本发明涉及了一种聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PELCL)/聚己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜及制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术：
：：采用静电纺丝技术在组织工程支架中负载基因蛋白等生物活性物质，可以调控细胞的粘附、增殖和迁移，有利于组织的修复和再生。生物降解性聚丙交酯共聚物聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PELCL)、聚ε-己内酯(聚己内酯，PCL)等生物相容性好，力学性能优良。采用静电纺丝技术,制备出超细纤维膜,模拟细胞外基质结构,可作为组织重建的支架材料。精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(Arg-Glu-Asp-Val,REDV)存在于纤维连接蛋白的III-CS区域，含有该序列的合成肽能够特异性地粘附血管内皮细胞，而较少粘附平滑肌细胞和成纤维细胞，在血管组织工程支架的功能化中具有重要的应用价值。为促进血管组织工程支架材料表面形成内皮细胞层，一般采用纤维膜表面物理或者化学修饰的方法，在纤维膜表面偶联REDV和RGD等小肽(RenX,FengY,GuoJ,WangH,LiQ,YangJ,HaoX,LvJ,MaN,LiW.Surfacemodificationandendothelializationofbiomaterialsaspotentialscaffoldsforvasculartissueengineeringapplications.ChemicalSocietyReviews2015,44:5680-5742)。例如，通过表面浸涂的方式在PCL电纺纤维膜表面修饰RGD小肽，提高了细胞在纤维膜表面的粘附和铺展(WangZ,WangH,ZhengW,ZhangJ,ZhaoQ,WangS,YangZ,KongD.Highlystablesurfacemodificationsofpoly(ε-caprolactone)(PCL)filmsbymolecularself-assemblytopromotecellsadhesionandproliferation.ChemicalCommunications2011,47:8901-8903)。我们前期研究发现，在PELCL电纺纤维膜表面通过EDS/NHS活化的方法偶联具有特异粘附作用的REDV小肽,可以促进血管内皮细胞的特异性粘附和生长(ZhouF,JiaX,YangY,YangQ,GaoC,ZhaoY,FanY,YuanXPeptide-modifiedPELCLelectrospunmembranesforregulationofvascularendothelialcells.MaterialsScienceandEngineeringC2016,68:623-631)。然而通过表面化学修饰的方法，在包载生物活性物质的电纺纤维膜表面偶联小肽，比如酸、碱或氨解处理，可能会降低生物活性物质的活性，从而增加原料成本。因此，在电纺纤维膜表面改性的同时，保证包载的生物活性物质的活性是十分必要的。技术实现要素：本发明的目的在于制备一种聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PELCL)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜，所述电纺纤维膜可以用于包载核酸、蛋白、药物等生物活性物质，所述电纺超细纤维膜对促进血管内皮细胞粘附和生长作用较好。本发明的技术方案如下：一种聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜(一种PELCL/聚己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺纤维膜)，其PELCL和聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的质量比为(5～1):1，超细纤维膜由直径为400～1000nm的超细纤维构成，其厚度为50～200μm。所述的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)的数均分子量为(7～20)×104。所述的聚ε-己内酯的数均分子量为(1～5)×104，聚ε-己内酯的分子式为：式中m＝70～420；R1为-CH3或-CH2O(COCH2CH2CH2CH2CH2O)mCO(CH2)5OH。所述聚乙二醇的数均分子量为(1～5)×103；通式为R1-(CH2CH2O)n-R2，式中n＝23～113，R1为与巯基发生反应的活性基团，包括马来酰亚胺基团、吡啶二硫基团或硫醇基团；R2为与氨基发生反应的活性基团，包括琥珀酰亚胺基团、乙酸基团、乙醛基团、异氰酸基团、异氰硫酸基团、丙烯酸基团或硝基酚基团。本发明的一种聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜的制备方法，包括以下过程:(1)聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)和聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺以体积比为(4～8):1的混和溶剂中,配制成浓度100～200mg/mL的电纺溶液；其PELCL和聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的质量比为(5～1):1；(2)将按步骤(1)所得溶液在溶液的流量为0.02～0.10mL/h、电压为12～20kV、接收距离为15～20cm的条件进行电纺,得到厚度为50～200μm的电纺超细纤维膜。所述聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的制备方法包括步骤：(1)聚ε-己内酯的氨基化修饰；(2)聚ε-己内酯-g-聚乙二醇的制备；(3)聚ε-己内酯-g-聚乙二醇偶联小肽REDV。