本发明涉及医疗材料领域，特别是涉及一种脱细胞外基质及其制备方法和应用。
背景技术：
基于组织工程学原理的以动物组织为原料的细胞外基质材料是主要发展方向。细胞外基质是由多种大分子物质如胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白等成分构建的复杂有机的三维整体结构，为各种细胞的生存及活动提供适宜的场所及微环境，调控组织器官功能。所以细胞外基质作为理想的组织修复材料，已经广泛用于临床，包括心包膜、胸膜、隔膜、腹膜和小肠粘膜下层等细胞外基质材料。
自体和异体组织的来源极为有限，异种(如：猪、牛、马)的脱细胞外基质就成为了当今软组织修复技术研究的一大主题。脱细胞外基质的制备方法有很多种，目的是能够去除组织内所有的细胞、脂肪等成分，而最大限度地保留胶原成分和结构的完整性。
脱细胞工艺和病毒灭活工艺是脱细胞外基质材料的主要工艺和技术难点，要求完全去除动物组织的病毒、细胞和动物源dna成分，同时完整保留天然脱细胞外基质的成分和三维结构。制备脱细胞外基质的方法种类繁多，但大多不能完全去除所有的动物源性dna成分，并且耗时长，需要使用多种有机和表面活性剂等溶剂，一方面导致了脱细胞基质材料中活性成分的破坏，另一方面，有害溶剂残留会导致细胞毒性、刺激和免疫反应，从而影响组织修复效果。且大多脱细胞外基质的亲水性和贴敷性不强，吸水速率慢，膜不够薄和柔软，从而不能适应各种表面轮廓组织的修复。
现有的脱细胞外基质的制备方法制得的脱细胞外基质的胶原纤维的有序结构遭到破坏，从而影响了后续应用。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种可以避免胶原纤维的有序结构被破坏的脱细胞外基质的制备方法，以及该脱细胞外基质的制备方法制得的脱细胞外基质和应用。
一种脱细胞外基质的制备方法，包括如下步骤：
对哺乳动物的组织器官进行预处理后得到组织前体；
对所述组织前体分别进行病毒灭活处理、dna清除处理、脱细胞处理和脱脂处理，得到脱细胞外基质前体，其中，所述病毒灭活处理、所述dna清除处理、所述脱细胞处理和所述脱脂处理的操作顺序可以相互更换；
对所述脱细胞外基质前体依次进行梯度脱水处理和交联处理，最后定型干燥得到脱细胞外基质，其中，所述梯度脱水处理为：对所述脱细胞外基质前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min。
在一个实施例中，所述梯度脱水处理为：将所述脱细胞外基质前体依次浸泡在质量百分浓度为25％、50％、75％、90％和100％的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min，其中，所述有机物溶液的溶质为乙醇或丙酮。
在一个实施例中，所述对所述哺乳动物的组织器官进行预处理的操作为：用机械法对所述哺乳动物的组织器官进行初步去除脂肪、肌肉以及附属的其他器官后，用纯水清洗干净。
在一个实施例中，所述哺乳动物的组织器官为猪、牛或马的组织器官。
在一个实施例中，所述哺乳动物的组织器官包括哺乳动物的心包膜、胸膜、隔膜、腹膜和小肠粘膜下层。
在一个实施例中，所述哺乳动物的组织器官为猪的腹膜。
在一个实施例中，所述病毒灭活处理为：将所述组织前体浸泡在病毒灭活溶液中1h～10h进行病毒灭活处理，所述病毒灭活溶液为质量百分浓度为0.1％～5％的过氧化物溶液，或所述病毒灭活溶液为含有0.1wt％～5wt％的过氧化物和20wt％～70wt％的乙醇的混合溶液；
所述dna清除处理为：将所述组织前体浸泡在碱溶液中1h～24h，再浸泡在酸溶液中1h～12h；
所述脱细胞处理为：将所述组织前体浸泡在质量百分浓度为0.05％～0.5％的蛋白酶溶液中6h～48h，再浸泡在浓度为0.5m～3m的nacl溶液中6h～48h；
所述脱脂处理为：将所述组织前体浸泡在脱脂有机物中，浸泡次数为1次～5次，每次浸泡的时间为1h～24h；
所述交联处理为：在温度为90℃～150℃的条件下，对经过梯度脱水处理的所述脱细胞外基质前体进行高温真空交联1h～24h；
或者，所述交联处理为：将经过梯度脱水处理的所述脱细胞外基质前体浸泡在质量百分浓度为0.25％～3％的交联剂溶液中1h～24h。
在一个实施例中，所述过氧化物溶液选自过氧化氢溶液和过氧乙酸溶液中的至少一种；
所述过氧化物选自过氧化氢和过氧乙酸中的至少一种；
所述碱溶液选自碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，所述碱溶液的质量百分浓度为0.5％～4％；
