用于靶向药物递送的自组装分子的制作方法

相关申请

本申请要求2015年3月31日提交的美国临时专利申请序号62/140696的优先权的益处，其内容通过参照结合到本文中。

背景

许多非常有用的化学治疗剂由于其全身毒性失去其作为有效癌症疗法的潜在用途。因此，药物递送系统一直是抗癌领域的一个重要研究热点。例如，生物相容性材料比如脂质体的大颗粒组装体已被用作给予药物和顺磁性造影剂的载体。例如，含有被俘获剂(entrappedagent)比如药物的脂质体组合物为已知的；这些组合物被设计成控制生物分布和再循环半衰期。

为提供治疗作用，必须向靶向部位递送足够浓度的活性剂。因此，需要在体内再循环活性剂。避免被网状内皮(re)系统快速内吞或被肾脏快速过滤的活性剂和递送系统是合乎需要的。对磁共振造影剂的经验提供了关于循环半衰期的有用信息。小分子比如二亚乙基三胺五乙酸钆由于快速的肾排泄而趋于循环时间有限，而大多数直径大于800nm的脂质体被网状内皮系统快速清除。试图解决这些问题涉及使用大分子材料，比如二亚乙基三胺五乙酸钆衍生的多糖、多肽和蛋白。这些试剂还没有实现化学修饰的多功能性以提供长的再循环时间和主动靶向。另外，使用靶向抗体、免疫增强药物、缓释肽或用于靶向药物递送的聚合物导致极端的副作用或递送效率低下(例如递送系统不被细胞内化)。

因此，需要改进的抗癌疗法和递送系统。

概述

在某些实施方案中，本发明涉及包含蛋白、第一有效载荷(payload)和第一靶向剂的第一组合物，其中蛋白呈包含外表面和内腔的三维笼形结构形式；并且第一靶向剂与三维笼形结构的外表面缀合。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一有效载荷为抗癌剂。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一有效载荷为显像剂。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第一组合物中的任一种，其中与健康细胞相比，第一靶向剂选择性靶向癌细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一靶向剂特异性靶向癌细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一靶向剂为抗体。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第一组合物中的任一种，其中蛋白为网格蛋白或网格蛋白衍生物。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一组合物或第二组合物能够在体内转染细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及包含蛋白、第二有效载荷和第二靶向剂的第二组合物，其中蛋白呈包含外表面和内腔的三维笼形结构形式；第二有效载荷为免疫原；和第二靶向剂与三维笼形结构的外表面缀合。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第二组合物中的任一种，其中与健康细胞相比，第二靶向剂不选择性靶向癌细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第二组合物中的任一种，其中第二靶向剂为抗体。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第二组合物中的任一种，其中第二靶向剂为抗pd-1抗体。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第二组合物中的任一种，其中蛋白为网格蛋白或网格蛋白衍生物。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第二组合物中的任一种，其中第二组合物能够在体内转染细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括：

给予受试者治疗有效量的本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一有效载荷为抗癌剂。

在某些实施方案中，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括：

给予受试者治疗有效量的本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一有效载荷为抗癌剂；和

给予受试者治疗有效量的本文描述的第二组合物中的任一种。

在某些实施方案中，本发明涉及一种生成有需要的受试者的图像的方法，所述方法包括：

给予受试者可检测量的本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一有效载荷为显像剂；和

生成图像。

附图简述

图1描绘用于制备本发明的载药载体(drug-loadedvehicle)的示例性过程的示意图。

图2描绘载药载体可被内化的机制示意图。

图3描绘载药载体对癌细胞比正常健康细胞更具选择性的示意图。

图4描绘克隆的网格蛋白重链(m1：sds-page蛋白标志物；泳道1：pe1130119-2蛋白；m2：蛋白印迹蛋白标志物；泳道2：pe1130119-2蛋白(使用抗-6his抗体))的凝胶电泳结果。

图5描绘克隆的网格蛋白轻链(m1：sds-page蛋白标志物；泳道1：pe1130119-2蛋白；m2：蛋白印迹蛋白标志物；泳道2：pe1130119-2蛋白(使用抗-6his抗体))的凝胶电泳结果。

图6描绘蛋白笼形功能化的示意图。蛋白笼形结构具有3个可进行遗传修饰和化学修饰两者的表面(内部、亚基界面和外部)。

图7描绘癌症免疫疗法中涉及的步骤和组分的示意图。

详述

综述

在某些实施方案中，本发明涉及自组装蛋白分子用于递送有效载荷例如毒性抗癌剂、癌症免疫疗法或显像剂至特定组织的用途。在某些实施方案中，蛋白质为网格蛋白或网格蛋白的衍生物。在某些实施方案中，蛋白质为内源性的。在某些实施方案中，蛋白质为非免疫原性的。在某些实施方案中，蛋白质为铁蛋白或铁蛋白的衍生物。

在某些实施方案中，由重链和轻链制备的自组装笼形蛋白或载体掩蔽抗癌剂的毒性，从而导致血清和全身毒性降低。

在某些实施方案中，重链和轻链为融合的(例如蛋白可为融合蛋白)。

在其他的实施方案中，使用抗原生物标志物、抗体或由靶细胞的细胞膜识别的肽，将自组装递送载体用于靶向特定组织，比如癌细胞。在某些实施方案中，一旦递送至靶组织，笼形网格蛋白被细胞内化用于药物的胞内沉积。

在某些实施方案中，有效载荷为抗癌剂，例如化学治疗剂、sirna、mirna、免疫治疗剂或放射治疗剂。在某些实施方案中，有效载荷为显像剂，比如造影剂或荧光团。在某些实施方案中，药物为放射治疗剂，比如放射性核素。

在某些实施方案中，有效载荷缀合于蛋白，例如缀合于轻链。本文使用的“缀合”或“连接”意指离子连接，或者优选地共价连接(例如借助交联剂)。

在某些实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的本文描述的载药载体中的任一种。在某些实施方案中，将载药载体静脉内或腹膜内给予受试者。

与单独使用蛋白、单独使用有效载荷、单独使用靶向剂或这些组分中两种的任何组合相比，预期该技术取得协同结果。优点包括但不限于：1.蛋白在其负载已知或新开发的治疗剂之后自组装。2.蛋白易于被细胞内化。3.组装的载药载体在血清蛋白中稳定，并且经血液和淋巴系统在体内运输时为非毒性的。4.蛋白质和载体被设计成使用特异性抗体或抗体的高亲和力片段特异性靶向病变细胞。在某些实施方案中，抗体被设计为通过发现未被免疫系统识别的癌细胞而增强免疫系统。5.一旦靶向病变细胞，递送载体被内化，并且在该过程中它们解组装并释放其治疗剂，且特异性杀伤病变细胞或使得免疫系统能够对抗它。6.该平台具有提供单、双和多特异性靶向的潜力。7.由于易于内化，如果有效载荷为显像剂或放射治疗剂，则载体可用于肿瘤成像或放射疗法。8.对期望更长半衰期的治疗应用，可通过增加蛋白的分子量或添加聚合延伸来对载体进行改性。9.结合(i)内源性、自组装、细胞内化的蛋白与(ii)自内化抗体和(iii)有效载荷，可改善癌症成像或治疗，同时降低全身毒性。