上述的聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的制备方法,具体说明如下：步骤(1)是：聚ε-己内酯的氨基化修饰：将聚ε-己内酯配成0.3～0.5g/mL的无水二氯甲烷溶液，使用N,N’-羰基二咪唑(CDI)活化羟基基团，按照摩尔比[单端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:1(或[双端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:2)加入CDI，在N2中室温下搅拌反应24h，然后加入过量乙二胺，室温下搅拌反应48～72h，产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥,得到产物聚ε-己内酯的氨基改性物。步骤(2)是：聚-己内酯-g-聚乙二醇的制备：将聚-己内酯的氨基改性物配制为溶度为200～300mg/mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中R2基团摩尔比为1:1加入双端PEG,室温搅拌均匀6～10h,产物使用乙醇沉淀，得到聚-己内酯-g-聚乙二醇。步骤(3)是：聚ε-己内酯-g-聚乙二醇偶联小肽REDV：将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇配成溶度为200～300mg/mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV小肽,室温搅拌均匀2～5h,产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。本发明的优点在于上述聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜,在电纺过程中，随着溶剂的挥发，低分子量的聚ε-己内酯-REDV小肽粘度低，具有向纤维表面迁移的趋势。一方面，迁移到表面的聚ε-己内酯-REDV小肽具有促进血管内皮细胞粘附和生长的功能；另一方面，该电纺纤维膜可用于包载核酸、蛋白、药物等生物活性物质，包载生物活性物质后的纤维仍然具有良好的纤维形貌，释放的生物活性物质具有良好的生物活性。该发明可用于生物医用材料领域。附图说明图1：实施例1制备的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜包载miRNA复合的纳米粒子的SEM照片。具体实施方式下面通过实施案例对本发明的技术方案作进一步的描述，以下实施案例是对本发明的进一步说明，并不限制本发明的适用范围。聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜由直径为400～1000nm的超细纤维构成,其厚度为50～200μm.聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯),其特征在于PELCL的数均分子量为(7～20)×104；聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV,其特征在于所述聚ε-己内酯的数均分子量为(1～5)×104，所述聚ε-己内酯的分子式为：式中，m＝70～420；R1为-CH3或-CH2O(COCH2CH2CH2CH2CH2O)mCO(CH2)5OH；聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV,其特征在于聚乙二醇的数均分子量为(1～5)×103，通式为R1-(CH2CH2O)n-R2，式中n＝23～113，R1为可以与巯基发生反应的活性基团，包括马来酰亚胺基团、吡啶二硫基团、硫醇基团。R2为可以与氨基发生反应的活性基团，如琥珀酰亚胺基团、乙酸基团、乙醛基团、异氰酸基团、异氰硫酸基团、丙烯酸基团、硝基酚基团。聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的制备方法,其特征在于包括步骤：(1)聚ε-己内酯的氨基化修饰：将聚ε-己内酯配成0.3～0.5g/mL的无水二氯甲烷溶液，使用N,N’-羰基二咪唑(CDI)活化羟基基团，按照摩尔比[单端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:1(或[双端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:2)加入CDI，在N2中室温下搅拌反应24h，然后加入过量乙二胺，室温下搅拌反应48～72h，产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥,得到产物聚ε-己内酯的氨基改性物。(2)聚-己内酯-g-聚乙二醇的制备：将聚-己内酯的氨基改性物配制为溶度为200～300mg/mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中R2基团摩尔比为1:1加入双端PEG,室温搅拌均匀6～10h,产物使用乙醇沉淀，得到聚-己内酯-g-聚乙二醇。(3)聚ε-己内酯-g-聚乙二醇偶联小肽REDV：将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇配成溶度为200～300mg/mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV小肽,室温搅拌均匀2～5h,产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜的制备方法,包括以下过程:(1)聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽和聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PELCL)一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺以体积比为(4～8):1的混和溶剂中，配制成浓度100～200mg/mL的电纺溶液，PELCL和聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽共聚物的质量比为(5～1):1；(2)将按步骤(1)所得溶液进行电纺,电纺条件为:流量为0.02～0.10mL/h，电压为12～20kV,接收距离为15～20cm,得到50～200μm厚度的电纺纤维膜。