用于预防和治疗肝细胞癌的抗紧密连接蛋白1单克隆抗体的制作方法
相关专利申请
本申请要求2015年3月19日提交的欧洲专利申请号ep15159872.9的优先权。所述欧洲专利申请的全文通过引用引入本文。
背景技术：
肝细胞癌(hcc)是全世界第二大且上升最快的癌症死亡原因(internationalagencyforresearchoncancer；globocan2012:estimatedcancerincidence,mortalityandprevalenceworldwidein2012–网页:globocan.iarc.fr)。每年有超过500,000个hcc新病例，且由于疾病预后差几乎有着一样多的死亡。慢性丙肝病毒(hcv)感染是发展肝硬化和hcc的最重要的风险因子(el-serag,nengljmed.,2011,365(12):1118-1127)。据估计大约3％的世界人口慢性感染hcv(世界卫生组织)。hcc的其他主要风险因子包括感染乙肝病毒(hbv)、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝病。不太常见的原因包括遗传性血色沉着病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、一些卟啉症、wilson病、黄曲霉毒素暴露。基于地理区域和基于人种或民族，这些风险因子在hcc患者中的分布是高度可变的。大部分这些风险因子导致肝硬化的形成和进展，其存在于80-90％的hcc患者中。基于病因、区域或民族和肝硬化阶段，肝硬化患者发展hcc的5年累积风险为5％-30％。2011年，终末期肝病和hcc导致6,342例肝移植，其单独手术费用超过十亿美元(参见nih网页:optn.transplant.hrsa.gov/latestdata/step2.asp)。
虽然可通过在疾病的早期解决根本病因来避免hcc，仍然缺乏在其中尽管治疗根本病因但仍存在hcc风险的患有确定的肝硬化和晚期纤维化的患者中预防hcc的策略。事实上，当已经存在晚期纤维化时，甚至治愈hcv感染不能消除hcc发展的风险(vandermeer等,jama,2012,308(24):2584-2593)。目前，患有肝硬化性hcc的患者的治愈性治疗选择主要局限于肝移植，一种不实际的、侵入性和资源密集型方案。由于手术治疗后肿瘤复发极频繁且缺乏有效的医学治疗策略，在患有晚期肝纤维化的患者中预防hcc发展被认为是对患者生存产生重大影响的最有效策略(hoshida等,jhepatol.,2014,61(1s):s79-s90；hoshida等,currcancerdrugtargets,2012,12(9):1129-1159)。
由于患有肝硬化和相关hcc的患者经济负担越来越重，因此迫切需要在患有晚期肝病的患者中预防和治疗hcc的新策略。
发明简述
本发明涉及用于预防和/或治疗不考虑病因学的肝细胞癌(hcc)的系统和策略。尤其是，本发明涉及使用抗紧密连接蛋白-1(anti-claudin-1)抗体来预防和/或治疗肝细胞癌，包括与hcv感染无关的肝细胞癌和已经治愈hcv感染后发展或易发展的肝细胞癌。通过分析病毒诱导的细胞信号转导和预测各种病因学的肝硬化性患者中hcc风险的186-肝基因签名，本申请人表明，之前开发的显示治愈慢性hcv感染而没有可检测的副作用的抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体(ep08305597和wo2010/034812)干扰肝细胞信号转导并在基于肝细胞的模型系统中逆转来自患者的hcc风险特征(risksignature)。发现信号转导的调节和转录重编程与抗体的抗病毒活性无关，表明抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体直接作用于致癌通路。事实上，通过机制研究，申请人证明，所述抗体削弱egfr-mapk信号转导通路和被认为是肝癌形成驱动因素的炎性反应基因的表达。与抗病毒剂和其他用于hcc化学保护的候选化合物相比，抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体能最有效地逆转hcc高风险特征。
因此，一方面，本发明提供用于预防或治疗受试者(即从未感染hcv的受试者或hcv感染已经治愈的受试者)的非hcv相关的肝细胞癌的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段。
在某些实施方式中，非hcv相关的肝细胞癌与乙肝病毒(hbv)感染、酒精中毒、非酒精性脂肪肝病(nafld)、遗传性血色沉着病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、迟发性皮肤卟啉症、wilson病、高酪氨酸血症、糖原贮积病、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化或暴露于黄曲霉毒素有关。在其他实施方式中，非hcv相关的肝细胞癌是未知来源的肝细胞癌。
在某些实施方式中，抗紧密连接蛋白1抗体是多克隆抗体。在其他实施方式中，抗紧密连接蛋白1抗体是单克隆抗体。
在某些实施方式中，抗紧密连接蛋白1抗体是由inserm和genovac于2008年7月29日以选自下组的保藏号共同保藏于dsmz的杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体：dsmacc2931、dsmacc2932、dsmacc2933、dsmacc2934、dsmacc2935、dsmacc2936、dsmacc2937和dsmacc2938。在其他实施方式中，抗紧密连接蛋白1抗体包含由inserm和genovac于2008年7月29日以选自下组的保藏号共同保藏于dsmz的杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体的六个互补决定区(cdr)：dsmacc2931、dsmacc2932、dsmacc2933、dsmacc2934、dsmacc2935、dsmacc2936、dsmacc2937和dsmacc2938。
在某些实施方式中，抗紧密连接蛋白1抗体是人源化的、去免疫性或嵌合的。
抗紧密连接蛋白1抗体的生物学活性片段是保留抗体干扰肝细胞信号转导和逆转来自患者的hcc风险特征的生物学性质的片段。
更通常地，本发明涵盖包含抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段的任何分子的用途，包括嵌合抗体、人源化抗体、去免疫性抗体和包含来自由杂交瘤细胞系分泌的抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体的重链或轻链可变区的至少一个互补决定区(cdr)的抗体衍生的分子，包括分子例如fab片段、f(ab’)2片段、fd片段、sc抗体(单链抗体)、双体、单抗体轻单链、单抗体重链、抗体链和其他分子之间的嵌合融合体、和抗体偶联物，如与诊断试剂(可检测部分)或治疗剂偶联的抗体，只要这些抗体相关分子保留干扰肝细胞信号转导和/或逆转来自患者的hcc风险特征和/或预防或治疗非hcv相关的肝细胞癌的生物学性质。
在相关的方面，本发明提供用于在患有非hcv相关的肝病的受试者中预防肝细胞癌的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效量的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段的步骤。如上所指出，患有肝病的受试者从未感染hcv或hcv感染已经治愈。
在某些实施方式中，非hcv相关的肝病的根本病因选自乙肝病毒(hbv)感染、酒精中毒、非酒精性脂肪肝病(nafld)、遗传性血色沉着病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、迟发性皮肤卟啉症、wilson病、高酪氨酸血症、糖原贮积病、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和暴露于黄曲霉毒素。在其他实施方式中，非hcv相关的肝病的来源未知。
在另一个相关的方面，本发明提供治疗受试者的非hcv相关的肝细胞癌的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效量的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段的步骤。如上所指出，患有肝细胞癌的受试者从未感染hcv或hcv感染已经治愈。
在某些实施方式中，非hcv相关的肝细胞癌与乙肝病毒(hbv)感染、酒精中毒、非酒精性脂肪肝病(nafld)、遗传性血色沉着病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、迟发性皮肤卟啉症、wilson病、高酪氨酸血症、糖原贮积病、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化或暴露于黄曲霉毒素有关。在其他实施方式中，非hcv相关的肝细胞癌是未知来源的肝细胞癌。
可用于实施本发明的预防方法和本发明的治疗方法的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段如上所述。
在另一个方面，本发明提供包含抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段和至少一种药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物，其用于预防或治疗受试者，即从未感染hcv的受试者或hcv感染已经治愈的受试者的非hcv相关的肝细胞癌。
在某些实施方式中，非hcv相关的肝细胞癌与乙肝病毒(hbv)感染、酒精中毒、非酒精性脂肪肝病(nafld)、遗传性血色沉着病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、迟发性皮肤卟啉症、wilson病、高酪氨酸血症、糖原贮积病、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化或暴露于黄曲霉毒素有关。在其他实施方式中，非hcv相关的肝细胞癌是未知来源的肝细胞癌。
可存在于根据本发明的药物组合物中的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段如上所述。
在某些实施方式中，根据本发明的药物组合物进一步包含额外的治疗剂。所述额外的治疗剂可以选自抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、止痛药、抗微生物剂、抗细菌剂、抗生素、抗氧化剂、防腐剂、抗癌剂和其组合。
在相关的方面，本发明提供抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段用于制备预防和/或治疗受试者的非hcv相关的肝细胞癌的药物。
本发明的这些和其他目的、优点和特征将对阅读以下优选实施方式的详细说明的本领域技术人员显而易见。
附图说明
图1.huh7.5.1dif细胞中cldn1-特异性mab处理后逆转了持续的hcv感染诱导的hcc的186-基因签名。a.将huh7.5.1细胞分化为肝细胞样huh7.5.1dif细胞，用hcvjc1持续感染并在感染后第7天进行埃罗替尼或cldn1-特异性mab处理或不进行处理，然后进行转录组学分析。b.hcve2蛋白的免疫检测(感染的第7天)。将细胞核用dapi染色成蓝色。比例尺50μm。c.gsea显示埃罗替尼或cldn1-特异性mab处理后hcc高和低风险基因的逆转。与埃罗替尼相比，cldn1mab在逆转hcc高风险特征中显示更好的功效。