所述酸溶液选自盐酸和醋酸溶液中的至少一种，所述酸溶液的质量百分浓度为0.05％～2％；
所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶中的至少一种；
所述脱脂有机物选自正己烷、异丙醇、乙二醇和乙醚中的至少一种；
所述交联剂溶液选自戊二醛溶液、碳化二亚胺溶液、京尼平溶液和环氧化合物溶液中的至少一种。
一种脱细胞外基质，采用上述的脱细胞外基质的制备方法制备得到。
上述的脱细胞外基质，在制备医疗器械领域的应用。
这种脱细胞外基质的制备方法，通过病毒灭活处理、dna清除处理、脱细胞处理和脱脂处理去除了组织前体的免疫原性，接着通过将组织前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中梯度脱水，接着交联处理和定性干燥，得到脱细胞外基质。通过梯度脱水处理组织前体，可以使得最终制得的脱细胞外基质的胶原纤维的有序结构不被破坏。此外，同时由于具有有序的胶原纤维结构，这种脱细胞外基质具有优异的柔韧性、良好的生物相容性和骨诱导能力，同时吸水速率快并且吸水不膨胀，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为一实施方式的脱细胞外基质的制备方法的流程图；
图2是实施例1制得的制备脱细胞外基质的光滑面的扫描电子显微镜照片；
图3是实施例1制得的制备脱细胞外基质的粗糙面的扫描电子显微镜照片；
图4是实施例1制得的制备脱细胞外基质经过苏木精-伊红染色后的倒置显微镜照片；
图5是实施例1制得的制备脱细胞外基质植入兔子体内一周后切片经过苏木精-伊红染色后的倒置显微镜照片。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
如图1所示，本发明公开了一实施方式的脱细胞外基质的制备方法，包括如下步骤：
s10、对哺乳动物的组织器官进行预处理后得到组织前体。
对哺乳动物的组织器官进行预处理的操作为：用机械法对哺乳动物的组织器官进行初步去除脂肪、肌肉以及附属的其他器官后，用纯水清洗干净(优选为清洗3～5遍)。其中，附属的其他器官指出了心包膜、胸膜、隔膜、腹膜和小肠粘膜下层之外的器官。
优选的，哺乳动物的组织器官为猪、牛或马的组织器官。
优选的，哺乳动物的组织器官包括哺乳动物的心包膜、胸膜、隔膜、腹膜和小肠粘膜下层。
特别优选的，哺乳动物的组织器官为猪的腹膜。
s10得到的组织前体可以储存在-20℃备用。
s20、对s10得到的组织前体分别进行病毒灭活处理、dna清除处理、脱细胞处理和脱脂处理，得到脱细胞外基质前体。
s20中，病毒灭活处理、dna清除处理、脱细胞处理和脱脂处理的操作顺序可以相互更换。
s20中，病毒灭活处理为：将组织前体浸泡在病毒灭活溶液中1h～10h(优选为3h)进行病毒灭活处理。
病毒灭活溶液为质量百分浓度为0.1％～5％(优选为2％)的过氧化物溶液。过氧化物溶液选自过氧化氢溶液和过氧乙酸溶液中的至少一种。
或者，病毒灭活溶液为含有0.1wt％～5wt％(优选为2wt％)的过氧化物和20wt％～70wt％(优选为50wt％)的乙醇的混合溶液。过氧化物选自过氧化氢和过氧乙酸中的至少一种。
s20中，dna清除处理为：将组织前体浸泡在碱溶液中1h～24h(优选为12h)，再浸泡在酸溶液中1h～12h(优选为3h)。
碱溶液选自碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，碱溶液的质量百分浓度为0.5％～4％(优选为2％)。
酸溶液选自盐酸和醋酸溶液中的至少一种，酸溶液的质量百分浓度为0.05％～2％(优选为0.5％)。
s20中，脱细胞处理为：将组织前体浸泡在质量百分浓度为0.05％～0.5％(优选为0.25％)的蛋白酶溶液中6h～48h(优选为24h)，再浸泡在浓度为0.5m～3m(优选为1m)的nacl溶液中6h～48h(优选为12h)。
蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶中的至少一种。
s20中，脱脂处理为：将组织前体浸泡在脱脂有机物中，浸泡次数为1次～5次，每次浸泡的时间为1h～24h。
优选的，脱脂处理为：将组织前体浸泡在正己烷中，浸泡次数为2次，每次浸泡的时间为6h；接着浸泡在异丙醇中，浸泡次数为2次，每次浸泡的时间为12h。
脱脂有机物选自正己烷、异丙醇、乙二醇和乙醚中的至少一种。
s30、对s20得到的脱细胞外基质前体依次进行梯度脱水处理和交联处理，最后定型干燥得到脱细胞外基质。
s30中，梯度脱水处理为：对脱细胞外基质前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min。