示例性蛋白质

在某些实施方案中，本发明涉及具有重链的蛋白，其中重链与seqidno:3具有大于85%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中重链与seqidno:3具有大于90%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中重链与seqidno:3具有大于95%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中重链与seqidno:3具有大于98%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中重链与seqidno:3具有大于99%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中重链具有seqidno:3。

在某些实施方案中，本发明涉及具有轻链的蛋白，其中轻链与seqidno:6具有大于85%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中轻链与seqidno:6具有大于90%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中轻链与seqidno:6具有大于95%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中轻链与seqidno:6具有大于98%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中轻链与seqidno:6具有大于99%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中轻链具有seqidno:6。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的蛋白中的任一种，其中蛋白具有重链和轻链。

示例性的组合物

在某些实施方案中，本发明涉及包含蛋白、第一有效载荷和第一靶向剂、基本上由其组成或由其组成的第一组合物，其中蛋白呈包含外表面和内腔的三维笼形结构形式；并且第一靶向剂与三维笼形结构的外表面缀合。在某些实施方案中，与健康细胞相比，第一靶向剂选择性靶向癌细胞。在某些实施方案中，第一靶向剂特异性靶向病变细胞，比如癌细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及包含蛋白、第二有效载荷和第二靶向剂、基本上由其组成或由其组成的第二组合物，其中蛋白呈包含外表面和内腔的三维笼形结构形式；第二有效载荷为免疫原；并且第二靶向剂与三维笼形结构的外表面缀合。在某些实施方案中，与健康细胞相比，第二靶向剂不选择性靶向癌细胞。

在某些实施方案中，组合物(即第一组合物或第二组合物)能够在体内识别或转染细胞。

蛋白

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物(例如第一组合物或第二组合物)中的任一种，其中蛋白能够递送有效载荷进入细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物(例如第一组合物或第二组合物)中的任一种，其中蛋白为网格蛋白或网格蛋白衍生物。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物(例如第一组合物或第二组合物)中的任一种，其中蛋白包含重链或轻链。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中蛋白包含重链和轻链。在某些实施方案中，截短的网格蛋白及这些截短的(tranced)肽的其重复序列的支架用作抗癌内化肽的有效载荷载体。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中重链具有约100kda-约300kda的分子量。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中重链具有约100kda、约110kda、约120kda、约130kda、约140kda、约150kda、约160kda、约170kda、约180kda、约190kda、约200kda、约210kda、约220kda、约230kda、约240kda、约250kda、约260kda、约270kda、约280kda、约290kda或约300kda的分子量。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中重链具有约190kda的分子量。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中重链与seqidno:3具有大于85%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中重链与seqidno:3具有大于90%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中重链与seqidno:3具有大于95%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中重链与seqidno:3具有大于98%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中重链与seqidno:3具有大于99%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中重链具有seqidno:3。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中轻链具有约15kda-约45kda的分子量。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中轻链具有约15kda、约16kda、约17kda、约18kda、约19kda、约20kda、约21kda、约22kda、约23kda、约24kda、约25kda、约26kda、约27kda、约28kda、约29kda、约30kda、约31kda、约32kda、约33kda、约34kda、约35kda、约36kda、约37kda、约38kda、约39kda、约40kda、约41kda、约42kda、约43kda、约44kda、或约45kda的分子量。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中轻链具有约28kda的分子量。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中轻链与seqidno:6具有大于85%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中轻链与seqidno:6具有大于90%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中轻链与seqidno:6具有大于95%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中轻链与seqidno:6具有大于98%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中轻链与seqidno:6具有大于99%序列同源性。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中轻链具有seqidno:6。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构具有约10nm-约100nm的直径。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构具有约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm或约100nm的直径。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构具有约10nm-约100nm的平均直径。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构具有约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、或约100nm的平均直径。在某些实施方案中，三维笼形结构的直径可通过本领域已知的技术比如动态光散射或高分辨nmr光谱估计或测量。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构基本上为球形。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构为非共价组装的，例如自组装的。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构在约37℃下和大约大于或等于7的ph下基本上稳定。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构在约37℃和大约ph7下基本上稳定。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构在约37℃和约ph6.5-约ph8.5下基本上稳定。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构在约37℃和大约小于或等于5.5的ph下基本上不稳定。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中三维笼形结构在约37℃和约ph5.5下基本上不稳定。

笼样蛋白比如网格蛋白、铁蛋白、dna结合蛋白(dps)和热休克蛋白具有3个不同表面(内部、外部和界面)，其可被用于通过设计生成多功能纳米材料。笼形蛋白为生物起源并且每一种笼形物呈现非常均质的大小分布。这种均质性可用来获得模板材料的高度均质性及其相关性质。在大小、功能性及化学和热稳定性方面呈现出多样性的一系列笼形蛋白，可用于在各种条件下的材料合成。由于材料科学的合成方法通常使用苛刻的温度和ph，所以在某些实施方案中，利用来自极端环境比如酸性热温泉的笼形蛋白可为有利的。

蛋白笼形结构(直径10-100nm)为源自病毒和其它生物笼形物(包括热休克蛋白(hsp)、饥饿细胞的dna结合蛋白(dps)和铁蛋白)的自组装空心球。这些结构起着重要的生物学作用。例如，热休克蛋白被认为起防止蛋白质变性的伴侣作用，和已知铁蛋白储存铁(其是必需的而又有毒性)作为氧化铁的纳米粒子。尽管这些结构中的每一种已进化成实施独特的天然功能，但它们相似的是，它们全部本质上为蛋白质容器，具有3个可通过设计赋予功能的不同表面(内部、外部和亚基界面)。蛋白笼形结构已证实在纳米技术中的效用，其应用包括无机纳米粒子合成及靶向治疗剂和成像递送剂的开发。

蛋白笼形结构为天然多样性的，每一种都有可用于特定应用的独特属性(包括大小、结构、溶剂可及性、化学和温度稳定性、结构可塑性、组装和解组装参数以及静电)。重要的是，可利用这些特征或者通过遗传修饰或化学修饰改变它们。原子水平结构信息识别氨基酸在蛋白笼形结构中的精确位置，进而允许合理包含、排除和取代氨基酸(在基因水平上)，导致具有新功能特性的笼形蛋白。

自嗜热环境分离的笼形蛋白作为纳米技术的基础材料是合乎需要的，因为其在包括高温和极端ph的苛刻反应条件下具有潜在的稳定性。有趣的是，最稳定的蛋白笼形结构之一的铁蛋白，通常见于中温生物，包括动物、植物和微生物。例如，马脾铁蛋白呈现广泛的ph(ph2-8)和温度稳定性(<70℃)。铁蛋白参与铁封存(ironsequestration)，这通过使用o2氧化可溶性fe(ii)实现。这种氧化作用导致形成包封在笼形蛋白中的fe2o3纳米粒子(并使得非毒性)。笼形蛋白内表面上的高电荷密度促进该反应，其受到某些铁蛋白亚基的酶(亚铁氧化酶)活性辅助。铁蛋白由24个亚基组成，形成直径12纳米的球状笼形物。铁蛋白家族还包括24个亚基的细菌铁蛋白和自12个单体组装的dps类蛋白。