图2.与病毒载荷无关，cldn1-特异性mab逆转hcc高风险基因比直接作用的抗病毒剂或其他hcc化学预防候选化合物更有效。a.用hcvjc1感染huh7.5.1dif细胞。感染后第7天，用不同的化合物处理细胞。分离总细胞rna并进行nanostring分析。用daa(1nmdcv+1μmsof)、干扰素α-2a(10iu/ml)、埃罗替尼(0.1μm)和吡格列酮(1μm)处理hcvjc1-感染的huh7.5.1dif细胞，部分逆转了hcc高风险基因，如gsea所示。用甲福明二甲双胍(met,3μm)的对照处理没有效果。用cldn1-特异性mab(1、10和100μg/ml)处理有效逆转hcc高风险基因。热图显示hcc高/低风险基因签名诱导或抑制的显著性。b.通过cldn1-特异性mab的基因签名逆转与病毒载荷无关。分析相对的hcvrna表达(标准化至gapdh)。基于细胞的模型中的hcv载荷，平均值±sd，n＝3。fc-倍数变化，dcv-达卡他韦，sof-索非布韦。
图3.cldn1-特异性mab削弱人肝细胞中的egfr/mapk信号转达和表达。a,b.用hcvjc1感染huh7.5.1细胞，并收获用于蛋白质组学分析。用hcvjc1-e2flag感染导致egfr磷酸化增加。a.用人磷酸-rtk阵列试剂盒(r&dsystems)评估细胞裂解物中的受体酪氨酸激酶(rtk)磷酸化。b.使用图像j软件定量磷酸化蛋白质的斑点印迹强度。整合的斑点印迹密度的平均值±sem，n＝3。c-e.未感染的(对照)和hcvjc1-感染的huh7.5.1dif细胞(c；n＝9)；未感染的(对照)和hbv-感染的hepg2-ntcp细胞(d；n＝12)；不存在(对照)或存在40mm乙醇的情况下孵育的huh7.5.1dif细胞(e；n＝6)中egfr和egfmrna表达(相对于gapdhmrna)。显示平均百分比±sem。*mann-whitneyu-检验(p-值<0.01)。f.cldn1-特异性mab削弱hcv诱导的宿主细胞信号转导。用人磷酸激酶阵列检测用对照或cldn1-特异性mab(100μg/ml；24h)处理的慢性hcvjc1-感染的huh7.5.1细胞中的激酶磷酸化。利用图像j软件定量f中黑色方框示出的p-erk1/2(nih)。结果显示为重复两次的独立实验的整合的斑点印迹密度的平均值±sem。g.通过cldn1-特异性mab处理逆转egfr-mapk信号转导通路表达。huh7.5.1dif细胞感染hcvjc1。分离总rna并进行nanostring分析。图表表示从致癌签名数据库(egfr_up.v1_up)检索的癌症中egfr信号转导的gsea富集得分。
图4.cldn1-特异性mab处理hcvjc1-感染的huh7.5.1dif细胞后抑制egfr和mapk信号转导通路。在两个独立实验中，用hcvjc1感染huh7.5.1dif细胞并用如上所述的mab处理。分离总细胞rna并进行nanostring分析。选择差异表达的基因。将强度表达值标准化并对数转化；差异表达的基因的fdrp值<0.05且倍数变化为±1.9。ingenuity通路分析(
图5.cldn1-特异性mab处理调节hcvjc1-感染的huh7.5.1dif细胞中的nf-κb炎性信号转导通路。在两个独立实验中，用hcvjc1感染huh7.5.1dif细胞并用如上所述的mab处理。分离总细胞rna并进行nanostring分析。选择差异表达的基因。通过使用ingenuity通路分析(
图6.用cldn1-特异性mab处理hcvjc1-感染的huh7.5.1dif细胞抑制肝病诱导基因。在两个独立实验中，用hcvjc1感染huh7.5.1dif细胞并用如上所述的mab处理。分离总细胞rna并进行nanostring分析。选择差异表达的基因。ingenuity通路分析(
图7.在hbv-感染的hepg2-ntcp细胞中，cldn1-特异性mab处理后逆转来自患者的panetiology32-基因hcc风险特征。a.用血清来源的hbv感染hepg2-ntcp细胞并用人cldn1-特异性mab或对照ab处理7天。b.通过qrt-pcr定量相对hbv前基因组的(pg)rna表达证实hbv感染(平均值±sd；n＝3)。c.热图分别显示人cldn1-特异性mab处理后hcc高/低风险基因表达的抑制/诱导。使用biomarkhd，高通量rt-pcr技术评估hcc风险特征的表达。在比例尺中，白色表示抑制的富集，黑色表示诱导的富集。
图8.在乙醇处理的肝细胞中，cldn1-特异性mab处理后逆转来自患者的panetiology32-基因hcc风险特征。a.将huh7.5.1细胞分化为肝细胞样huh7.5.1dif细胞，慢性暴露于乙醇(40mm)并用人cldn1-特异性mab或对照ab处理暴露10天。b.热图分别显示人cldn1-特异性mab处理后hcc高/低风险基因表达的抑制/诱导。使用biomarkhd，高通量rt-pcr技术评估hcc风险特征。在比例尺中，白色表示抑制的富集，黑色表示诱导的富集。
图9.在hcv感染的huh7.5.1dif细胞中，人cldn1-特异性mab处理后逆转与癌症风险增加有关的warburg样代谢转变。a.在持续感染hcv的huh7.5.1dif细胞中进行极性代谢物的分析。hcv感染后十天，提取代谢物并通过质谱学进一步分析。b.肝细胞乳酸盐通量。负值：细胞外部积聚。c.热图和分级群聚显示前15种检测到的代谢物。
图10.病毒感染的肝细胞中，cldn1-特异性mab处理逆转上皮到间质(emt)转化的调节剂。用hcvjc1持续感染huh7.5.1dif细胞，并在感染7天后用cldn1-特异性mab或对照ab处理3天。b.cldn1-特异性mab或对照mab处理后snail1(snai1)、snail2(snai2)和zeb1(zeb1)的相对表达。c.热图显示涉及emt的基因的表达。cldn1-特异性mab处理逆转了emt中通常观察到的基因表达模式。显示的基因属于186-基因hcc风险特征。在比例尺中，白色表示抑制的富集，黑色表示诱导的富集。结果代表重复进行三次的实验。es：富集得分。
图11.在用于肝病和hcc的den小鼠模型中通过cldn1特异性mab预防和治疗肝病。a.所使用的方法。c3h/he小鼠(n＝10)接受den的单次注射(图中d)。den注射十八周后和用抗体处理之前，处死两只小鼠用于基线分析
发明详述
定义
贯穿说明书，使用若干术语，其在以下段落中定义。
如本文所使用，术语“受试者”是指人或另一种哺乳动物(例如，灵长类动物、狗、猫、山羊、马、猪、小鼠、大鼠、兔等)，其可发展肝细胞癌，但可以患有或不患有疾病。非人受试者可以是转基因或其他改造动物。在本发明的许多实施方式中，受试者是人。在这种实施方式中，受试者通常称为“个体”或“患者”，术语“个体”不表示特定年龄，因此涵盖婴儿、儿童、少年和成人。术语“患者”更具体地是指患有疾病的个体。在本发明的实践中，患者通常诊断有肝病。
本文术语“治疗”用于表征目的在于以下的方法或过程：(1)延迟或预防疾病或病症(例如肝细胞癌)的发作；(2)减慢或停止疾病或病症(例如肝病)的症状的进展、加重或恶化；(3)引起疾病或病症的症状改善；或(4)治愈疾病或病症。治疗可以在疾病或病症发作之前施用，用于预防或防止性作用。或者或此外，治疗可以在疾病或病症发作之后施用，用于治疗性作用。
术语“肝细胞癌”和“hcc”在本文中可互换使用。它们是指最常见的肝癌类型，也称为恶性肝细胞瘤。如本文所使用，术语“hcv相关的肝细胞癌”和“hcv相关的肝病”分别是指继发于丙肝病毒(hcv)感染的肝细胞癌和肝病。如本文所使用，术语“非hcv相关的肝细胞癌”是指在从未感染hcv的患者中发展或易于发展的肝细胞癌。“非hcv相关的肝细胞癌”还包括在已经治愈hcv感染的患者中发展或易于发展的肝细胞癌。类似地，术语“非hcv相关的肝病”是指在从未感染hcv的患者中或在已经治愈hcv感染的患者中发展的肝病。非hcv相关的肝细胞癌/肝病的实例包括继发于乙肝病毒(hbv)感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病、遗传性血色沉着病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、一些卟啉症、wilson病、黄曲霉毒素暴露、2型糖尿病、肥胖等的肝细胞癌/肝病，以及未知来源的肝细胞癌/肝病。
“药物组合物”在本文中定义为包含有效量的至少一种抗紧密连接蛋白1抗体(或其生物学活性片段)和至少一种药学可接受的载体或赋形剂。
如本文所使用，术语“有效量”是指足以实现其预定目的，例如在细胞、组织、系统或受试者中的期望的生物学或医学反应的化合物、试剂、抗体或组合物的任何量。例如，在本发明的某些实施方式中，目的可以是：预防肝细胞癌的发作；减慢、减轻或停止肝病或肝细胞癌的症状的进展、加重或恶化；引起疾病症状的改善；或治愈肝细胞癌。
术语“药学可接受的载体或赋形剂”是指不干扰活性成分的生物活性的效力且在其施用浓度不对宿主产生过度毒性的载体介质。所述术语包括溶剂、分散体、介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸附延迟剂等。为药物活性物质使用这种介质和试剂是本领域所众所周知的(例如参见“remington’spharmaceuticalsciences”,e.w.martin,第18版,1990,mackpublishingco.:easton,pa，其全文通过引用引入本文)。
术语“人紧密连接蛋白-1或人cldn1”是指具有ncbi登录号np_066924所示序列的蛋白质，或hcv允许人群中通常发现的任何天然存在的变体。术语紧密连接蛋白-1的“细胞外域”或“胞外域”是指延伸入细胞外空间(即细胞的外部空间)的紧密连接蛋白-1序列的区域。
如本文所使用，术语“抗体”是指结合特异性表位的任何免疫球蛋白(即完整的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的活性部分等)。所述术语涵盖单克隆抗体和多克隆抗体。保持特异性结合能力的其所有衍生物和片段也包括在该术语中。所述术语还覆盖具有结合结构域的任何蛋白质，其与免疫球蛋白结合结构域同源或在很大程度上同源。这些蛋白质可以是天然来源，或部分或完全合成制备。
当用于指抗体时，术语“特异性结合”是指抗体结合预先确定的抗原。通常，抗体以至少1x107m-1的亲合力结合，且以比结合非特异性抗原(例如bsa、酪蛋白)的亲合力至少大两倍的亲合力结合预先确定的抗原。
如本文所使用，关于蛋白质或多肽的术语“分离的”是指借助于其来源或操作从至少一些与其天然相关或当最初获得时与其相关的组分分离的蛋白质或多肽。或者或此外，“分离的”是指由人制备或合成的目标蛋白质或多肽。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用，且是指各种长度的，其中性(不带电的)形式或作为盐，和未改性的或通过糖化、侧链氧化或磷酸化改性的氨基酸序列。在某些实施方式中，氨基酸序列是全长天然蛋白质。在其他实施方式中，氨基酸序列是全长蛋白质的较小片段。仍在其他实施方式中，氨基酸序列通过以下改性：与氨基酸侧链连接的其他取代基例如糖基单元、脂质或无机离子例如磷酸盐，以及与链的化学转化例如巯基氧化有关的修饰。因此，术语“蛋白质”(或其等效术语)旨在包括经历不显著改变其特性的那些修饰的全长天然蛋白质的氨基酸序列或其片段。尤其是，术语“蛋白质”涵盖蛋白质亚型，即由相同基因编码、但其pi或mw或两者不同的变体。这种亚型的氨基酸序列可以不同(例如，作为等位基因变异、选择性剪接或有限蛋白质水解的结果)，或者，可以由不同的翻译后修饰(例如糖化、酰化、磷酸化)而产生。
如本文中所使用，关于蛋白质的术语“类似物”是指具有与蛋白质类似或相同的功能但是不必一定包含与蛋白质的氨基酸序列类似或相同的氨基酸序列或与蛋白质的结构类似或相同的结构的多肽。优选地，在本发明范围内，蛋白质类似物具有与蛋白质的氨基酸序列至少30％、更优选至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。
