＝25:24:1，混匀，制成BCA工作液。

(3)取一定量的BSA标准溶液，用1×PBS溶液稀释为40μg/mL。

(4)取9支1.5mL离心管，按照下表平行操作，配制BSA浓度梯度。

B酶标板法

(1)选取酶标板上22个孔，分为标准组和样品组。其中16个孔，每个标准品设置1个重复，各孔分别加入100μL相应浓度的标准蛋白质溶液(40μg/mL)；剩余4孔，分为2个重复组，重复孔编号相同。其中编号不同的两孔加入浓度不同的100μL样品稀释液。

(2)各酶标孔加入100μL BCA工作液，迅速混匀。

(3)在37℃保温30min。

(4)冷却至室温后，在酶标仪上测各孔的A562值。

(5)以标准组各孔A562平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。

(7)根据两个相同样品稀释液A562值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度。选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。

纳米颗粒的体外释放实验：精密称取载药纳米颗粒或空白纳米颗粒10mg置于离心管中，加入1.5mL PBS缓冲液(pH 7.4)，置于37℃恒温摇床中，振荡速度100rpm。分别在第l、2、4、6、8、12、24、48h以及第3、4、5、6天取出离心管，置于冷冻离心机中，14000rpm离心10min，将全部的释放介质小心吸出并更换新的PBS缓冲液释放介质，以空白纳米颗粒的释放上清液作为空白对照，按Micro BCA试剂盒要求进行加样，反应显色后于562nm处测得其吸光度，代入药物释放标准曲线，计算求得各个时间点释放的TmSm的药量(C0)。同时，测定释放前纳米颗粒中TmSm的含量(C₀)。计算累计释放百分率F_t：F_t＝(ΣC_t/C₀)×100％，以F_t对时间t作图，获得药物释放曲线。

实施例3.TmSm-PLGA-NPs的体外抗肿瘤活性检测

试剂与试剂盒：MTT，青链霉素混合液，DMSO购置于北京索来宝公司，RPMI-1640培养基，胎牛血清，胰酶购自Gibco公司(美国)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。

细胞株和培养基：

人胰腺癌细胞SW1990，培养条件为37℃，5％CO₂浓度，培养基为RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)。

试剂配制：

RPMI1640完全培养基：量取90mL RPMI1640培养液(1×)，加入10mL胎牛血清，1mL青霉素(100IU/L)和1mL链霉素(100mg/L)，充分混匀，置于4℃保存。

5mg/mL MTT溶液：称取250mg MTT溶于50mL PBS中，60℃助溶使其充分溶解，用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，-20℃避光保存。

细胞的传代：将超净工作台用紫外灭菌30min；培养基放入37℃培养箱中预热。用倒置显微镜观察细胞生长状态，当细胞铺满瓶底80％-90％时，弃去瓶内培养基，用PBS清洗两遍，洗去残留的培养基，然后加入500μL胰酶，消化1-2min，待细胞变圆并从瓶壁上脱落时，加入4ml已预热的新鲜培养基终止消化，并用无菌的吸管沿着瓶壁吹打细胞，直到形成单细胞悬液，稀释到合适的细胞密度传代。

细胞的冻存：超净台紫外灭菌30min，培养基放入37℃培养箱中预热。将培养瓶中的旧培养基弃去，用PBS清洗两遍；再向培养基中加入500μL胰酶，放入培养箱中消化1-2min，待细胞变圆并有少量细胞漂浮时，加入培养基终止消化；吹打细胞形成单细胞悬液后，将其移入离心管中以1000rpm离心5min，弃去上清，加入1ml细胞冻存液(700μL基础培养基，200μL胎牛血清，100μL DMSO)，用吸管吹打均匀，移入冻存管中盖紧盖子。将冻存管于4℃冰箱中放置0.5h，-20℃放置2h，再放入-80℃过夜，最后放入液氮中长期保持。

细胞的复苏：从液氮中取出细胞，迅速将其置于37℃水浴中，不停地摇动，使细胞快速溶解；然后将其移入离心管中以1000rpm离心5min；弃去上清，再加入4ml新鲜培养基，吹打均匀后，移入培养瓶中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。过夜后，换培养液除去死细胞。

MTT法检测TmSm蛋白对胰腺癌SW1990细胞增殖的影响：接种胰腺癌SW1990细胞：细胞铺满细胞瓶80-90％时，用0.5mL 0.25％胰酶消化后，加入2mL RPMI1640完全培养基(10％胎牛血清，100IU/L青霉素，100mg/L链霉素，pH7.2)终止消化并吹打细胞，使形成细胞悬液。吸取1mL细胞悬液加入15mL的离心管中，并用6mL含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以2×10⁴个细胞/mL接种到96孔板，每孔加入体积100μL。37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，观察到孔中细胞长满至70-80％。小心吸取旧的培养液弃去，每孔加入200μL含10％胎牛血清的培养液，最外一圈加入PBS。其中空白对照孔加入200μL RPMI1640完全培养基；其他孔为不同浓度的空白PLGA和TmSm-PLGA纳米颗粒，蛋白浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL和12mg/mL，分别加入200μL，每个浓度共4个平行孔。将加好样品的96孔板置37℃、5％CO₂培养箱中继续培养24h，显微镜下观察胰腺癌SW1990细胞形态是否发生变化。每孔加20μL 5mg/mL MTT溶液。继续孵育4h，终止培养，小心吸去孔内培养上清液。每孔加入150μL DMSO，在振荡仪上充分振荡10min使结晶溶解。在酶标仪上测定各孔的λ＝490nm处吸光值，计算细胞存活率。细胞存活率＝待测组吸光值/阴性对照组吸光值×100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。