在美国专利第7393924号(其通过参照结合)中描述了形成空腔的笼形蛋白。笼形蛋白自多个3脚的三脚复合体(triskelion)体外形成，每个三脚复合体具有6个蛋白亚基：3个网格蛋白重链和3个网格蛋白轻链亚基。在某些实施方案中，3脚的三脚复合体为不需要的(参见例如美国专利申请公开号2015/0307570，其通过参照结合)。例如，蛋白可为分离的、合成的或重组的，蛋白整体或部分地包含一种或多种同种型的网格蛋白的一种或多种类型，包括克隆的同种型。

有效载荷

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第一组合物中的任一种，其中有效载荷为任一种治疗剂，但优选地为抗癌剂，比如紫杉醇、吉西他滨或azonafide(例如在美国专利第8008316号中描述的化合物，其通过参照结合)。

本文使用的术语“抗癌剂”和“治疗剂”广泛定义为在目的是抑制癌细胞(包括肿瘤细胞)生长或杀伤细胞的治疗方案中可暴露于这些细胞的任何物质。在一个实施方案中，这样的药剂可按照本文描述的组合物和方法彼此联合(例如ly294002+吉西他滨、泰素+u0126、泰素+吉西他滨等)或以其任何联合使用。这样的药剂包括但不限于：化学治疗剂，比如抗代谢剂例如araac、5-fu和甲氨蝶呤；抗有丝分裂剂，例如泰素、长春碱和长春新碱；烷化剂，例如美法仑、bcnu和氮芥；拓扑异构酶ii抑制剂，例如vw-26、拓扑替康和博来霉素；链断裂剂，例如多柔比星和dhad；交联剂，例如顺铂和cbdca；放射和紫外光。

本文使用的术语“化学治疗剂”意欲包括抑制增殖细胞或组织(其中这样细胞或组织的生长是不合需要的)生长的化学试剂。具体的化学治疗剂包括但不限于：(i)抗代谢物，比如阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟-2’-脱氧尿苷、吉西他滨、羟基脲或甲氨蝶呤；(ii)dna片段化剂，比如博来霉素；(iii)dna交联剂，比如苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺或氮芥；(iv)嵌入剂，比如阿霉素(多柔比星)或米托蒽醌；(v)蛋白质合成抑制剂，比如l-天冬酰胺酶、放线菌酮、嘌呤霉素或白喉毒素；(vi)拓扑异构酶i毒剂，比如喜树碱或拓扑替康；(vii)拓扑异构酶ii毒剂，比如依托泊苷(vp-16)或替尼泊苷；(viii)微管靶向剂，比如秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇、长春碱或长春新碱；(ix)激酶抑制剂，比如夫拉平度(flavopiridol)、星形孢菌素、sti571(cpg57148b)或ucn-01(7-羟基星形孢菌素)；(x)ampk信号转导通路增强剂；(xi)pi3k/akt/mtorc1信号转导通路抑制剂；(xii)mek/erk信号转导通路抑制剂；(xiii)各种各样的试验性药剂，比如硫代铂(thioplatin)、ps-341、丁酸苯酯、et-18-och3或法尼基转移酶抑制剂(l-739749、l-744832)；多酚类，比如槲皮素、白藜芦醇、白皮杉醇、表儿茶素没食子酸酯、茶黄素类、黄烷醇类、原花青素类、桦木酸及其衍生物；(xiv)激素类，比如糖皮质激素类或芬维a胺；和(xv)激素拮抗剂，比如他莫昔芬，非那雄胺或lhrh拮抗剂。在一个实施方案中，化学治疗性化合物为吉西他滨、顺铂、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、紫杉特尔和丝裂霉素c中的一种或多种。在一个具体实施方案中，化学治疗性化合物为吉西他滨、顺铂和紫杉醇中的一种或多种。

化学治疗剂为本领域熟知的(参见例如，gilmana.g.等,治疗剂的药理学基础(thepharmacologicalbasisoftherapeutics),第8版,sec12:1202-1263(1990))，并且代表性地用于治疗肿瘤病。通常用于化疗治疗的化学治疗剂列于以下表1中。

表1

在某些实施方案中，组合物和方法中使用的化学治疗剂可为单一药剂或药剂的组合。优选的组合包括具有不同作用机制的药剂，例如，使用抗有丝分裂剂与烷化剂的组合。

在某些实施方案中，抗癌剂为erk信号转导的抑制剂，比如mek的抑制剂。本文使用的术语“mek的抑制剂”指的是抑制、减小、降低或减少mek活性的化合物或药剂，比如小分子。mek抑制剂的实例包括但不限于azd6244(6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3h-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、司美替尼、结构iv)和u0126(1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双[2-氨基苯基硫代]丁二烯、arry-142886、结构v)。mek抑制剂的另外的非限制性实例包括pd0325901、azd2171、gdc-0973/xl-518、pd98059、pd184352、gsk1120212、rdea436、rdea119/bay869766、as703026、bix02188、bix02189、ci-1040(pd184352)、pd0325901和pd98059。这些和其他的mek抑制剂及其制备方法的非限制性实例描述于美国专利第5525625、6251943、7820664、6809106、7759518、7485643、7576072、7923456、7732616、7271178、7429667、6649640、6495582、7001905号、美国专利公开号us2010/0331334、us2009/0143389、us2008/0280957、us2007/0049591、us2011/0118298、国际专利申请公开号wo98/43960、wo99/01421、wo99/01426、wo00/41505、wo00/42002、wo00/42003、wo00/41994、wo00/42022、wo00/42029、wo00/68201、wo01/68619、wo02/06213和wo03/077914中，其内容通过参照以其全部结合到本文中。

在另一个实施方案中，抗癌剂为表皮生长因子受体(egfr)的抑制剂。egfr为生长因子受体的受体酪氨酸激酶家族的1型亚组成员，其在细胞生长、分化以及存活中起关键性作用。这些受体的激活一般地通过特异性配体结合而发生，这导致受体家族成员之间的异源或同源二聚化，随后酪氨酸激酶结构域进行自体磷酸化。与egfr结合的特异性配体包括表皮生长因子(egf)、转化生长因子α(tgfα)、双调蛋白以及某些病毒生长因子。egfr的激活触发参与细胞增殖(ras/raf/map激酶通路)以及存活(pi3激酶/akt通路)两者的细胞内信号转导通路的级联。该家族的成员(包括egfr以及her2)已直接参与细胞转化。许多人恶性肿瘤与egfr的异常或过度表达和/或其特异性配体的过度表达有关。egfr的异常或过度表达与许多人癌症的预后不良有关，这些癌症包括头颈癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌(例如nsclc、腺癌和鳞状肺癌)、卵巢癌、胃肠癌(胃癌、结肠癌、胰腺癌)、肾细胞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、妇科癌症以及前列腺癌。在某些情况下，肿瘤egfr的过度表达与化学抗性以及预后不良两者相关。egfr的突变也与许多类型的癌症有关。例如，egfr突变在非粘液性bac患者体内非常普遍。finberg,等,j.mol.diagnostics.(2007)9(3):320-26。在一个实施方案中，egfr抑制剂为抗体，比如erbitutux™(西妥昔单抗，imclonesystemsinc.)和abx-egf(帕尼单抗，abgenix,inc.)。在另一个实施方案中，egfr抑制剂为与atp竞争的小分子，比如tarceva^tm(厄洛替尼，osipharmaceuticals)、iressa™(吉非替尼，astra-zeneca)、dvir等(jcellbiol.,113:857-865(1991))描述的酪氨酸磷酸化抑制剂类(tyrphostins)、在美国专利第5679683号中公开的三环嘧啶化合物、在panek等,journalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics283,1433-1444(1997)中公开的化合物6-(2,6-二氯苯基)-2-(4-(2-二乙基氨基乙氧基)苯基氨基)-8-甲基-8h-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-酮(称作pd166285)。