如本文中所使用，关于蛋白质的术语“片段”或术语“部分”是指包含蛋白质的氨基酸序列的至少5个连续的氨基酸残基(优选至少约：10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250或更多个氨基酸残基)的氨基酸序列的多肽。蛋白质片段可以具有或不具有蛋白质的功能活性。
如本文中用于表征蛋白质变体、类似物或片段的术语“生物学活性”是指与蛋白质共有足够的氨基酸序列一致性或同源性以显示与蛋白质类似或相同的性质的分子。例如，在本发明的许多实施方式中，抗紧密连接蛋白-1抗体的生物学活性片段是保留抗体干扰肝细胞信号转导和逆转来自患者的hcc风险特征的能力的片段。
如本发明所使用，术语“同源的”(或“同源性”)和术语“一致性”同义，是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较的序列中的位置被相同碱基或相同的氨基酸残基占据时，则改分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比对应于两个序列共有的匹配或同源位置的数量除以比较的位置数再乘以100。当比对两个序列以提供最大同源性时，进行比较。同源的氨基酸序列具有相同或类似的氨基酸序列。类似的残基是参考序列中对应的氨基酸残基的保守替换或“允许的点突变”。参考序列中残基的“保守替换”是物理上或功能上与对应的参考残基，例如具有类似的大小、形状、电荷、包括形成共价键或氢键的能力的化学性质等的那些类似的替换。特别优选的保守替换是满足如dayhoff等描述为“接受的点突变”定义的标准的那些(“atlasofproteinsequenceandstructure”,1978,nat.biomed.res.foundation,washington,dc,suppl.3,22:354-352)。
术语“标记的”、“用可检测的试剂标记”和“用可检测的部分标记”在本文中可互换使用。这些术语用于规定例如结合另一个实体(例如抗原)后，可以被看见的实体(例如抗体)。优选地，选择可检测的试剂或部分使得它产生可以测量且其强度与结合实体的量有关的信号。用于标记蛋白质和多肽包括抗体的方法是本领域众所周知的。可以通过加入标记或与标记偶联来制备标记的多肽，所述标记可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法或任何其他合适的方法直接或间接检测。适合的可检测试剂包括但不限于各种配体、放射性核素、荧光染料、化学发光剂、微粒、酶、比色标记、磁性标记和半抗原。
如本文中所使用，关于数字的术语“大约”和“约”通常包括在数字任一方向(大于或小于所述数字)落入10％范围内的数字，除非另有说明或从上下文中显而易见(除了当这种数字可能超过可能值的100％)。
某些优选实施方式的详细说明
如上所述，本发明涉及使用抗紧密连接蛋白-1抗体来预防和/或治疗肝细胞癌，尤其用于预防和/或治疗非hcv相关的肝细胞癌。
i-抗紧密连接蛋白-1抗体
本申请人之前开发了针对人紧密连接蛋白-1的单克隆抗体并证实这些单克隆抗体在体内治愈hcv感染，而无可检测的副作用(ep08305597和wo2010/034812)。他们现在证实，这些单克隆抗体在基于肝细胞的模型系统中干扰肝细胞信号转导并逆转来自患者的hcc风险特征，以及调节信号转导和转录重编程与抗体的抗病毒活性无关。
人紧密连接蛋白1(cldn1)是各种组织中表达的紧密连接蛋白。在肝细胞中，它在形成分离血液和胆汁的屏障中起重要作用(zona等,viruses,2014,6(2):875-892)。已经表明，cldn1在hcv相关的肝病中起双重作用：它作为感染开始、传播和维持所需的病毒细胞进入因子是hcv感染的重要的宿主因子(evans等,nature,2007,446(7137):801-805；mailly等,“clearanceofpersistenthepatitiscvirusinfectionusingaclaudin-1-targetingmonoclonalantibody”,natbiotech,2015,iniress)。此外，已经报道cldn1经由细胞信号转导调节(suh等,oncogene,2013,32(41):4873-4882)或经由基质金属蛋白酶表达的诱导(oku等,cancerres,2006,66(10):5251-5257)参与致癌作用。此外，与非患病肝组织相比，已经表明cldn1表达在hcc中升高(stebbing等,oncogene,2013,32(41):4871-4872)。
可用于实施本发明的抗紧密连接蛋白1抗体包括针对紧密连接蛋白1产生且在例如基于肝细胞的模型系统中显示干扰肝细胞信号转导并逆转来自患者的hcc风险特征的任何抗体。
可用于实施本发明的抗紧密连接蛋白1抗体的实例尤其包括本申请人开发的多克隆和单克隆抗cldn1抗体(参见ep08305597和wo2010/034812,fofana等,gastroenterology,2010,139(3):953-64,964.e1-4)。如这些文献所描写，已经通过基因免疫制备了八种单克隆抗体并显示通过靶向紧密连接蛋白-1的胞外域有效抑制hcv感染。利用感染性hcv模型系统和人原代肝细胞，已经表明这些单克隆抗-cldn1抗体有效抑制个体患者中所有主要基因型的hcv感染以及高度变化的hcv准种。此外，在六位在肝移植期间再感染hcv的患者中，这些抗体有效阻断耐中和抗体的高度感染性hcv逃逸变体的进入。单克隆抗-cldn1抗体称为om-4a4-d4、om-7c8-a8、om-6d9-a6、om-7d4-c1、om-6e1-b5、om-3e5-b6、om-8a9-a3和om-7d3-b3。因此，适合的抗紧密连接蛋白1抗体是由inserm(申请人之一)和genovac于2008年7月29日以选自下组的保藏号保藏于dsmz(deutschesammlungvonmikro-organismenundzellkuturengmbh,inhoffenstraβe7b,38124braunschweig,germany)的任何一个杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体：dsmacc2931、dsmacc2932、dsmacc2933、dsmacc2934、dsmacc2935、dsmacc2936、dsmacc2937和dsmacc2938(描述于ep08305597和wo2010/034812)。
其他适合的抗紧密连接蛋白1抗体的实例包括欧洲专利号ep1167389、美国专利号6,627,439、公开号wo201/132307的国际专利申请和公开号wo2015/014659和wo2015/014357的国际专利申请、和yamashita等,j.pharmacol.exp.ther.,2015,353(1):112-118中公开的那些。
适用于本发明的抗紧密连接蛋白1抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
除了使用上述杂交瘤作为抗体来源，抗紧密连接蛋白1抗体可以通过本领域已知的任何其他适合的方法制备。例如，抗紧密连接蛋白1单克隆抗体可通过重组dna方法制备。这些方法通常涉及分离编码期望抗体的基因、将所述基因转入适合的载体并在细胞培养系统中大量表达。编码期望单克隆抗体的基因或dna可以容易地分离并利用常规程序(例如，使用能够特异性结合编码鼠源抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)测序。杂交瘤细胞系可以作为这种dna的优选来源。用于重组生产抗体的适合的宿主细胞包括但不限于适当的哺乳动物宿主细胞，例如cho、hela或cv1。适合的表达质粒包括但不限于pcdna3.1zeo、pind(sp1)、prep8(均可从invitrogen,carlsbad,ca,usa商购)等。抗体基因可经由病毒或逆转录病毒载体表达，包括基于mlv的载体、基于牛痘病毒的载体等。可使用标准方法在适合的培养基例如诸如dmem和rpmi-1640培养基中生长细胞。抗紧密连接蛋白1抗体可以表达为单链抗体。可通过标准方法分离和纯化重组制备的抗体。例如，可通过蛋白a纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析例如蛋白a柱、羟基磷灰石层析、凝集素层析或这些方法的任何适合的组合从细胞培养物回收和纯化抗紧密连接蛋白1单克隆抗体。高效液相色谱法(hplc)也可用于纯化。
或者，用于本发明的抗紧密连接蛋白1抗体可获得自商业来源。
在某些实施方式中，抗紧密连接蛋白1抗体以其天然形式使用。在其他实施方式中，它是截短的(例如经由酶促裂解或其他适合的方法)以提供免疫球蛋白片段或部分，尤其是生物学活性的片段或部分。抗紧密连接蛋白1抗体的生物学活性的片段或部分包括例如在基于肝细胞的模型系统例如本申请人使用的186-肝基因签名系统(参见以下实施例)中保留抗体干扰肝细胞信号转导和逆转来自患者的hcc风险特征的能力，和/或预防肝细胞癌和/或治疗肝细胞癌的能力的片段或部分。
抗紧密连接蛋白1抗体的生物学活性的片段或部分可以是抗体(例如包含抗紧密连接蛋白1单克隆抗体的全部6个cdr的抗体)的fab片段或部分、f(ab’)2片段或部分、可变域、一个或多个cdr(互补决定区)。或者，抗紧密连接蛋白1抗体的生物学活性的片段或部分可以源自抗体蛋白质的羧基部分或末端并可以包含fc片段、fd片段或fv片段。
本发明的抗紧密连接蛋白1抗体的片段可通过包括但不限于酶促裂解(例如完整抗体的蛋白水解消化)的本领域已知的任何适合的方法或通过合成或重组技术制备。f(ab')2、fab、fv和scfv(单链fv)抗体片段例如可以在哺乳动物宿主细胞或大肠杆菌中表达并由其分泌。可以利用其中在天然停止位点上游引入一种或多种终止密码子的抗体基因来制备多种截短形式的抗体。抗体的各种部分可以通过常规方法化学连接在一起，或可以利用遗传工程技术制备为连续蛋白质。
适合用于本发明的抗紧密连接蛋白1抗体(或其生物学活性片段)可以制备为改性形式例如融合蛋白(即与多肽实体连接的免疫球蛋白分子或部分)。优选地，融合蛋白保留抗体的生物学性质。可以选择待与抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段融合的多肽实体以赋予所得融合蛋白许多有利的性质。例如，可以选择多肽实体以使重组融合蛋白的表达升高。或者或此外，多肽实体可以例如通过作为亲和纯化中的配体促进融合蛋白的纯化。可以将蛋白水解的裂解位点添加到重组蛋白质，使得纯化后目标序列可以最终与多肽实体分离。当目标是稳定性时，还可以选择多肽实体以赋予融合蛋白改进的稳定性。适合的多肽实体的实例包括例如，多聚组氨酸标签，其允许所得融合蛋白在镍螯合柱上容易纯化。谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、麦芽糖b结合蛋白或蛋白a是适合的多肽实体的其他实例。
可以将用于本发明的抗紧密连接蛋白1抗体再工程化从而优化稳定性、溶解度、体内半衰期或结合其他靶标的能力。实现这些性质变化的任何一种或全部的遗传工程方法以及化学修饰是本领域众所周知的。例如，已知抗体恒定区的添加、去除和/或修饰在治疗性施用的抗体的生物利用率、分布和半衰期中起重要的作用。当存在时，通过抗体的fc或恒定区(其介导效应子功能)测定的抗体类别和亚类赋予重要的额外性质。
本发明的其他融合蛋白可通过本领域众所周知的dna改组技术来产生(例如参见美国专利号5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458)。
也可以将适用于本发明的抗紧密连接蛋白1抗体“人源化”：啮齿动物抗体和人序列之间的序列差异可以通过单个残基的定点突变或通过接枝整个区域或通过化学合成来替代不同于人序列的残基而最小化。人源化抗体也可以利用重组方法制备。在抗体的人源化形式中，cdr区域外的一些、大部分或全部氨基酸用来自人免疫球蛋白分子的氨基酸替换，而一个或多个cdr区域内的一些、大部分或全部氨基酸保持不变。氨基酸的小的添加、缺失、插入、替换或修饰是允许的，只要它们不明显改变所得抗体的生物活性。适合的人“替换”免疫球蛋白分子包括igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg3、igg4、iga、igm、igd或ige分子及其片段。或者，存在于啮齿动物抗体中的t细胞表位可以通过突变(去免疫)修饰以生成可应用于人的治疗性目的的非免疫原性的啮齿动物抗体(参见网页：accurobio.com)。