优选的，梯度脱水处理为：将脱细胞外基质前体依次浸泡在质量百分浓度为25％、50％、75％、90％和100％的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min(优选为每次20min)，其中，有机物溶液的溶质为乙醇或丙酮。
交联处理为：在温度为90℃～150℃的条件下，对经过梯度脱水处理的脱细胞外基质前体进行高温真空交联1h～24h。
或者，交联处理为：将经过梯度脱水处理的脱细胞外基质前体浸泡在质量百分浓度为0.25％～3％(优选为2.5％)的交联剂溶液中1h～24h。
交联剂溶液选自戊二醛溶液、碳化二亚胺溶液、京尼平溶液和环氧化合物(优选为丁二醇二缩水甘油醚)溶液中的至少一种。
优选的，交联剂溶液为ph为5.5、质量百分浓度为2.5％的丁二醇二缩水甘油醚溶液。
定型干燥的操作为：按照产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将经过梯度脱水处理的脱细胞外基质前体固定于模具上，并对固定于模具上的材料进行干燥或干燥，干燥完成后得到脱细胞外基质。
干燥可以为冷冻干燥(18h～24h)或真空干燥(1h～24h，优选为3h)。
得到的脱细胞外基质在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照或电子束辐照进行灭菌。
这种脱细胞外基质的制备方法，通过病毒灭活处理、dna清除处理、脱细胞处理和脱脂处理去除了组织前体的免疫原性，接着通过将组织前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中梯度脱水，接着交联处理和定性干燥，得到脱细胞外基质。通过梯度脱水处理组织前体，可以使得最终制得的脱细胞外基质的胶原纤维的有序结构不被破坏。此外，同时由于具有有序的胶原纤维结构，这种脱细胞外基质具有优异的柔韧性、良好的生物相容性和骨诱导能力，同时吸水速率快并且吸水不膨胀，具有良好的应用前景。
本发明还公开了一种脱细胞外基质，采用上述的脱细胞外基质的制备方法制备得到。
采用上述方法制备的脱细胞外基质的动物源dna残留量少，并完整保留了天然细胞外基质的三维结构、免疫原性低、柔韧性和贴敷性好、吸水速率快且吸水不膨胀、具有良好的生物安全性和生物相容性，能够调节细胞的生长、形状、代谢、迁移、增值和分化，进而调控组织和器官功能，是理想的组织修复材料。
这种脱细胞外基质具有优异的柔韧性、良好的生物相容性和骨诱导能力，同时吸水速率快并且吸水不膨胀，具有良好的应用前景，可以应用于制备医疗器械领域。
以下为具体实施例。
实施例1
取新鲜猪的腹膜组织，用机械法对猪腹膜进行初步去除脂肪、肌肉及附属的其他器官，去除附带的其他成分后，制成猪腹膜厚度为0.3mm～1.0mm，用纯水清洗4遍，储存在-20℃备用。
将预处理后的猪腹膜依次浸泡在2wt％的naoh溶液中处理12h，处理之后用纯水清洗3～5遍，然后用浓度为0.5wt％的hcl溶液处理2h，处理之后用纯水清洗4遍，以清除动物组织大部分的dna。
将dna清除处理后的猪腹膜浸泡在2wt％的过氧化氢溶液中3h进行病毒灭活处理。
对灭活处理后的猪腹膜浸泡在0.25wt％的中性蛋白酶溶液中24h，纯水冲洗并浸泡在1m的高渗盐水中24h进行脱细胞处理。
将猪腹膜依次放入正己烷和异丙醇溶液中进行脱脂，正己烷处理时间为24h，重复处理1次；异丙醇处理时间为12h，重复处理2次。
将猪腹膜依次放入乙醇溶液中进行梯度脱水，乙醇梯度脱水的质量百分浓度为25％、50％、75％、90％、100％，每次脱水的时间为20min。
将猪腹膜脱细胞基质浸泡在戊二醛中进行交联，戊二醛的浓度为0.25wt％，交联时间为1h。
按照不同产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将材料固定于模具上，并将已固定于模具上的材料进行冷冻干燥，干燥时间为20h。
在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照。
将实施例1制得的脱细胞外基质在扫描电子显微镜(sem)下观察，得到图2～图3。
由图2～图3可以看出，实施例1制得的脱细胞外基质具有有序的胶原纤维结构，光滑面致密，粗糙面为疏松的纤维结构，有利于后期成骨细胞在粗糙面的粘附与生长。
对实施例1制得的脱细胞外基质进行苏木精-伊红(he)染色后在倒置显微镜下观察，得到图4。
由图4可以看出，实施例1制得的脱细胞外基质中没有细胞碎片残留，并且可以观察到纤维结构。