除以上描述的具体药剂以外，进一步考虑适当增强或抑制促存活信号转导通路的靶标的多肽、抗体或其抗原结合片段、毒素、rna干扰分子、sirna分子和shrna分子、反义寡核苷酸、肽、肽模拟物、适体(aptamer)等及其组合，也可用作本发明的治疗剂。具体地讲，本文描述的信号转导通路靶标的核酸序列、氨基酸序列、功能域、结构域、基因座及其他识别信息为本领域熟知的。

在某些实施方案中，有效载荷为包含正义链和反义链的sirna部分，正义链包含3’末端和5’末端；和反义链包含3’末端和5’末端。

“反义”核酸指的是与互补的正义核酸(例如细胞内mrna和/或基因组dna)在细胞内条件下特异性杂交(例如结合)，以抑制表达(例如通过抑制转录和/或翻译)的核酸。结合可通过常规碱基对互补，或者例如在结合于dna双链体的情况下，通过在双螺旋的大沟特异性相互作用。

sirna部分可在5’末端进一步包含鸟苷。

sirna部分的正义和/或反义链的长度可等于或小于30、25、24、23、22、21、20、19、18或17个核苷酸。sirna部分可包含一个或多个悬端(overhang)。例如，sirna部分可包含一个或两个的2-3个核苷酸的3’悬端。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中sirna部分由21-nt正义和21-nt反义链组成，两条链以具有19个核苷酸的双链体区域和在每个3’末端具有2个nt的3’悬端的方式配对。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中2个nt的3’悬端为uu或dtdt。对称的3’-悬端确保序列特异性核酸内切酶复合物(sirnp)由大约等比例的正义和反义靶标rna切割性sirnp形成。正义链的3’-悬端对识别没有贡献，因为据信反义sirna链引导靶标识别。因此，反义序列的uu或dtdt3’-悬端与靶mrna互补，但对称的正义sirna寡核苷酸的uu或dtdt3’-悬端不需对应于mrna。在3’-悬端两者中使用脱氧胸苷可提高核酸酶抗性，但是具有uu或dtdt悬端的sirna双链体同样良好地起作用。3’-悬端的2’-脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但通常合成更便宜。

采用以下准则选择mrna中的靶向区域，并因此选择sirna双链体中的序列。推荐来自cdna序列的开放阅读框(orf)区用于靶向，优选地起始密码子下游的至少50-100个，最优选地至少75-100个核苷酸。5’和3’非翻译区(utr)两者和邻近起始密码子的区域不建议用于靶向，因为这些可能更富含调节蛋白结合位点。utr结合蛋白和/或翻译起始复合物可能会干扰sirnp核酸内切酶复合物的结合。

搜索mrna或cdna的序列以寻找序列aa(n19)tt。具有大约50%g/c-含量(30%-70%)的序列被使用。如果没有发现合适的序列，则搜索延伸至序列aa(n21)。正义sirna的序列分别对应于5’-(n19)dtdt-3’或n21。在后者情况下，正义sirna的3’端转变为dtdt。该序列转换的基本原理为相对于正义和反义序列3’悬端的序列组成生成对称的双链体。据认为，对称的3’悬端有助于确保sirnp由大约等比例的正义和反义靶rna切割性sirnp形成。不期待sirna双链体的正义序列悬端的修饰影响靶向的mrna识别，因为反义sirna链引导靶标识别。

如果靶mrna不含合适的aa(n21)序列，建议搜索na(n21)。正义和反义链的序列仍可被合成为5’(n19)tt，因为反义sirna的最3’核苷酸序列似乎对特异性没有贡献。

进一步建议在合适的数据库中对est文库搜索选择的sirna序列(例如ncbiblast数据库搜索)，以确保仅有一种基因被靶向。

适当设计的sirna可得自商业来源(比如dharmaconresearch,lafayette,colo.;xergon,huntsville,ala.;ambion,austin,tex.)，或按照标准方案使用适当保护的核苷亚磷酰胺和常规的dna/rna合成仪化学合成。依sirna如何得到而定，按照制造商说明书或常规方案，将rna寡核苷酸2’-脱保护、脱盐，并使两链退火。所有操作步骤在严格灭菌、无rna酶条件下进行。

在某些实施方案中，接头(也称为“接头分子”或“交联剂”或“间隔物”)可用于使有效载荷缀合于蛋白。大多数已知的交联剂与胺、羧基和巯基反应。接头分子可造成组合物的性质不同。可根据缀合步骤期间的分子柔性以及缀合的分子对于其靶标的可用性，考虑接头的长度。更长的接头可因此提高本发明组合物的生物活性，以及制备它们的容易程度。接头的几何学可用于定向分子与靶标的最佳反应。具有柔性几何学的接头可允许整个组合物在其结合靶序列时进行构象调整。接头的性质可以改变用于其他各种目的。例如，聚合物接头的疏水性可通过聚合物例如嵌段聚合物(其中疏水性单体嵌段与亲水性单体嵌段交替)上单体单元的顺序控制。

制备和使用广泛的分子接头的化学为本领域熟知的，并且许多预先制备的用于缀合分子的接头可自供应商比如piercechemicalco.、rochemolecularbiochemicals、unitedstatesbiological市售得到。用于本发明组合物的示例性接头分子包括但不限于：氨基己酸(aca)；聚甘氨酸和任何其它氨基酸聚合物；聚合物，比如聚乙二醇(peg)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚丙二醇(ppg)；同型双功能试剂，比如apg、aedp、based、bmb、bmdb、bmh、bmoe、bm[peo]3、bm[peo]4、bs3、bsocoes、dfdnb、dma、dmp、dms、dpdpb、dsg、dsp(lomant’s试剂)、dss、dst、dtbp、dtme、dtssp、egs、hbvs、sulfo-bsocoes、sulfo-dst、sulfo-egs；异型双功能试剂，比如abh、aedp、amas、anb-nos、apdp、asba、bmpa、bmph、bmps、edc、emca、emch、emcs、kmua、kmuh、gmbs、lc-smcc、lc-spdp、mbs、mbus、m2c2h、mpbh、msa、nhs-asa、pdph、pmpi、sadp、saed、sand、sanpah、sasd、satp、sbap、sfad、sia、siab、smcc、smpb、smph、smpt、spdp、sulfo-emcs、sulfo-gmbs、sulfo-hsab、sulfo-kmus、sulfo-lc-spdp、sulfo-mbs、sulfo-nhs-lc-asa、sulfo-sadp、sulfo-sanpah、sulfo-siab、sulfo-smcc、sulfo-smpb、sulfo-lc-smpt、svsb、tfcs；和三功能接头，比如sulfo-sbed。