可以将适用于本发明的抗紧密连接蛋白1抗体(或其生物学活性片段)功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)到一个或多个其他分子实体。制备这种改性抗体(或偶联抗体)的方法是本领域已知的(例如参见“affinitytechniques.enzymepurification:partb”,methodsinenzymol.,1974,vol.34,jakobyandwilneck(eds.),academicpress:newyork,ny；和wilchekandbayer,anal.biochem.,1988,171:1-32)。优选地，将分子实体连接到不干扰所得偶联物的结合性质的抗体分子的位置，例如，不参与抗体与其靶标的特异性结合的位置。
抗体分子和分子实体彼此可以共价、直接连接。或者，抗体分子和分子实体可以通过接头基团彼此共价连接。这可以利用本领域众所周知的多种稳定的双功能试剂的任何一种，包括同功能和异功能接头来完成。
在某些实施方式中，可以将用于本发明的抗紧密连接蛋白1抗体(或其生物学活性片段)与治疗性部分偶联。多种治疗性部分的任一种可适用于实施本发明，包括但不限于细胞毒素(例如细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂和放射性金属离子(例如α-发射器和与大环螯合剂例如dota连接的α发射器)。细胞毒素或细胞毒性试剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括但不限于，紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊甙、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽杆菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、地卡因、利度卡因、心得安、胸苷激酶、核酸内切酶、rnase、和嘌呤霉素及其片段、变体或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)、烷化剂(例如甲二氯二乙胺、噻替哌苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和环己亚硝脲(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素c和顺式二氯二胺铂(ii)(ddp)顺式铂氨)、蒽环类(例如柔红霉素和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素、博来霉素、光神霉素和安曲霉素)和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
其他的治疗性部分包括具有期望生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质包括但不限于毒素(例如相思豆毒素、篦麻毒素a、α毒素、假单胞菌外毒素、白喉毒素、皂草素、木鳖子甙、白树毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、α八叠球菌和霍乱菌毒素)；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原激活物；细胞凋亡剂(例如tnf-α、tnf-β)或生物反应调节剂(例如淋巴细胞活素、白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-6(il-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)或其他生长因子)。
或者或此外，可以将本发明抗体(或其生物学活性片段)与可检测试剂偶联。多种可检测试剂的任一种可用于实施本发明，包括但不限于：各种配体、放射性核素(例如3h、125i、131i等)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青素、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和胺荧)、化学发光试剂(例如荧光素、荧光素酶和发光蛋白质)、微粒(诸如例如量子点、纳米晶体、磷光体等)、酶(诸如例如elisa中使用的那些，即辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记、磁性标记和生物素、地高辛或其他的半抗原和可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白质。
可以与本发明抗体(或其生物学活性片段)偶联的其他分子实体包括但不限于直链或支链亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。
因此，在本发明的实施中，抗紧密连接蛋白1抗体可以以下形式使用：全长抗体、其生物学活性的变体或片段、嵌合抗体、人源化抗体、和包含至少一个来自抗紧密连接蛋白1抗体的重链或轻链可变区的互补决定区(cdr)的抗体衍生的分子，包括分子例如fab片段、f(ab’)2片段、fd片段、fabc片段、sc抗体(单链抗体)、双体、单抗体轻单链、单抗体重链、抗体链和其他分子之间的嵌合融合物、和抗体偶联物，例如与治疗剂或可检测试剂偶联的抗体。优选地，将表明，根据本发明的抗紧密连接蛋白1抗体相关分子干扰肝细胞信号转导并逆转来自患者的hcc风险特征(例如本申请人使用的186-肝基因签名系统–参见实施例)。
本领域技术人员将理解靶向紧密连接蛋白1的其他化合物可用于实施本发明，包括但不限于小分子和sirna。
ii-治疗或预防肝细胞癌
a.适应症
本申请人表明，抗紧密连接蛋白1抗体比抗病毒剂和用于hcc化学保护的其他候选化合物在逆转hcc高风险特征方面更有效。因此，抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段可用于预防和/或治疗肝细胞癌的预防性和治疗性方法。
本发明治疗方法可使用抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段或包含这种抗体或片段的药物组合物来实现(见下文)。这些方法通常包括向需要的受试者施用有效量的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段或其药物组合物。可通过本领域技术人员已知的任何施用方法进行施用。
尤其是，本发明提供用于预防患有肝病的患者发展肝细胞癌的方法。肝病或肝病理可以是肝炎、肝纤维化和/或肝硬化。
在本发明的实施中，肝病的根本病因不是hcv感染。因此，本发明提供用于预防和/或治疗非hcv相关的肝细胞癌，即用于预防和/或治疗在从未感染hcv的患者或hcv感染已经治愈的患者中发展或易于发展的肝细胞癌的方法。
在本发明的某些实施方式中，肝病的根本病因是hbv感染。慢性感染hbv导致肝硬化，且慢性hcv感染是造成肝癌是全世界许多地方最常见的癌症的原因。全世界约20亿人感染hbv。在感染率普遍较低的西方工业化国家中，患有hbv和/或hcv感染的人的hcc风险约高20倍。
或者，肝病可以是酒精性肝病，其中肝病的根本原因是酒精中毒。酒精摄入已被确认为慢性肝病包括肝细胞癌的病因。酒精可能通过直接(遗传毒性)和间接机制参与hcc的发展。间接机制包括发展肝硬化，其可能是发达国家中发生肝癌最常见的途径。
在本发明的其他实施方式中，肝病的根本病因是非酒精性脂肪肝病(nafld)。nafld是西方工业化国家最常见的肝病。认为它是代谢综合征的肝表现。因此，nafld倾向于在超重或肥胖，和/或具有糖尿病、高胆固醇或高甘油三酯的人中发展。对于大多数人，nafld没有体征和症状，且没有并发症。然而，在一些患有nafld的人中，肝中积累的脂肪可以引起炎症并在肝中形成瘢痕，据信这导致纤维化和肝硬化。这种更严重的nafld形式曾经称为非酒精性脂肪性肝炎。值得注意的是，代谢综合征和2型糖尿病已被证明是hcc的独立的风险因素。
仍然在其他实施方式中，肝病的根本病因是遗传性代谢疾病，例如遗传性血色沉着病。患有遗传性血色沉着病的人从他们的食物中吸收过多铁。铁在整个机体的组织包括肝中沉积。如果在肝中积累了足够的铁，它可以导致肝硬化。作为肝细胞癌的风险因子的其他遗传性代谢疾病包括α1抗胰蛋白酶缺乏症、迟发性皮肤卟啉症、wilson病、高酪氨酸血症和糖原贮积病。
仍然在其他实施方式中，肝病的根本病因是自身免疫性肝炎(也称为狼疮样肝炎)。自身免疫性肝炎是当机体的免疫系统攻击肝细胞导致肝发炎时发生的慢性肝病。另一种影响肝脏且可以引起肝硬化的自身免疫性疾病是原发性胆汁性肝硬化或pbc。pbc是自身免疫性病症，其中免疫系统缓慢攻击肝脏中的胆管。当胆管被损坏时，胆汁这些肝脏中积累并且随时间损伤组织。这可以导致形成瘢痕、纤维化和肝硬化。
在其他实施方式中，肝病的根本病因是暴露于黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是在储存差的作物(例如花生、小麦、大豆、玉米和大米)上生长的真菌产生的毒物。长期暴露于这些物质是肝癌的主要风险。在患有hcv或hbv感染的人中，风险更加增加。在发达国家中，食物中黄曲霉毒素的含量通过测试调节。黄曲霉毒素污染在非洲和亚洲的某些地方更常见。
仍然在其他实施方式中，肝病的根本病因未知或肝病由仍待发现的试剂引起，所述试剂包括遗传来源的试剂、感染剂或化学和/或物理肝毒性试剂。
根据本发明向患有非hcv相关的肝病的患者施用抗紧密连接蛋白1抗体或其药物组合物可以减缓、降低、停止或减轻肝病的进展，尤其是肝硬化和/或肝细胞癌的进展，或将进展逆转到治愈肝病的程度。
或者或此外，根据本发明向患有非hcv相关的肝病的患者施用抗紧密连接蛋白1抗体或其药物组合物可以导致个体经历的至少一种症状的改善，所述症状包括但不限于食欲降低、重量减轻、疲劳、腹痛、黄疸、发痒、流感样症状、肌肉疼痛、关节疼痛、间断性低烧、发痒、睡眠障碍、恶心、腹泻、消化不良、认知改变、抑郁、头痛和情绪波动；肝硬化症状例如腹水、瘀伤和出血倾向、骨疼痛、静脉曲张(特别在胃和食道)、脂肪泻、黄疸和肝原性脑病。
或者或此外，根据本发明向患有非hcv相关的肝病的患者施用抗紧密连接蛋白1抗体或其药物组合物可以导致预防肝移植。
根据发明的治疗的作用可以使用本领域已知的任何用于诊断影响患者的肝病的试验来监控。这种试验包括但不限于血清学验血和测量一个或多个白蛋白、谷丙转氨酶(alt)、碱性磷酸酶(alp)、天冬氨酸转氨酶(ast)和γ谷酰基转肽酶(ggt)的肝功能试验，和肝脏成像技术例如磁共振弹性成像(mre)、磁共振成像(mri)、计算机化断层成像(ct)和超声。也可以进行活检。
如以下实施例所描述，这种试验也可以包括分析获得自接受根据本发明的治疗的受试者的生物样品中肝细胞信号转导、转录或蛋白质组变化。可以分析的肝细胞包括肝实质细胞、库柏法细胞、星状细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和免疫细胞，包括但不限于t细胞、b细胞和nk细胞。
在某些实施方式中，根据本发明的预防或治疗方法单独施用抗紧密连接蛋白1抗体(或其生物学活性片段)或其药物组合物。在其他实施方式中，将抗紧密连接蛋白1抗体(或其生物学活性片段)或其药物组合物与至少一种额外的治疗剂组合施用。抗紧密连接蛋白1抗体(或其生物学活性片段)或其药物组合物可以在施用治疗剂之前、与治疗剂同时、和/或在施用治疗剂之后施用。