将实施例1制得的脱细胞外基质植入兔子体内一周后切片，经过苏木精-伊红(he)染色后在倒置显微镜下观察，得到图5。
由图5可以看出，将实施例1制得的脱细胞外基质(胶原膜)植入兔子体内一周后没有炎症反应，且贴敷性能好，脱细胞外基质(胶原膜)没有膨胀。
实施例2
取新鲜牛的腹膜组织，用机械法对牛腹膜进行初步去除脂肪、肌肉及附属的其他器官，去除附带的其他成分后，制成牛腹膜厚度为0.3mm～1.0mm，用纯水清洗5遍，储存在-20℃备用。
将预处理后的牛腹膜依次浸泡在2wt％的naoh溶液中处理10h，处理之后用纯水清洗5遍，然后用浓度为0.25wt％的hcl溶液处理4h，处理之后用纯水清洗5遍，以清除动物组织大部分的dna。
将dna清除处理后的牛腹膜浸泡在1wt％的过氧乙酸和50wt％的乙醇的混合溶液中2h进行病毒灭活处理。
对灭活处理后的牛腹膜浸泡在0.25wt％的胰蛋白酶溶液中12h，纯水冲洗并浸泡在2m的高渗盐水中12h进行脱细胞处理。
将牛腹膜依次放入正己烷和异丙醇溶液中进行脱脂，正己烷处理时间为6h，重复处理2次；异丙醇处理时间为24h，重复处理1次。
将牛腹膜依次放入丙酮溶液中进行梯度脱水，乙醇梯度脱水的质量百分浓度为25％、50％、75％、90％、100％，每次脱水的时间为20min。
将牛腹膜脱细胞基质浸泡在碳化二亚胺中进行交联，戊二醛的浓度为0.5wt％，交联时间为24h。
按照不同产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将材料固定于模具上，并将已固定于模具上的材料进行真空干燥，干燥时间为12h。
在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照。
实施例3
取新鲜牛的心包膜组织，用机械法对牛心包膜进行初步去除脂肪、肌肉及附属的其他器官，去除附带的其他成分后，制成牛心包膜厚度为0.3mm～1.0mm，用纯水清洗3遍，储存在-20℃备用。
将预处理后的牛心包膜依次浸泡在4wt％的naoh溶液中处理6h，处理之后用纯水清洗3遍，然后用浓度为1wt％的hcl溶液处理6h，处理之后用纯水清洗3遍，以清除动物组织大部分的dna。
将dna清除处理后的牛心包膜浸泡在2wt％的过氧乙酸和70wt％的乙醇混合溶液中1h进行病毒灭活处理。
对灭活处理后的牛心包膜浸泡在0.5％的胃蛋白酶溶液中12h，纯水冲洗并浸泡在0.5m的高渗盐水中12h进行脱细胞处理。
将牛心包膜依次放入正己烷、乙二醇乙醚溶液中进行脱脂，正己烷处理时间为12h，重复处理2次；乙二醇乙醚处理时间为6h，重复处理1次。
将牛心包膜依次放入丙酮溶液中进行梯度脱水，乙醇梯度脱水的质量百分浓度为25％、50％、75％、90％、100％，每次脱水的时间为10min。
按照不同产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将材料固定于模具上，并将已固定于模具上的材料进行真空高温交联并干燥，干燥时间为24h，交联温度设置为100℃。
在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照。
实施例4
取新鲜猪的胸膜组织，用机械法对猪的胸膜进行初步去除脂肪、肌肉及附属的其他器官，去除附带的其他成分后，用纯水清洗4遍，储存在-20℃备用。
将预处理后的猪胸膜依次浸泡在3wt％的naoh溶液中处理5h，处理之后用纯水清洗4遍，然后用浓度为0.1wt％的hcl溶液处理5h，处理之后用纯水清洗4遍，以清除动物组织大部分的dna。
将dna清除处理后的猪胸膜浸泡在1wt％的过氧乙酸和20％的乙醇混合溶液中2h进行病毒灭活处理。
对灭活处理后的猪胸膜浸泡在0.5wt％的胃蛋白酶溶液中12h，纯水冲洗并浸泡在0.5m的高渗盐水中12h进行脱细胞处理。
将猪胸膜放入异丙醇溶液中进行脱脂，异丙醇处理时间为12h，重复处理4次。
将猪胸膜依次放入乙醇溶液中进行梯度脱水，乙醇梯度脱水的质量百分浓度为25％、50％、75％、90％、100％，每次脱水的时间为30min。
将猪胸膜脱细胞基质浸泡在环氧化合物中进行交联，环氧化合物为丁二醇二缩水甘油醚，其交联溶液的浓度为2.5wt％，ph值为5.5。
按照不同产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将材料固定于模具上，并将已固定于模具上的材料进行冷冻干燥，干燥时间为18h。
在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。