可制备或使用分支接头，使得每个接头的多个部分能够反应。这种多重反应性接头允许建立多聚体结合位点。

合适的接头可为大分子聚合物。以上提及的聚合物中的任一种可包含大分子聚合物。在某些实施方案中，这样的大分子聚合物可完全由一种类型的聚合物分子组成。在其他实施方案中，大分子聚合物可包含多于一种类型的聚合物分子。大分子聚合物可以许多可能的结构存在，例如线形、梳形支化、高支化、树状聚合物或线形树突结构共聚物。例如，peg和ppg可用于构建各种二价和多价接头。合成、活化和修饰分支peg/ppg聚合物和peg/ppg嵌段共聚物的方法在本领域中为熟知的。peg为亲水性的，而ppg为疏水性的。例如，接头可用ppg核和peg分支合成。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第一组合物中的任一种，其中有效载荷为显像剂或诊断剂。例如，显像剂可为荧光显像剂，比如荧光团或钆螯合剂，或者为磁显像剂，比如磁铁矿矿物、顺磁性金属离子或金属螯合肽。显像剂可结合于内源性位点(例如顺磁性金属离子)、结合于化学修饰位点(例如化学修饰以共价结合荧光团或钆螯合剂)或者被遗传学掺入(例如金属螯合肽)。

显像剂或诊断剂的实例包括荧光团(例如dy547)、发色团、化学发光剂、用于正电子发射断层扫描(pet)和单光子发射断层扫描(spect)的放射性核素(例如in-111、tc-99m、i-123、i-125f-18、ga-67、ga-68)、用于磁共振成像(mri)的未配对自旋原子和自由基(例如fe、镧系元素和gd)和造影剂(例如螯合(dtpa)锰)。

另外的实例包括放射性核素(例如f-18、i-124、i-123、i-125、i-131、re-186、re-188、y-90、bi-212、at-211、sr-89、ho-166、sm-153、cu-67、cu-64、in-111、tc-99m、ga-67和ga-68)。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第二组合物中的任一种，其中有效载荷为免疫原，例如免疫原性抗原。免疫原为抗原或可被免疫系统的组分(例如抗体、淋巴细胞)特异性结合的任何物质。免疫原能够诱导体液或细胞介导的免疫反应，而不诱导免疫耐受。例如，免疫原可选自钥孔䗩血蓝蛋白(klh)、似鲍罗螺(concholepasconcholepas)血蓝蛋白(cch)、牛血清白蛋白(bsa)和卵清蛋白(ova)。进一步的信息可见于chends等(immunity.2013;39:1-10)和chends等(clincancerres.2012;18:6580-6587)(两者通过参照结合)。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第二组合物中的任一种，其中有效载荷为佐剂。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的第二组合物中的任一种，其中有效载荷为免疫原和佐剂，所述佐剂：将专职性抗原提呈细胞(apc)募集至抗原暴露部位；通过延迟/缓慢释放(储库生成)来增加抗原的递送；通过细胞因子产生进行免疫调节(选择th1或th2应答)；诱导t细胞应答(延长肽-mhc复合物[信号1]的暴露和刺激t细胞激活共刺激剂[信号2]在apc表面的表达)；和靶向(例如靶向apc上的凝集素受体的碳水化合物佐剂)。佐剂的实例包括但不限于弗氏完全佐剂、脂多糖类、来自tb的胞壁酰二肽、合成的多核苷酸、氢氧化铝、磷酸铝、细胞因子和角鲨烯。

靶向剂

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中组合物为细胞特异性治疗剂和显像剂递送系统。靶向治疗剂递送系统可增强在部位比如肿瘤的有效剂量，同时减少对药物的一般暴露及其相关副作用。

蛋白笼形结构具有3个可进行遗传修饰和化学修饰的表面(内部、亚基界面和外部)。每个表面可在开发新的靶向治疗剂和显像剂递送系统中发挥不同作用。参见图6。笼形内部可容纳治疗剂，亚基界面掺入钆(mri造影剂)和外部存在细胞特异性靶向配体(比如肽和抗体)。

笼形蛋白有许多有益的属性，有助于其作为靶向治疗剂和显像剂递送系统的开发。其大小下降到纳米范围内，由于提高的渗透性和滞留效果而显示位于肿瘤内。其多价性使在单一笼形蛋白上掺入多功能性(包括靶向肽和显像剂)。它们可进行化学和遗传操作两者，并可在异源表达系统(包括细菌、酵母和杆状病毒系统)中生产。另外，详细的原子分辨结构信息使得能够合理设计具有特定功能(包括细胞特异性靶向)的遗传突变体。

用于开发作为显像剂和治疗剂的蛋白笼形结构的另一种关键组分是细胞特异性靶向。噬菌体展示文库技术的体内应用使得能够识别与特定器官以及肿瘤的脉管系统特异性结合的肽。这些靶向肽中最为表征的一种是rgd-4c(cdcrgdcfc)，其结合在肿瘤脉管系统内更普遍表达的αvβ3和αvβ5整联蛋白。例如，rgd-4c和其它靶向肽可掺入于蛋白的外部。细胞特异性靶向笼形物的荧光素标记使其通过落射荧光显微镜而可视化。除遗传掺入以外，细胞特异性靶向配体(包括抗体和肽)也被化学偶联到笼形蛋白平台。例如，缀合至蛋白的抗cd4单克隆抗体可实现靶向脾细胞群内的cd4⁺淋巴细胞。蛋白笼形结构的多价性质导致在其表面存在多个靶向配体，并可潜在地有助于这些笼形蛋白与许多表面(包括多种细胞类型上的受体)的相互作用。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的组合物中的任一种，其中靶向剂为抗pd-1抗体。

靶向剂或亲和试剂为结合于抗原或受体或其它分子的分子。在某些实施方案中，靶向剂为特异性结合于抗原或受体或其它分子的分子。在某些实施方案中，靶向剂中的某些或全部由氨基酸(包括天然的、非天然的和修饰的氨基酸)、核酸或糖组成。在某些实施方案中，靶向剂为小分子。

靶向剂在本发明的某些实施方案中特异性结合于分子或靶标，比如细胞表面抗原、细胞表面受体或其它细胞表面分子。

在某些实施方案中，靶向剂为蛋白性的，并可以单一肽链或多肽链存在。在某些实施方案中，多肽链为双特异性抗体。

双特异性抗体作为本领域标准技术已被确立，以构建结合于两个不同决定簇的单个多肽。双特异性抗体可以许多不同的形式制备，包括但不限于四体杂交瘤(quadroma)、f(ab’)2、四价、异源二聚体scfv、双特异性scfv、串联scfv、双价抗体(diabody)和微抗体(minibody)形式、或者附加或重组融合于整个抗体的scfv。