可以与抗紧密连接蛋白1抗体(或其生物学活性片段)或其药物组合物组合施用的治疗剂可以选自本领域已知的在治疗肝病和/或治疗肝病的根本病因中具有有益作用的大量生物学活性化合物。将如本领域技术人员所理解，治疗剂将取决于影响患者的肝病的性质而不同。
例如，当患者患有与hbv感染有关的肝病时，治疗剂可以是用于在hbv感染患者中预防hcc的聚乙二醇化干扰素(peg-ifn)或核苷或核苷酸类似物。在酒精性肝病的情况下，治疗剂可以是皮质类固醇和/或抗氧化剂例如s-腺苷甲硫氨酸。当患者患有非酒精性脂肪肝病时，治疗剂可以是胰岛素敏化剂(例如甲福明二甲双胍和噻唑烷二酮类药物，如吡格列酮)、熊去氧胆酸和降脂药、维生素e和他汀类药物。在遗传性血色沉着病的情况下，治疗剂可以是铁螯合药(例如氯奎和羟氯奎)。对于α1抗胰蛋白酶缺乏肝病，治疗剂可以是α1抗胰蛋白酶的吸入形式。对于迟发性皮肤卟啉症，治疗剂可以是铁螯合药物(例如氯奎和羟氯奎)。在wilson病的情况下，治疗剂可以是铜螯合药物(例如青霉胺和盐酸曲恩汀)和乙酸锌，其预防机体从食物吸收铜。在自身免疫性肝炎的情况下，治疗剂可以是皮质类固醇和/或免疫系统抑制剂。对于原发性胆汁性肝硬化，治疗剂可以是熊去氧胆酸(其是显示疾病进展的主要药物)、免疫抑制剂、氨甲喋呤、皮质类固醇、环孢菌素和止痒剂。
b.施用
可以通过任何适合的途径向需要的受试者施用期望剂量的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段(任选和一种或多种适当的药学可接受的载体或赋形剂配制后)。各种递送系统是已知的且可用于施用抗体，包括片剂、胶囊、可注射溶液、包封于脂质体中、微粒、微囊等。施用方法包括但不限于真皮、皮内、肌内、腹腔内、病灶内、静脉内、皮下、鼻内、经肺、硬膜外、经眼和口服途径。抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段或其药物组合物可以通过任何方便的或其他适当途径施用，例如通过输注或推注、通过上皮或粘膜皮肤组织(例如口腔、粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收。施用可以是全身或局部的。肠胃外施用可以优选定向患者的肝脏，例如通过插管术到肝动脉或进入胆管或进入门静脉。将如本领域技术人员所理解，在其中本发明抗体与额外的治疗剂组合施用的实施方式中，抗体和治疗剂可通过相同途径(例如静脉内)或通过不同途径(例如静脉内和经口)施用。
c.剂量
将以使得递送量对于意欲目的有效的剂量施用抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段(任选和一种或多种适当的药学可接受的载体或赋形剂配制后)。施用途径、施用制剂和剂量将取决于期望的治疗性作用、待治疗病症的严重程度(如果已经存在)、任何感染的存在、患者的年龄、性别、体重和总体健康状况、以及所使用抗体或组合物的功效、生物利用率和体内半衰期、使用(或不使用)伴随治疗、和其他临床因素。主治医师在治疗期间容易确定这些因素。或者或此外，待施用剂量可以从使用动物模型(例如黑猩猩或小鼠)的研究确定。基于这些或其他方法调节剂量以实现最大功效是本领域众所周知的且在受训医师的能力范围内。随着使用抗紧密连接蛋白1抗体研究的进行，将显现关于适当的剂量水平和治疗持续时间的进一步信息。
根据本发明的治疗可以由单剂量或多剂量组成。因此，抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段(或其药物组合物)的施用可以是某一时间段恒定的或以特定间隔，例如小时、天、周(或一些其他多天间隔)、月、年(例如以时间释放形式)周期性的。或者，递送可以在给定时间段期间多次发生，例如每周两次或多次；每月两次或多次；等。递送可以连续递送一段时间，例如，静脉内递送。
通常，施用的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段(或其药物组合物)的量将优选为约1ng/kg-约100mg/kg受试者体重，例如，约100ng/kg-约50mg/kg受试者体重；或约1μg/kg-约10mg/kg受试者体重，或约100μg/kg-约1mg/kg受试者体重。
在某些实施方式中，施用的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段(或其药物组合物)的量将使得所述量对hcv载荷无效(如果向hcv感染患者施用)。
iii-药物组合物
如上所述，抗紧密连接蛋白1抗体(和相关分子)可以单独施用或作为药物组合物施用。因此，本发明提供一种用于预防或治疗肝细胞癌的包含有效量的本文所述抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段和至少一种药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在一些实施方式中，所述组合物进一步包含一种或多种额外的生物活性剂。
抗体或药物组合物可以以实现期望的预防性和/或治疗性作用的任何量和任何施用途径来施用。优化的药物制剂可以根据施用途径和所需剂量改变。这种制剂可以影响施用的活性成分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
本发明的药物组合物可以配制为单位剂型，以便于施用和剂量一致性。如本文所使用，表述“单位剂型”是指用于待治疗患者的抗紧密连接蛋白1抗体或其生物学活性片段的物理离散单位。然而，将理解，组合物的每日总剂量将由主治医师在合理医学判断的范围内决定。
a.制剂
可根据已知技术使用适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂的无菌可注射溶液、悬浮液或乳剂，例如2,3-丁二醇溶液。可使用的可接受的媒介和溶剂是水、林格氏溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油通常用作溶液或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单或二甘油酯。脂肪酸例如油酸也可以用于制备可注射制剂。无菌液体载体可用于胃肠外施用的无菌液体形式组合物。
可以通过保留细菌的过滤器、或通过在使用前加入可溶于或分散于无菌水或其他无菌可注射介质的无菌固体组合物形式的杀菌剂来灭菌可注射制剂。作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可以通过例如静脉内、肌内、腹腔内或皮下注射施用。注射可经由单一推注或通过逐步输注。必要时或期望时，组合物可以包括局部麻醉剂以在注射位点镇痛。
为了延长活性成分(本文是抗紧密连接蛋白-1抗体或其生物学活性片段)的作用，通常期望从皮下或肌肉注射减缓成分的吸收。胃肠外施用的活性成分的延迟吸收可通过将成分溶于或悬浮于油媒介中来实现。可注射贮库形式通过在生物可降解聚合物例如聚乳酸-聚乙醇酸中形成微包封的活性成分基质来制备。取决于活性成分与聚合物的比例和所使用的特定聚合物的性质，可以控制成分释放的速率。其他的生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。贮库型可注射制剂也可通过将活性成分截留在与机体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。
用于口服施用的液体剂型包括但不限于药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆、酏剂和加压组合物。除抗紧密连接蛋白-1抗体或其生物学活性片段之外，液体剂型可以包含本领域常用的惰性稀释剂，例如诸如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂，口服组合物还可以包括佐剂例如润湿剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服施用的适合的液体载体的实例包括水(可能包含如上添加剂，例如纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠溶液)、乙醇(包括一元醇和多元醇例如乙二醇)及其衍生物、和油(例如分馏的椰子油和花生油)。对于加压组合物，液体载体可以是卤代烃或其他药学可接受的推进剂。
用于口服施用的固体剂型包括例如，胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在这种固体剂型中，抗紧密连接蛋白-1抗体或其生物学活性片段可以与至少一种惰性的、生理学可接受的赋形剂或载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和一种或多种以下成分混合：(a)填充剂或补充剂例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂例如诸如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(c)湿润剂例如甘油；(d)崩解剂例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(e)溶液阻滞剂例如石蜡；吸收促进剂例如季铵化合物；(g)润湿剂例如诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸收剂例如高岭土和皂土；和(i)润滑剂例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷硫酸钠及其混合物。适于固体剂型的其他赋形剂包括表面改性剂例如非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、鲸蜡硬脂醇、聚乙二醇乳化蜡、失水山梨醇酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基磺酸钠、硅酸镁铝和三乙醇胺。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
类似类型的固体组合物也可以使用赋形剂如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等作为填充剂的软和硬填充的明胶胶囊。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可以用包衣和壳体例如肠溶衣、控制释放包衣和药物配制领域众所周知的其他包衣来制备。它们可以任选包含遮光剂，且可以是使得它们仅或优选在肠道的某一部分和任选的以延迟方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。
在某些实施方式中，期望将本发明组合物局部施用于需要治疗的区域(例如肝脏)。这可以通过例如但不限于在外科手术期间(例如肝移植)局部输注、局部施用、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过皮肤贴片或支架或其他植入物来实现。
对于局部施用，优选将组合物配制为凝胶、软膏、洗液或霜剂，其可以包括载体例如水、甘油、乙醇、丙二醇、脂肪醇、甘油三酯、脂肪酸酯或矿物油。其他局部载体包括液体石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95％)、水中的聚氧乙烯单月桂酸酯(polyoxyethylenemonolaurat)(5％)或水中的十二烷硫酸钠(5％)。可以根据需要添加其他材料例如抗氧化剂、湿润剂、粘度稳定剂和类似的试剂。
此外，在某些情况下，预期将药物组合物放置在置于皮肤上、皮肤中或皮肤下的透皮装置内。这种装置包括通过被动或主动释放机制释放活性成分的贴片、植入物和注射剂。透皮施用包括跨越机体表面和机体通道内部组织包括上皮和粘膜组织的所有施用。这种施用可以使用洗液、霜剂、泡沫、贴片、悬浮液、溶液和栓剂(直肠和阴道)的本发明的组合物进行。