实施例1：在装有磁力搅拌的三口瓶中,将3g聚ε-己内酯(双端羟基)溶解于10mL无水二氯甲烷中，按照按照摩尔比[双端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:2加入CDI65.0mg，在N2中室温下搅拌反应24h，然后加入2.0mL的乙二胺，室温搅拌反应48h，产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥24h,得到聚ε-己内酯的氨基改性物。将聚ε-己内酯的氨基改性物78mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中的NHS基团摩尔比为1：1加入双端PEG,马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(MAL-PEG-NHS,)208mg,室温搅拌反应6h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇。将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇600mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV44mg，室温搅拌反应3h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。所制得的聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽和聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)按照质量比1:1，溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺以体积比为8:1的混和溶剂中,配制成浓度200mg/mL的电纺溶液。将上述混和溶液作为电纺溶液的油相，将溶度为0.3mg/mL的miRNA复合物溶液作为水相。并按照水油比1:25混和20min至均匀。电纺条件为：溶液的流量为0.04mL/h,电纺的电压为12kV,接收距离是15cm,电纺24h,得到厚度100μm的电纺纤维膜。所制得包载miRNA的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜。该纤维膜的SEM照片如图1所示,其中超细纤维直径为900～1000nm。实施例2：在装有磁力搅拌的三口瓶中,将5g聚ε-己内酯(双端羟基)溶解于10mL无水二氯甲烷中，按照摩尔比[双端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:2加入CDI32.4mg，在N2中室温下搅拌反应24h，然后加入2.0mL的乙二胺，室温搅拌反应60h,产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥24h,得到聚ε-己内酯的氨基改性物。将聚ε-己内酯的氨基改性物600mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中的NHS基团摩尔比为1:1加入双端PEG，马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(MAL-PEG-NHS,)120mg,室温搅拌反应10h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇。将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇750mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV16.9mg，室温搅拌反应3h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。所制得的聚ε-己内酯-g-小肽REDV和聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)按照质量比5:1，溶于氯仿和N,N二甲基甲酰胺以体积比为6:1的混和溶剂中,配制成浓度150mg/mL的电纺溶液。电纺条件为：溶液的流量为0.1mL/h,电纺的电压为13～15kV,接收距离是15～20cm,电纺12h，得到50μm厚度的电纺超细纤维膜，超细纤维膜的直径为800～900nm。实施例3：在装有磁力搅拌的三口瓶中,将4g聚ε-己内酯(单端羟基)溶解于10mL无水二氯甲烷中，按照摩尔比[单端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:1加入CDI65.0mg，在N2中室温下搅拌反应24h，然后加入2.0mL的乙二胺，室温搅拌反应72h，产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥24h,得到聚ε-己内酯的氨基改性物。将聚ε-己内酯的氨基改性物900mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中的NHS基团摩尔比为1:1加入双端PEG，马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(MAL-PEG-NHS,)90mg,室温搅拌反应7h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇。将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇900mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV50.7mg，室温搅拌反应2h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。所制得的聚ε-己内酯-g-小肽REDV和聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)按照质量比2:1，溶于氯仿和N,N二甲基甲酰胺以体积为4:1的混和溶剂中,配制成浓度100mg/mL的电纺溶液。电纺条件为：溶液的流量为0.02mL/h,电纺的电压为15～20kV,接收距离是15～20cm,电纺24h，得到100～200μm厚度的电纺纤维膜，超细纤维的直径为400～700nm。当前第1页1 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