用于本发明的抗体可通过任何常规方法产生，比如通过向小鼠注射免疫原，并随后融合淋巴细胞以建立杂交瘤。然后这样的杂交瘤可被用于：(a)直接产生抗体，抗体被纯化并用于化学缀合以创建双特异性抗体；或者(b)克隆编码抗体片段的cdna用于后续的遗传操作。为了说明采用后者策略的一种方法，自杂交瘤细胞分离出mrna，用反义寡dt或免疫球蛋白基因特异性引物反转录到cdna中，并克隆到质粒载体中。对克隆进行测序并表征。然后它们可按照标准方案设计，以将被短肽接头分离的每个抗体的重链和轻链混合到先前描述的细菌或哺乳动物表达载体中，从而产生重组双特异性抗体，然后按照确立的方案在细菌或哺乳动物细胞中表达和纯化。抗体或其他蛋白性亲和分子或靶向剂(比如肽)也可通过展示技术创建，该技术允许通过筛选例如噬菌体表达的免疫球蛋白结构域或肽的非常大的文库来选择相互作用的亲和试剂。抗体也可通过人免疫球蛋白结构域的接枝而人源化，或者可由具有人免疫球蛋白基因/cdna的转基因小鼠或细菌噬菌体文库制备。

在某些实施方案中，靶向剂可包含能够特异性结合蛋白靶标的非抗体的蛋白性结构，包括但不限于avimer、锚蛋白重复序列和adnectin以及其他这种具有可进化产生抗原特异性亲和力的结构域的蛋白，统称为“抗体样分子”。通过在合成期间掺入非天然氨基酸来修饰蛋白性亲和试剂，可用于改善其性质。这样的修饰可具有若干益处，包括加入促进后续缀合反应的化学基团。

在某些实施方案中，靶向剂可以为肽。在某些实施方案中，肽链为双特异性肽。肽可易于制备和筛选以构建识别并结合大分子比如蛋白的亲和试剂。

双特异性亲和试剂可通过分别合成和表达第一和第二亲和试剂来构建。多肽双特异性试剂可表示为两个在产生期间在同一宿主细胞内分开编码的经二硫键连接的链，比如双特异性scfv或双价抗体。类似地，标准的和广泛使用的固相肽合成技术可用于合成肽，并且嵌合双特异性肽为本领域熟知的。双特异性肽策略可用于在单肽链中组合第一和第二亲和试剂。或者，多肽链或肽链可被分别表达/合成、纯化，并然后化学缀合以产生在本文描述的组合物和方法中有用的双特异性亲和试剂。可使用许多不同形式的抗体。全抗体、f(ab’)2、f(ab’)、scfv以及较小的fab和单域抗体片段均可用于构建第一和第二亲和试剂。在其表达和纯化之后，靶向剂可与蛋白载体化学缀合。许多缀合化学可用于实现该缀合，包括得到酯、酰胺、硫醚、碳-碳或二硫键的同型功能接头或异型功能接头。

在某些实施方案中，靶向剂为肽适体。肽适体为特异性结合靶蛋白，并干扰所述靶蛋白的功能性能力的肽分子。肽适体由连接在蛋白支架两个末端的可变肽环组成。这样的肽适体可通常具有与抗体可比的亲和力(纳摩尔范围)。由于肽适体的高选择性，它们不仅可用于靶向特异性蛋白，而且可用于靶向给定蛋白的特定功能(例如信号转导功能)。

通常通过针对其与来自随机池(pool)或肽文库的特异性靶标的亲和力选择适体来制备肽适体。肽适体可通过酵母双杂交筛选而分离自随机肽文库。它们也可分离自噬菌体文库或化学生成的肽/文库。

在某些实施方案中，靶向剂为核酸适体。核酸适体为特异性结合其他大分子的核酸寡聚物，这样的特异性结合其他大分子的适体可通过技术比如selex而易于自这种寡聚物的文库分离。

在某些实施方案中，靶向剂为寡糖。某些寡糖为某些细胞外或细胞表面受体的已知配体。

靶向剂识别靶细胞上的细胞表面抗原。靶向剂可为：抗体、抗体样分子或肽，比如整联蛋白结合rgd肽；或小分子，比如维生素，例如叶酸，糖类，比如乳糖和半乳糖，或其它小分子。细胞表面抗原可为经历内化的任何细胞表面分子，比如蛋白、糖、脂质头基或细胞表面的其它抗原。在本发明的情况下有用的细胞表面抗原的实例包括但不限于1型和2型转铁蛋白受体、egf受体、her2/neu、vegf受体、整联蛋白、cd33、cd19、cd20、cd22和无唾液酸糖蛋白受体。

在其表达/合成和纯化之后，通过重组融合或者化学缀合或缔合，使靶向剂与蛋白(例如网格蛋白重链或轻链)通过共价偶联而缔合。

在某些实施方案中，靶向剂为her-2靶向抗体，例如曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。

在某些实施方案中，靶向剂为egfr靶向抗体，比如imc-225。

在某些实施方案中，靶向剂为vegfr-2靶向抗体。

在某些实施方案中，靶向剂为cd-20靶向抗体。

在某些实施方案中，靶向剂为cd-22靶向抗体。

在某些实施方案中，靶向剂为cd-4靶向抗体。

疗法或诊断成像的示例性方法

本发明的一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括：

给予受试者治疗有效量的本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一有效载荷为抗癌剂。

本发明的一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括：

给予受试者治疗有效量的本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一有效载荷为抗癌剂；和

给予受试者治疗有效量的本文描述的第二组合物中的任一种。

语言靶向治疗剂的“有效量”指的是消除、减少或维持(例如预防扩散)肿瘤或其他靶标所必要或足够的量。有效量可视治疗的疾病或病症、被给予的具体靶向构建体、受试者的大小或者疾病或病症的严重程度等这样的因素而变化。本领域的普通技术人员无需过度实验即可根据经验确定具体组合物的有效量。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的方法中的任一种，其中癌症为肺癌。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的方法中的任一种，其中癌症为非小细胞肺癌(nsclc)。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的方法中的任一种，其中癌症为胰腺癌。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的方法中的任一种，其中第一组合物和第二组合物被共同给予，即其中第一组合物和第二组合物依序、同时或分开给予。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的方法中的任一种，其中第一组合物和第二组合物同时给予，例如在一个药用制剂中。

本发明的另一方面涉及生成有需要的受试者的图像的方法，所述方法包括：

给予受试者可检测量的本文描述的第一组合物中的任一种，其中第一有效载荷为显像剂或诊断剂；和

生成图像。

语言靶向显像剂的“有效量”指的是使肿瘤或其它靶标可视化所必要或足够的量。有效量可视例如被成像的细胞或组织、被给予的具体靶向构建体、受试者的大小或者疾病或病症的严重程度等这样的因素而变化。本领域的普通技术人员无需过度实验即可根据经验确定具体组合物的有效量。