透皮施用可通过使用包含活性成分(即抗紧密连接蛋白-1抗体或其生物学活性片段)和载体的透皮贴剂来实现，所述载体对皮肤无毒并允许将用于全身吸收的成分经由皮肤递送入血流。载体可以采取许多形式，例如霜剂和软膏、糊剂、凝胶和闭合装置。霜剂和软膏可以是水包油或油包水型的粘性液体或半固体乳剂。由包含活性成分的分散于石油或亲水性石油中的吸收性粉末组成的糊剂可能是适合的。可使用多种闭合装置来将活性成分释放入血流，例如覆盖包含活性成分(含或不含载体)的贮库的半渗透膜或包含活性成分的基质。
栓剂制剂可以由常规材料制备，包括可可脂(添加或不添加蜡以改变栓剂的熔点)和甘油。也可以使用水溶性的栓剂基质，例如不同分子量的聚乙二醇。
用于生产各种制剂的材料和方法是本领域已知的，且可以为实施本发明而调整。用于递送抗体的适合的制剂可以发现于例如“remington’spharmaceuticalsciences”,e.w.martin,第18版,1990,mackpublishingco.:easton,pa。
b.额外的生物活性剂
在某些实施方式中，抗紧密连接蛋白-1抗体或其生物学活性片段是本发明药物组合物中的唯一活性成分。在其他实施方式中，药物组合物进一步包含一种或多种生物活性剂。适合的生物活性剂的实例包括但不限于，治疗剂例如抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、止痛药、抗微生物剂、激酶抑制剂、信号转导抑制剂、抗细菌剂、抗生素、抗氧化剂、防腐剂及其组合。
在这种药物组合物中，可以在一种或多种制剂中组合抗紧密连接蛋白-1抗体和额外的治疗剂，用于同时、单独或相继施用抗紧密连接蛋白-1抗体和治疗剂。更具体地，本发明组合物可以以抗体和治疗剂可以一起施用或彼此独立施用的方式配制。例如，抗紧密连接蛋白-1抗体和治疗剂可以一起配制于单个组合物中。或者，他们可以单独保持(例如在不同的组合物和/或容器中)和施用。
c.药物组件或试剂盒
另一方面，本发明提供包含一个或多个容器(例如小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶子)的药物组件或试剂盒，所述容器包含本发明药物组合物的一种或多种成分，允许施用抗紧密连接蛋白-1抗体或其生物学活性片段。
药物组件或试剂盒的不同成分以固体(例如冻干的)或液体形式提供。各成分将通常适于在其各自的容器中等分或以浓缩形式提供。药物组件或试剂盒可以包括用于重组冻干成分的介质。试剂盒的单个容器将优选保持密封，以用于商业销售。
在某些实施方式中，药物组件或试剂盒包括如上所述的一种或多种额外的治疗剂。任选与容器有关的可以是调控药物或生物产品的制备、使用或销售的政府机构规定形式的通知书或包装添加物，所述通知书反映了制备、使用或销售的机构批准用于人施用。通知书或包装添加物可以包含用于根据本文公开的治疗方法的药物组合物的用途的说明书。
标识符例如条形码、无线电频率、id标签等可以存在于试剂盒中或试剂盒上。标识符可用于例如为了质量控制、存货控制、工作站之间的移动跟踪等唯一地鉴定试剂盒。
具体实施方式
以下实施例描述进行和实施本发明的一些优选的方式。然而，应理解实施例仅用于说明性目的而不意味着限制本发明范围。此外，除非实施例中的描述是用过去时态呈现，否则与说明书的其余部分一样，正文并不意欲表明实际进行了实验或实际获得了数据。
以下报告的一些结果显示于底稿中：“aclaudin-1-specificmonoclonalantibodyforpreventionandtreatmentofhepatocellularcarcinoma”，其已经提交出版。
实施例1
材料和方法
试剂和抗体。抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体(抗cldn1mab如之前所述制备(fofana等,gastroenterology,2010,139:953-964,e1-4))。埃罗替尼购自iclaboratories；干扰素-α2a购自roche。达卡他韦和索非布韦由acmebiosciences合成。吡格列酮、甲福明二甲双胍和dmso购自sigma-aldrich。人磷酸-rtk阵列试剂盒获自r&dsystems。ecl试剂和hyperfilms购自gehealthcare。
细胞系。huh7.5.1细胞已有描述(zhong等,procnatlacadsciusa,2005,102(26):9294-9299)。对于增殖抑制和分化(huh7.5.1dif细胞)，将2.5.104-3.104个huh7.5.1细胞在包含1％二甲基亚砜(dmso)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中培养。
huh7.5.1dif细胞的hcv感染。如之前所描述(wakita等,natmed.,2005,11(7):791-796)在huh7.5.1细胞中产生来自细胞培养的hcvccjc1(基因型2a/2a)(pietschmann等,procnatlacadsciusa,2006,103(19):7408-7413)。如之前所述，通过计算感染实验中50％组织培养物感染剂量(tcid50)测定hcvcc感染性(lindenbach等,science,2005,309(5734):623-626)。通过胞内hcvrna的qrt-pcr(xiao等,gut,2015,64(3):483-494)以及利用如之前所述的hcve2-特异性ap33抗体(krieger等,hepatology.2010,51(4):1144-1157)通过免疫染色评估hcv感染。
转录分析。将肝细胞在tri试剂(molecularresearchcenter)中裂解，并根据制造商说明书使用direct-zolrnaminiprep(zymoresearch)纯化rna。使用nanodrop(thermoscientific)和bioanalyzer2100(illumina)评估rna的数量和质量。使用250-500ng总rna通过使用ncounter数字分析仪系统(nanostring)进行基因表达谱分析。
磷酸化分析。如制造商之前所描述使用proteomeprolifer人磷酸激酶阵列(r&dsystems)进行磷酸基阵列分析。对于成像，将印迹用ecl(gehealthcare)孵育并暴露于eclhyperfilm(geheathcare)。使用imagej软件(nih)通过整合斑点印迹密度定量磷酸激酶阵列结果。
抗病毒剂和小分子对hcc风险特征的影响。hcvjc1感染七(7)天后，用1nm达卡他韦和1μm索非布韦的组合；10iu/ml干扰素-α2a；1、10或100μg/mlcldn1-特异性mab；或1％dmso存在下0.1mm埃罗替尼的任何一种孵育huh7.5.1dif细胞。用1％dmso孵育细胞用作阴性对照。处理后三(3)天，将细胞裂解，如上所述纯化总rna，并如上所述分析基因表达和胞内病毒载荷。
生物信息和统计分析。如之前所报告，使用genepattern中实施的最接近的模板预测算法基于186-基因签名对临床结果进行预测(king等,gut,2014,20.pii:gutjnl-2014-307862.doi:10.1136/gutjnl-2014-307862；hoshida等,plosone,2010,5(11),e15543)。使用p<0.05和fdr<0.25预测hcc高风险或低风险基因签名。如之前描述，通过genepattern中实施的gsea和单个样品gsea(ssgsea)模量(subramanian等,procnatlacadsciusa,2005,102(43):15545-15550；barbie等,nature,2009,462(7269):108-112)，根据hcvjc1感染和未感染对照，评估各基因集随时间的诱导/抑制。使用如之前所述的toppgenesuite(网页:toppgene.cchmc.org)(chen等,nucleicacidsres.,2009,37(webserverissue):w305-311)进行途径富集分析。ncounter试验基因被认为显著表达，其中t检验fdr＜0.05，倍数变化为±1.8倍。使用差异表达的基因，利用来自ingenuityknowledgebase知识库(ingenuitysystemsinc.)的规范途径进行网络分析。
结果
186-基因hcc风险特征。本研究使用非癌肝组织中的186-基因hcc风险特征，已经表明其与多个独立组的亚洲人、欧洲人和美国人患者(基于高达23年随访，他们患有由多种病因引起的肝硬化和hcc)中患有丙肝病毒(hcv)、乙肝病毒(hbv)和酒精中毒所引起的肝硬化的患者的hcc预测性风险强烈有关(hoshida等,nengljmed.,2008,359(19):1995-2004；hoshida等,gastroenterology.2013,144(5):1024-1030；king等,gut,2014,20.pii:gutjnl-2014-307862.doi:10.1136/gutjnl-2014-307862；king等,plosone,2014,9(12):e114747)。该基因签名包含肝中上调的73个hcc高风险基因和在肝组织中下调的103个hcc低风险基因(hoshida等,gastroenterology.2013,144(5):1024-1030)。
分子途径分析显示，人肝中的慢性hcv感染增强nf-κb、白细胞介素-6以及表皮生长因子(egf)途径的活化并抑制dna修复相关基因(hernandez-gea等,gastroenterology,2013,144(3):512-527)。与在大规模病例对照或队列研究中鉴定的预测dna变体相比(kumar等,natgenet.,2011,43(5):455-458；miki等,natgenet.,2011,43(8):797-800；abudayyeh等,gastroenterology,2011,141(1):141-149)，所述签名证实基本上更好的预测能力(hoshida等,jhepatol.,2014,61(1s):s79-s90)。在肝硬化驱动的hcc的啮齿动物模型中，所述签名在非常早期的肝纤维化诱导，并响应于fda批准的egf途径抑制剂厄洛替尼而逆转，伴随有肝纤维化和hcc结节的减少(fuchs等,hepatology,2014,59(4):1577-1590)。
因此，186-基因hcc风险特征代表监控hcc进展和理解hcc发展中起作用的途径的有价值的工具。利用这一观察结果，本申请人最近开发了一种具有可诱导的186-基因hcc风险特征的简单而强大的基于肝细胞的系统。hcc高风险特征由持续的hbv感染、hcv感染或酒精暴露诱导。利用该模型，他们鉴定了hcc高风险特征的驱动因素，包括egfr信号转导，并表明通过埃罗替尼逆转hcc高风险特征(s.bandiera等,“acell-basedmodelunravelsdriversforhepatocarcinogenesisandtargetsforclinicalchemoprevention”，其于2015年3月提交给naturemedicine发表)。该基于细胞的模型能够阐明患者肝病进展的细胞循环并鉴定用于临床评估的hcc化学保护靶标。
发现cldn1-特异性mab在用于肝病进展和肝癌形成的基于肝细胞的模型中逆转了hcc高风险基因表达签名。为评估抗cldn1mab对于hcc化学保护的作用，申请人使用之前开发的基于增殖差的huh7.5.1细胞(huh7.5.1dif)的模型，其中当暴露于重组hcv时可以容易地诱导hcc相关的186-基因签名(菌株jc1-bauhofer等,gastroenterology,2012,143(2):429-438e8)(参见图1a)。病毒接种7天后，将cldn1-特异性mab添加至huh7.5.1dif细胞，所述7天是通过免疫细胞化学试验评估的大多数细胞持续感染hcv的时间点(参见图1b)。埃罗替尼用作逆转基因签名的阳性对照。然后使用数字转录计数技术(ncounter试验)评估cldn1-特异性mab处理对于hcv诱导的hcc相关的186-基因签名的影响(hoshida等,nengljmed.,2008,359(19):1995-2004；king等,gut,2014,20.pii:gutjnl-2014-307862.doi:10.1136/gutjnl-2014-307862)。基因集富集分析(gsea)表明，在cldn1-特异性mab处理的样品中，hcc高风险基因被有效抑制(nes:-2.29,fdr<0.001)，且hcc低风险基因被显著诱导(nes:1.73,fdr<0.001)。此外，利用计算分析使用应用最接近的模板算法的hcc预测模型(hoshida等,plosone,2010,5(11):e15543)，申请人证实了cldn1-特异性mab处理后，所有持续的hcv感染样品中186-基因签名的统计学上显著的逆转(参见下表1)。