在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的方法中的任一种，其中受试者为哺乳动物，优选地受试者为人。

示例性的药用组合物

在另一方面，本发明提供药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量的一种或多种以上描述的组合物，其与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。如以下详细描述的那样，本发明的药用组合物可具体配制用于以固体或液体形式给予，包括适合于以下的那些药用组合物：(1)口服给予，例如灌服剂(drench)(水或非水溶液剂或混悬剂)、片剂(例如靶向颊、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂(应用于舌)；(2)肠胃外给予，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，例如作为无菌溶液剂或混悬剂，或者缓释制剂；(3)局部应用，例如作为应用于皮肤的霜剂、软膏剂或者控释贴片或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、霜剂或泡沫剂；(5)舌下；(6)经眼；(7)透皮；或(8)经鼻。

如以上所示，某些实施方案的组合物可含有碱性官能团，比如氨基或烷基氨基，并因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”在这方面指的是本发明组合物中组分的相对非毒性的无机和有机酸加成盐。这些盐可在给药载体或剂型制备过程中原位制备，或者通过分别使以其游离碱形式存在的纯化的化合物与合适的有机或无机酸进行反应，并在随后的纯化期间分离因此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐，月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、对甲苯磺酸盐、枸橼酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等(参见例如，berge等(1977)“药用盐(pharmaceuticalsalts)”,j.pharm.sci.66:1-19)。

主题组分的药学上可接受的盐包括化合物的常规非毒性盐或季铵盐，例如来自非毒性有机或无机酸的盐。例如，这样的常规非毒性盐包括衍生自无机酸比如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些盐；和自以下有机酸制备的盐，比如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸等。

在其他情况下，本发明组合物的组分可含有一种或多种酸性官能团，因而能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”指的是本发明组合物中组分的相对非毒性的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可在给药载体或剂型制备过程中原位制备，或者通过分别使以其游离酸形式存在的纯化的组分与合适的碱比如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐、与氨、或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺反应制备。代表性的碱金属或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。用于形成碱加成盐的代表性的有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。

润湿剂、乳化剂和润滑剂(比如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，比如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，比如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；和(3)金属螯合剂，比如枸橼酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的制剂包括适合于口服、鼻、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外给予的那些制剂。制剂可便利地以单位剂型存在，并可通过药学领域中熟知的任何方法制备。可与载体材料混合产生单一剂型的活性成分的量将视受治疗的宿主、特定的给予方式而变化。可与载体材料混合产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的组合物的量。通常，在100%以外，这个量为大约0.1%-约99%范围内的活性成分，优选地为约5%-约70%，最优选地为约10%-约30%。

在某些实施方案中，本发明的制剂包含选自以下的赋形剂和本发明的化合物：环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂例如胆汁酸、和聚合物载体例如聚酯和聚酸酐。在某些实施方案中，以上提及的制剂使得本发明的组合物为口服可生物利用的。

制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明的组合物与载体和任选的一种或多种辅助成分相结合的步骤。通常，通过使本发明的组合物与液体载体或细分的固体载体或两者均匀和紧密地结合，并然后视需要使该产物成形来制备制剂。

适合于口服给予的本发明制剂可呈以下形式：胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、糖锭剂(lozenge)(使用矫味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂、或作为在水或非水液体中的溶液剂或混悬剂、或作为水包油或油包水液体乳剂、或作为酏剂或糖浆剂、或作为锭剂(pastille)(使用惰性基质，比如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口水等，各自含有预定量的本发明组合物作为活性成分。本发明的组合物也可作为大丸剂、药糖剂或糊剂给予。

在用于口服给予的本发明固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂、含片等)中，组合物与一种或多种药学上可接受的载体(比如枸橼酸钠或磷酸二钙)和/或以下组分中的任一种混合：(1)填充剂或膨胀剂，比如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，比如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，比如甘油；(4)崩解剂，比如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，比如石蜡；(6)吸收促进剂，比如季铵化合物和表面活性剂，比如泊洛沙姆和十二烷基硫酸钠；(7)润湿剂，比如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子型表面活性剂；(8)吸收剂，比如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，比如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；和(11)控释剂，比如交联聚维酮或乙基纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药用制剂也可包含缓冲剂。相似类型的固体制剂也可用作在使用乳糖或牛奶糖以及高分子量聚乙二醇等这样的赋形剂的软和硬壳明胶胶囊中的填充剂。

片剂可通过压制或模制制备，任选地使用一种或多种辅助成分。压制片剂可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备。模制片剂可通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状组合物的混合物来制备。

本发明药用制剂中的片剂和其他固体剂型(比如糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂)可任选地被刻痕，或者用包衣和药壳比如肠溶衣和药物配制领域熟知的其它包衣制备。它们也可使用例如羟丙基甲基纤维素(以不同比例存在以提供期望的释放曲线)、其它聚合物基质、脂质体和/或微球被配制，以便提供其中的组合物或有效载荷的缓慢或控制释放。它们可被配制用于快速释放，例如冻干。它们可通过例如经细菌截留滤器过滤灭菌，或者通过以无菌固体组合物形式掺入灭菌剂制备，这些组合物可在使用前立即溶解于无菌水或一些其他无菌注射用介质中。这些制剂还可任选地含有遮光剂，并可经配制，使得仅在或者优先在胃肠道的特定部分任选地以延迟的方式释放活性成分。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性成分也可以微囊化形式存在，视需要使用一种或多种上述赋形剂。

用于口服给予本发明组合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂，混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分以外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，比如水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂，比如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。

除惰性稀释剂以外，口服制剂也可包含佐剂比如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除组合物以外，混悬剂还可含有助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶及其混合物。

用于局部或透皮给予本发明组合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。组合物可在无菌条件下与药学上可接受的载体混合，以及与任何可能需要的防腐剂、缓冲剂或喷射剂混合。

适合于肠胃外给予的本发明药用制剂包含与以下联合的一种或多种本发明组合物：一种或多种药学上可接受的无菌等渗水或非水溶液剂、分散体、混悬剂或乳剂、或其可在临用前重构成为无菌注射用溶液剂或分散剂的无菌粉末，其可含有糖类、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与打算的接受者的血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。

可用于本发明药用制剂的合适的水和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物；植物油类，比如橄榄油；和注射用有机酯类，比如油酸乙酯。例如通过使用包衣材料比如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持需要的粒度和通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。

这些制剂也可含有佐剂比如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可确保防止微生物对主题化合物的作用。在组合物中包含等渗剂比如糖类、氯化钠等也可为合乎需要的。另外，通过包含延迟吸收的物质比如单硬脂酸铝和明胶，可导致注射药用剂型的延长吸收。

当本发明的组合物作为药剂给予人和动物时，其可本身或作为例如与药学上可接受的载体相结合含有0.1-99%(更优选地10-30%)组合物的药用制剂给予。

本发明的制剂可口服、肠胃外、局部或直肠给予。当然，它们以适合于每种给予途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊形式，通过注射、吸入、洗眼剂、软膏剂、栓剂等给予；通过注射、输注或吸入给予；通过洗剂或软膏剂局部给予；和通过栓剂直肠给予。