表1.hcc预测模型表明cldn1-特异性mab后hcc高风险基因的逆转。huh7.5.1dif细胞感染hcv。分离总细胞rna并进行nanostring分析。在用10和100μg/ml的cldn1特异性mab处理的hcv感染的huh7.5.1dif细胞中，将基因表达数据进行186-基因-hcc风险特征的最接近的模板预测(ntp)，利用genepattern进行分析。获得热图(数据未显示)。hcv感染的(对照)和处理的(cldn1_10或cldn1_100)细胞预测为hcc高风险和低风险。ntp统计数字显示于下。fdrp-值<0.05被认为是显著的。
发现cldn1-特异性mab逆转细胞中186-基因hcc风险特征比直接作用的抗病毒剂和hcc化学预防候选化合物更有效。值得注意的是，cldn1-特异性mab的效果比诱导hcc高风险基因的部分抑制(nes:-1.28,fdr＝0.08)和诱导hcc低风险基因(nes:1.26,fdr＝0.09)的埃罗替尼的效果更强大(参见图1c)。
为进一步评估cldn1-特异性mab在逆转hcc风险基因签名中的效力，申请人将其效果与直接作用的抗病毒剂(daa)、干扰素α和吡格列酮(本申请人之前利用gsea表明部分抑制hcc高风险基因的化合物)进行比较。之前表明对hcc风险特征没有任何作用的甲福明二甲双胍用作阴性对照。本申请人发现，cldn1-特异性mab逆转hcc高风险基因比其他测试的化合物更有效(参见图2a)。值得注意的是，与daa相反，cldn1-特异性mab诱导的hcc高风险基因的抑制似乎与其对病毒载荷的作用无关，因为不调节huh7.5.1dif细胞中病毒载荷的极低浓度的这种单克隆抗体能有效逆转186-基因签名(参见图2b)。
总之，这些数据表明cldn1-特异性mab有效逆转由hcv诱导的hcc风险特征，与其抗病毒作用无关。
发现cldn1-特异性mab削弱作为肝癌形成的驱动因素的egf-mapk信号转导。申请人之前表明，hcv使用egfr和紧密连接蛋白-1作为宿主依赖性因子以进入细胞培养物和体内的肝细胞(mailly等,clearanceofpersistenthepatitiscvirusinfectionusingaclaudin-1-targetingmonoclonalantibody,natbiotech,2015,33(5):549-554；lupberger等,hepatology,2013,58(4):1225-1235；lupberger等,natmed.,2011,17(5):589-559；zona等,cellhostmicrobe,2013,13(3):302-313)。为评估hcv是否不仅可以利用egfr和cldn1进入，而且引发胞内信号转导级联，本申请人调查了病毒感染的肝细胞中病毒诱导的信号转导。利用研究hcv疾病生物学的新模型系统(参见图1)，他们如之前所述筛选了肝细胞典型的信号转导途径的激活状态(lupberger等,hepatology,2013,58(4):1225-1235；lupberger等,natmed.,2011,17(5):589-59；zona等,cellhostmicrobe,2013,13(3):302-313)。他们观察到，hcv感染引发特异性宿主信号转导网络的活化，包括病毒诱导的egfr磷酸化所示的egfr途径(参见图3a-b)、增强的egf和egfr表达和显著的用实验方法定义的egf靶基因签名的诱导(参见图3c)。有趣的是，也在hbv感染的细胞以及乙醇处理的细胞中观察到egf/egfr途径的诱导，即使处于较低水平(参见图3d-e)。
下游信号转导途径的分析表明胞外信号调节的激酶(erk)的hcv诱导的磷酸化(参见图3f)。由于已经鉴定egfr途径强烈地与患者的肝癌形成有关(hoshida等,nengljmed.,2008,359(19):1995-2004；hoshida等,gastroenterology,2013,144(5):1024-1030；king等,gut,2014,20.pii:gutjnl-2014-307862.doi:10.1136/gutjnl-2014-307862；king等,plosone,2014,9(12):e114747；abudayyeh等,gastroenterology,2011,141(1):141-149)和与动物模型中hcc驱动因素有关(fuchs等,hepatology,2014,59(4):1577-1590；lanaya等,natcellbiol.,2014,16(10):972-981,1-7)，可能病毒诱导的egfr-erk1/2途径的活化促进肝癌形成。重要的是，扰动数据表明抗紧密连接蛋白1mab抑制erk1/2信号转导(参见图3f)。通过分析癌症中的egfr致癌签名，还观察到egfr途径的基因表达的显著抑制(参见图3g)。单个样品gsea(ssgsea)表明，甚至小剂量的cldn1-特异性抗体抑制egfr信号转导和egfr相关基因(数据未显示)。通过显示抑制egfr(参见图4a)和mapk信号转导途径(参见图4b)的差异表达基因的网络分析进一步支持egfr途径的涉及。
发现cldn1-特异性mab削弱与肝病有关的基因以及作为肝癌形成驱动因素的炎性反应基因的表达。此外，如下表2部分a和图5所示，差异表达基因的功能性富集分析表明，包括nf-κb、ebv、mp1、myd88和tlr信号转导的炎性反应基因下调，而涉及代谢途径的基因表达上调(参见下表2部分b)。
表2.cldn1-特异性mab处理抑制炎性相关基因并诱导代谢相关基因。huh7.5.1dif细胞感染hcvjc1。分离总rna后，将其进行nanostring分析。将强度表达值标准化并对数转化。差异表达基因的fdrp值<0.05，倍数变化为±1.9。使用toppgenesuite进行途径分析。a.下调基因属于mapk、nf-κb和toll样受体信号转导，而b.上调基因属于代谢相关途径。
有趣的是，cldn1-特异性mab处理后，之前表明由包括hcv、hbv或乙醇处理的不同的hcc驱动因素诱导(参见bandiera等,“acell-basedmodelunravelsdriversforhepatocarcinogenesisandtargetforclinicalchemoprevention”，其由申请人于2015年3月12日提交给naturemedicine发表)的九(9)个基因中的八(8)个被抑制(参见下表3)。最后，本申请人表明抗紧密连接蛋白-1特异性抗体抑制涉及肝病的基因的表达(参见图6)。
表3.cldn1-特异性mab处理下调通常由包括hcv和hbv感染和乙醇处理的不同hcc驱动因素诱导的基因。统计数字，fdrp-值<0.05被认为是显著的。
总之，这些数据表明cldn1-特异性mab逆转肝癌形成的风险，可能通过削弱egf-mapk信号转导和炎性反应基因的表达。
讨论
在本研究中，申请人已经表明，cldn1(预防和治疗hcv感染的良好表征的hcv进入因子和抗病毒靶标)是用于hcc预防和治疗的之前未被发现的靶标。他们证实了，cldn1-特异性mab在基于肝细胞的模型系统中逆转了hcc高风险基因，在所述模型系统中持续的hcv感染诱导不同病因共有的hcc风险特征。值得注意的是，cldn1-特异性单克隆抗体逆转hcc风险特征比他们测试的任何其他的抗病毒剂(直接作用的抗病毒剂，干扰素α)或可能的hcc化学预防试剂(厄洛替尼，吡格列酮)更有效。有趣的是，发现cldn1-特异性mab能够以对hcv载荷无效的浓度逆转hcc风险特征，表明cldn1-特异性mab可以独立于其作为抗病毒剂的作用预防hcc进展，并因此显示与根本病因无关的广泛的hcc化学保护活性。事实上，本申请人已经表明，除gpx2之外，cldn1-特异性mab逆转通常由不同hcc病因诱导的9个基因中的8个的表达。总之，这些数据强调了cldn1作为用于hcc化学预防的靶标的前途。
cldn1表达在hcc期间，尤其在肝硬化患者中升高(stebbing等,oncogene,2013,32(41):4871-4872)，且已经表明这促进上皮间质转化(emt)，其是肿瘤进展中的早期步骤。潜在的分子机制可能涉及主要经由c-abl-pkc-erk1/2轴活化的cldn1下游的细胞内信号转导级联，所述c-abl-pkc-erk1/2轴通过激活mmp-2促进上皮间质转化(emt)(suh等,oncogene,2013,32(41):4873-4882；yoon等,jbiolchem.,2010,285(1):226-233)。事实上，在本研究中，申请人表明cldn1-特异性mab削弱egfr/mapk信号转导(参见图3f、g)，一种肝癌形成的驱动因素(fuchs等,hepatology,2014,59(4):1577-1590；lanaya等,natcellbiol.,2014,16(10):972-981,1-7)。与这些观察结果互补，功能性富集分析显示cldn1-特异性mab抑制与egf(参见图4a)和mapk信号转导(参见图4b)有关途径的表达。此外，显示nf-kb的炎性途径被抑制(参见图5)。该途径通过促进纤维化肝的炎性反应在恶化肝损伤中起重要作用，并促进在后期进展为hcc和转移(ning等,hepatology,2014,60(5):1607-1619；shen等,hepatology,2014,60(6):2065-2076；song等,hepatology,2014,60(5):1659-1673)。此外，cldn1-特异性mab处理后，属于myd88信号转导的若干途径(toll样受体信号转导的主要参与者)以及tlr7和9途径被下调(参见上表1部分a)。最近，表明这些途径是可能的hcc治疗靶标，因为它们在诱导hcc期间的炎性反应中起作用(leake等,natrevgastroenterolhepatol.,2014,11(9):518；mohamed等,liverint.,2015,64(3):483-494)。
考虑到cldn1-特异性mab逆转信号转导(参见图1-3)和驱动肝癌形成的炎性反应(参见图3到5)(fuchs等,hepatology,2014,59(4):1577-1590；suh等,oncogene,2013,32(41):4873-4882；stebbing等,oncogene,2013；32(41):4871-4872；song等,hepatology,2014,60(5):1659-1673；fortier等,jbiolchem.,2013,288(16):11555-11571)以及抑制良好表征的与肝病进展有关的hcc风险基因签名(参见图2)(hoshida等,nengljmed.,2008,359(19):1995-2004；hoshida等,gastroenterology,2013,144(5):1024-1030；king等,gut,2014,20.pii:gutjnl-2014-307862.doi:10.1136/gutjnl-2014-307862；king等,plosone,2014,9(12):e114747；abudayyeh等,gastroenterology,2011,141(1):141-149；fuchs等,hepatology,2014,59(4):1577-1590)的能力，cldn1-特异性mab适于预防和治疗hcc。鉴于其独立于病因和独立于其抗病毒作用逆转hcc风险基因签名的能力，打开了使用cldn1-特异性mab预防和治疗hcc的前景而与病因学原因无关，包括hcv感染已治愈的患者和由于慢性乙肝病毒感染、酒精、非酒精性脂肪肝病(nafld)或自体免疫性或遗传性肝病而患有hcc的患者。