这些制剂可通过任何合适的给予途径给予人和其他动物用于治疗，给予途径包括口服、鼻(例如通过喷雾)、直肠、阴道内、肠胃外、脑池内和局部，例如通过粉剂、软膏剂或滴剂，包括颊和舌下。

与选择的给予途径无关，本发明的组合物(其可以适当的水化形式使用)和/或本发明的药用制剂可通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。

本发明药用制剂中活性成分的实际剂量水平可以改变，以便得到对具体的患者、组合物和给予方式实现期望的治疗应答有效，而对患者没有毒性的有效载荷的量。

选定的剂量水平取决于多种因素，包括所使用的本发明具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性；给予途径、给予时间，所使用的具体组合物的排泄或代谢速率、吸收的速率和程度、治疗持续时间；与所使用的具体组合物联合使用的其它药物、组合物和/或材料；待治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以往病史，以及医学领域熟知的类似因素。

具有本领域普通技术的医生或兽医可容易地确定和规定所需药物制剂的有效量。例如，医生或兽医可在低于达到期望的治疗效果所需的水平开始药用制剂中所用的本发明组合物的剂量，并逐渐增加剂量，直至达到期望的效果。

通常，本发明组合物的合适日剂量为有效产生治疗效果的最低剂量的组合物量。这种有效剂量通常取决于以上描述的因素。

如果需要，组合物的有效日剂量可作为在一天中以合适的间隔分别给予的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量，任选地以单位剂型给予。优选的给药为每天给予一次。

尽管可单独给予本发明的组合物，但优选的是作为药物制剂给予组合物。

本发明的组合物可根据其它药剂类推配制为以对于人或兽医使用便利的任何方式给予。

在另一方面，本发明提供药学上可接受的制剂，其包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的一种或多种以上描述的主题组合物。如以下详细描述地，本发明的药用制剂可具体配制为用于以固体或液体形式给予，包括适合于以下的那些制剂：(1)口服给予，例如灌服剂(drench)(水或非水溶液剂或混悬剂)、片剂、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂(应用于舌部)；(2)肠胃外给予，例如通过皮下、肌内或静脉内注射，例如无菌溶液剂或混悬剂；(3)局部应用，例如作为应用于皮肤、肺或粘膜的霜剂、软膏剂或喷雾剂；或(4)阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、霜剂或泡沫剂；(5)舌下或颊；(6)经眼；(7)经皮；或(8)鼻。

接受该治疗的患者为有需要的任何动物，包括灵长类动物，特别是人，和其他哺乳动物比如马、牛、猪、绵羊；并且一般地为家禽和宠物。

结合或联合的治疗因此包括以使第一次给予的组合物治疗效果在给予随后的组合物时不完全消失的方式依序、同时和分开给予各组合物。

示例性试剂盒

在某些实施方案中，本发明涉及一种用于癌症治疗或成像的试剂盒。例如，试剂盒可包含一种或多种以上描述的组合物和任选地其用途的说明书；优选地试剂盒包含第一组合物和第二组合物。在仍然其它的实施方案中，本发明提供包含一种或多种药用或诊断制剂和/或一种或多种实现给予的装置的试剂盒。例如，主题试剂盒可包含药用或诊断制剂和直接注射用导管。

实施例

现一般性描述本发明，其通过参照以下实施例更易于理解，这些实施例仅为了说明本发明的某些方面和实施方案的目的而包括，并不打算限制本发明。

实施例1-网格蛋白重链的表达

针对大肠杆菌表达系统如下优化网格蛋白人同种型2重链：

(seqidno:1)：

(seqidno:2)

制备得到具有以下特征的蛋白：

(seqidno:3)：

实施例2-网格蛋白轻链的表达

网格蛋白轻链(以下)在大肠杆菌中表达：

(seqidno:4)：

(seqidno:5)：

制备得到具有以下特征的蛋白：

蛋白质描述：

12.96mg，>85%，来自大肠杆菌，具有6his标签的可溶性蛋白；

蛋白质浓度：

0.60mg/ml，如通过bradford蛋白测定所确定的那样，bsa作为标准品。

最后的制备：

1.8ml/管，12管

纯度：

>85%，如通过考马斯蓝染色的sds-page凝胶估计的那样。

储备缓冲液：

50mmtris，150mmnacl，10%甘油，ph8.0

储存：

接收时立即存储在-20℃下

在首次使用时，等分和储存在-20℃下以避免多重冻融。

预期用途：

该产物仅供研究使用。其不用于任何人或动物的诊断和治疗用途。

蛋白质序列(seqidno:6)：

蛋白长度

256

mw

28136.9

预测的pi

4.37

质量保证(参见图5)：

m1：sds-page蛋白标志物

泳道1：pe1130119-2蛋白

m2：蛋白印迹蛋白标志物

泳道2：pe1130119-2蛋白(使用抗-6his抗体)

实施例3-自组装蛋白的负载

把自组装蛋白与荧光化合物一起负载，以评价其在负载后自组装的能力。

重组网格蛋白重链(hc)和轻链(lc)分别用10mmtris-hcl(ph7.9)以300μg/ml和800μl/ml稀释。荧光素化的受试化合物(ftc)用相同的缓冲液以500μl/ml稀释。通过加入4μl的1m2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液(ph6.5)，启动100μl在96-孔试验板中的组装，缓冲液补充有10mm乙二醇四乙酸(egta)和75mmcacl2。对照用ph7mes缓冲液。od320nm读数采用spectramaxm3(分子器件)测量，并且结果用设备提供的软件描绘。

实施例4-自组装蛋白的负载(预示的(prophetic))

测试各种比率的hc、lc和ftc以及低ph，以研究组装效率。

其他研究药物负载的实验正在测试。

1.把药物负载或附着于轻链组装笼形物中，并然后在自组装条件下把负载的轻链负载到重链上(间接负载到主笼形物)。轻链可增加主重链笼形物的稳定性。

2.采用直接混合药物与笼形物，以改变在不同的开放和自组装条件下的载药量。

3.采用不同大小的药物，比如紫杉醇或吉西他滨。

实施例5-动物研究(预示的)

在动物模型中比较负载的载体效率与单独药物的效率。

在两种动物种类中用先导药物实施急性和慢性毒性研究。

实施例6-共同给予第一组合物和第二组合物以增强免疫原性反应(预示的)

共同给予第一组合物(包含第一自组装网格蛋白载体、抗癌剂和靶向剂)与第二组合物(包含第二自组装网格蛋白载体和抗pd-1抗体)，预计与单独的第一组合物、单独的第二组合物以及第一组合物和第二组合物的相加效应相比，提供增强的治疗效果。第二组合物可进一步包含免疫原有效载荷。

参考文献

本文提及的所有出版物和专利，包括以下列出的那些条目，通过参照以其全部结合到本文中，就好像每个个体出版物或专利具体和单独表明通过参照结合那样。

等价物

尽管已讨论了本发明的具体实施方案，但以上说明书为说明性的而不是限制性的。在审查该说明书时，本发明的许多变化对本领域技术人员变得显而易见。