实施例2
材料和方法
细胞系。将来自huh7.5.1细胞系的细胞(zhong等,procnatlacadsciusa,2005,102(26):9294-9299)在包含1％二甲基亚砜(dmso)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中培养以分化(huh7.5.1dif)。使用嘌呤霉素选择过表达ntcp的hepg2细胞(hepg2-ntcp)并在dmem中培养(ni等,gastroenterology,2014,146:1070-1083；yan等,elife,2012；1:e00049)。
hcv感染和cldn1-特异性mab处理。将huh7.5.1dif细胞铺板于6孔平板并用hcvccjc1(基因型2a/2a)感染(pietschmann等,pnasusa,2006,103:7408-7413；wakita等,naturemedicine.2005,11(7):791-796)。感染后第7天添加cldn1-特异性mab或对照ab(10μg/ml)。如之前所述，在第10天通过胞内rna的qrt-pcr评估hcv感染(xiaa等,plospathogens.2014,10(5):e1004128)。
hbv感染和cldn1-特异性mab处理。将hepg2-ntcp细胞铺板于12孔平板并用重组hbv(菌株ayw,基因型d)(ladner等,antimicrobialagentsandchemotherapy,1997,41(8):1715-20)或血清纯化的hbv(habersetzer等,liverinternational:officialjournaloftheinternationalassociationforthestudyoftheliver,2015,35(1):130-139)感染。添加人cldn1-特异性mab或对照ab(10μg/ml)7天。感染7天后添加大鼠cldn1-特异性mab或对照ab(10μg/ml)3天。如之前所述，在感染后第7天或第10天通过hbv前基因组rna(pgrna)的qrt-pcr定量评估hbv感染(verrier等,hepatology,2016,63(1):35-48)。
乙醇处理。将huh7.5.1dif细胞铺板于6孔平板并暴露于乙醇(40mm)并用cldn1-特异性或对照ab(10μg/ml)处理10天。每天补充包含乙醇和抗体的新鲜培养基(ye等,drugandalcoholdependence,2010,112(1-2):107-116)。
转录分析。详见实施例1。利用biomarkhd的高通量rt-pcr技术(baker等,naturemed.,2012,9(6):541-544)分析hcc风险特征基因表达的表达。emt调节基因的表达通过qrt-pcrtaqman基因表达试验(lifetechnologies,usa)来评估。将表达水平标准化至gapdg。利用δδct方法计算相对表达。
生物信息和统计分析。通过fdr<0.25的gsea或利用用于单个基因的富集得分(es)和用于基因集的标准化富集得分(nes)评估高风险或低风险基因签名对照的诱导/抑制(subramanian等,pnasusa,20005,102(43):15545-15550)。
代谢组学。感染后第7天用cldn1-特异性mab处理hcv感染的huh7.5.1dif细胞。感染后第10天，提取代谢物并通过质谱法分析。用metaboanalyst3.0分析数据(xia等,nucleicacidsresearch,2015,43(w1):w251-w257)。
结果
cldn1-特异性mab在基于hbv感染的肝细胞的模型中逆转了来自患者的panetiology32-基因hcc风险特征。为评估抗cldn1mab预防hcv感染之外的其他病因诱导的hcc的潜力，申请人接着评估其逆转由hbv感染调节的hcc风险基因的能力。最近，已经显示源自之前描述的186-基因hcc风险特征的32-基因签名具有预测所有主要hcc病因(hcv、hbv、酒精和nash)的肝病进展和hcc发展的最高显著性(king等,gut,2014,64(8):1296-1302)。将过表达ntcp(一种hbv的细胞进入因子)的来自hepg2肝的细胞感染hbv并用人cldn1-特异性或对照mab处理7天(图7a)。人cldn1-特异性mab处理导致诱导hcc低风险基因表达和抑制hcc高风险基因(图7c)。这些结果显示，cldn1-特异性mab逆转由hbv感染诱导的hcc风险基因表达，并表明cldn1-特异性mab可以显示出针对hbv诱导的hcc的化学预防活性。
cldn1-特异性mab在基于暴露于酒精的肝细胞的模型中逆转来自患者的panetiology32-基因hcc风险特征。接着，为确定抗cldn1mab预防饮酒诱导的hcc的潜力，申请人评估了抗体逆转由huh7.5.1dif细胞暴露于酒精10天调节的hcc风险基因的能力(图8a)。因此，他们研究了用cldn1-特异性mab处理暴露于酒精的细胞后，huh7.5.1dif细胞中的32-基因hcc风险特征(king等,gut,2014,64(8):1296-1302)是否可以被逆转。人cldn1-特异性mab处理导致在暴露于酒精的细胞中诱导hcc低风险基因表达和抑制hcc高风险基因表达(图8b)。这些结果显示cldn1-特异性mab逆转由暴露于酒精诱导的hcc风险基因表达，并表明cldn1-特异性mab可以显示出针对由饮酒诱导的hcc的化学预防活性。
cldn1-特异性mab在基于肝细胞的模型中逆转与增加的癌症风险和癌症有关的warburg样代谢转变。hcvjc1感染的huh7.5.1dif细胞的基于质谱的代谢组学分析表明肝细胞中稳态代谢物池的改变，包括对乳酸盐的显著影响。此外，代谢标记分析证实流入hcvjc1感染的肝细胞的乳酸盐升高–已知的与恶性转化和癌症有关的warburg样代谢转变(cantor等,cancerdiscovery,2012,2(10):881-898)。为评估cldn1-特异性mab是否能够逆转这种与增加的癌症风险和癌症有关的代谢转变，用hcv慢性感染huh7.5.1dif细胞，然后用人源化cldn1-特异性mab处理，然后通过质谱分析代谢物(图9a)。cldn1-特异性mab处理的具有模拟感染细胞的细胞簇的代谢谱表明人源化cldn1-特异性ab逆转来自肝的细胞中hcv诱导的代谢转变(数据未显示)。代谢标记分析表明，经cldn1-特异性mab处理后，hcv诱导的乳酸盐流入恢复到未感染细胞水平(图9b)。此外，cldn1-特异性mab处理hcv感染细胞后，属于krebs循环的若干代谢物的表达恢复到其在未感染细胞中的表达水平(图9c)。总之，这些数据显示cldn1-特异性mab逆转与恶性转化或癌症相关的代谢转变。这表明cldn1-特异性mab可以预防肝细胞的恶性转化并治疗hcc。
cldn1-特异性mab处理逆转上皮到间质(emt)转化的调节剂。emt是期间癌细胞丧失极性并经历细胞骨架和细胞连接蛋白的重整的转移的早期步骤(lamouille等,naturereviewsmolecularcellbiology,2014,15(3):178-196)。它由与肿瘤侵入有关的转录因子snail、slug和zeb1诱导(nie等,oncogene,2015,doi:10.1038/onc.2015.428)。为进一步研究cldn1-特异性mab预防癌症发展或治疗hcc的潜力，申请人评估了人源化cldn1-特异性mab调节emt所涉及的基因表达的能力。用hcvjc1慢性感染huh7.5.1dif细胞，然后用人源化cldn1-特异性mab处理(图10a)，然后评估emt期间诱导的基因表达。snai1、snai2和zeb1的表达被人源化cldn1-特异性mab下调(图10b)。此外，cldn1-特异性mab处理后，属于hcc186-基因签名且在emt期间失调的基因(anastassiou等,bmccancer.2011；11:529；medici等,molecularbiologyofthecell,2008,19(11):4875-4887)被逆转(图10c)。这些结果显示cldn1-特异性mab逆转emt涉及的基因表达，表明cldn1-特异性mab介导的对emt进展的限制可以有助于预防hcc发展的进展以及治疗确定的hcc。
结论
总之，本文呈现的数据表明，人、大鼠和小鼠cldn1-特异性mab逆转hcc风险特征的基因表达，所述hcc风险特征有力地预测具有不同hcc病因的患者的肝病和hcc的发展。mab预防和治疗肝病进展和hcc发展的功能性影响通过显示以下来证实：mab处理导致emt进展所涉及的基因表达降低以及肝细胞中与恶性转化和癌症相关warburg样代谢转变被逆转。由于cldn1-特异性mab逆转由hcc的主要病因(hcv感染、hbv感染和酒精)诱导的hcc风险基因表达，mab适于预防和/或治疗与其病因包括病毒、代谢和其他病因无关的hcc。
实施例3
材料和方法
5周大c3h/he雄性小鼠(janvierlabs,saintberthevin,france)接受单次腹膜内注射二乙基亚硝胺(den,sigmaaldrich,saint-quentinfallavier,france)，其是一种公认的用于进展性肝病和hcc的动物模型(frey等,carcinogenesis,2000,21:161-166)。注射后第18周，处死两只小鼠以评估肝病的诱导(图11a)。第18周和第23周之间，其余小鼠每周接受腹膜内注射pbs或小鼠抗人cldn1mab(20mg/kg)5周(图11a)。第五次注射抗cldn1mab后一周，即den注射后第23周，处理所有小鼠并收获肝脏，并将一部分固定于福尔马林中用于ffpe组织学分析(苏木精/曙红染色)以及三色染色。
结果
为评估紧密连接蛋白-1特异性mab在体内用于预防和治疗进展性肝病和hcc的作用，申请人使用用于肝病和hcc的二乙基亚硝胺(den)小鼠模型。den是致癌化学品，已经表明其在动物模型中强烈诱导肝脂肪变性、纤维化、肝硬化和hcc。den模型已经成功用于肝病进展和hcc化学预防药物的药物治疗的概念证明研究(fuchs等,hepatology,2014,59:1577-1590；ip等,cancerprev.res.(phila),2013,6:1304-1306；haider等,mol.cancerther.,2013,12(10):1947-1957；park等,j.cellphysiol.,2012,227(3):899-908)。
在c3h/ha小鼠中，单次den施用导致影响约10％肝脏的微血管脂肪变性，如den后第18周进行的组织病理学分析所示(图11b，箭头)。观察到焦点模式的肝脂肪变性，其主要位于门静脉周(图形11b，左图)。此外，den导致肝癌，如den后肝肿瘤的发展所示(图11e)。
动物接受抗体处理五周后，研究cldn1-特异性抗体对肝病和致癌作用的影响。尽管den施用后第23周所有的对照动物继续发展肝脂肪变性，接受cldn1-特异性抗体处理的小鼠中没有观察到脂肪变性(图11c、d)。类似地，尽管在对照小鼠的肝脏表面上观察到肿瘤结节(图11e中的小鼠#8841)，用cldn1-特异性抗体处理的任何小鼠中没有检测到肿瘤(数据未显示)。
总之，这些结果表明，在用于进展性肝病和hcc的现有技术小鼠模型中，抗cldn1mab逆转肝脂肪变性，改进肝病并提供hcc化学预防作用。
其他实施方式
考虑本文公开的本发明的说明或实践，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。意图是说明书和实施例被认为仅是示例性的，其中本发明真正的范围由所附权利要求指出。
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