用于治疗脑损伤的组合物的制作方法
本发明涉及药物组合物用于其作为用于预防和/或治疗由脑血管缺血所引起的中枢神经系统的组织病变的药剂的应用。
本发明还涉及用于预防和/或治疗由脑血管缺血引起的中枢神经系统的组织病变的药物试剂盒。
本发明可以具体地用于人和兽医药物领域。
在以下描述中，括号内的参考文献是指在本文结尾处所提供的参考文献列表。
背景技术：
在工业化国家的人类中，中风(cva)仍是首要的发病原因并且是第三致死原因。这种病理状况仍造成重大损失：65岁后的全部死亡中的10％至12％，并且在超过半数患者中造的身体、认知或心理学后遗症。根据who，每年全世界有1500万人罹患中风。他们当中，500万人死亡，并且另有500万人终身残疾。在欧洲，估计每年由中风所引起的死亡数目为约650000。因此，中风的社会经济学影响是非常重大的(2007年法国为53亿欧元(chevreuletal.,2013)。
中风定义为脑的特定区域中血液供给的减少。存在两种中风类型：出血事件，其对应于血液由于血管破裂从血管腔渗漏至细胞区室，和缺血性类型，其中80％患有的中风患者由该类型造成。后者是由于血流减少造成，该血流减少由对应于认为从体表分离并输送到脑动脉的凝块的栓塞，或者由最终完全闭塞血管腔体的动脉粥样硬化斑块引起的。最经常涉及这种闭塞的动脉为赛尔维氏动脉(sylvianartery)或大脑中动脉(mca)。其是为大脑半球的主要部分供血的动脉并且其闭塞导致明显的感觉运动或认知障碍(半身不遂、轻偏瘫、认识不能、记忆缺失等)(cramer,2008；jaillardetal.,2009)。
缺血性中风的治疗
大脑缺血可以定义为相对于代谢需要的供血不足。这是由可能是暂时或持久的脑血流量减少所造成的。伴有局部缺血的脑损伤通常由严重受损的中心和活力不稳定的周边组成；该区域称为半影区(penumbra)，除非及时进行治疗性干预，否则可以通过坏死过程增加(touzanietal.,2001)。因此，缺血性半影区代表脑缺血急性期期间任何治疗性干预的目标。
尽管缺血性中风代表了重要的公共卫生问题，但是用于对抗后者的治疗性措施较少。目前，卫生部门仅批准了使用t-pa(组织纤维蛋白溶酶原活化因子)的血栓溶解。然而，t-pa的使用受其较小的治疗窗口，即中风发生后的3至4.5h，以及与之相关的与脑溢血风险有关的多种禁忌征(无血液稀释治疗，在之前3个月无(大脑或心脏)缺血性事件，在最近21天无胃肠或尿液出血、无流血、动脉血压<185/110mmhg收缩压/舒张压等)的限制。根据lees及其合作者(2010)，在超过4小时30分的期间后给予rt-pa导致了显著高于未治疗患者的脑溢血风险，并且与不利的利益-风险平衡相关(leesetal.,2010)。因此，据估计仅有3％至5％的患者可以求助于这种治疗(adeoyeetal.,2011)并且即使严格选择患者，据评估在给予rt-pa后，他们中有13％将发展为脑溢血。
因此，存在找到克服这些缺陷、缺点和障碍的新型组合物/药物，具体地，使得可以具体地治疗/终止中风的具有特别宽的治疗窗口和/或减少/消除由于治疗所造成的副作用的组合物的确实需要。
除了使用t-pa的血栓溶解外，动物中的多项研究显示了针对保护神经元抵抗缺血的几种治疗策略的可能效力(kauretal.,2013)。在这些策略中，可以提到钙离子通道阻塞、氧化应激的抑制、gabaa受体刺激、nmda和ampa受体的抑制。然而，在人的临床实践中，未发现这些治疗性干预的成功(kauretal.,2013)。
因此，存在寻找使得可以治疗中风及其组织后果的新型组合物/药物的确实需要。
考虑到在人中风后测试对神经保护的治疗性干预的一些临床试验的严重失败，许多作者转向开发在病理状况的亚急性或慢性期可应用的脑修复策略。这些策略由提供神经营养性因子或者提供干细胞移植以促进功能恢复。
干细胞和脑缺血
已在经受脑缺血的动物中测试了几种类型的干细胞。在这些当中，可以提及的是胚胎干细胞(esc)、诱导多潜能干细胞(ipsc)、神经干细胞(nsc)和间质干细胞(msc)(对于综述，参见haoetal.,2014)。尽管esc和ipsc已在缺血后在动物中显示出有益作用，但是可利用度的问题(用于esc)以及它们转变为肿瘤的能力目前限制了它们在人类中的使用。实际上，已表明这些细胞在注射后能够导致产生肿瘤。
在胎儿组织、初生儿组织、年轻个体以及成人中发现了神经干细胞(nsc)。人类和动物中的神经母细胞干细胞龛(stemcellniches)是齿状回的室下区(svz)和颗粒下层(serietal.,2006)。尽管这些细胞已在它们的分化方面取向，但仍将它们称为干细胞，因为在特定的分化流程的背景下，它们能够分化为海马神经元、分化为皮层神经元或者分化为运动神经原或中间神经元。文献中有多项研究已显示出脑缺血后nsc移植的有益作用，例如，如文档hao及其合作者，2014中所述。例如，缺血性皮层损伤中或其外周中nsc的给予促进了svz中成神经细胞的产生。在大鼠中给予它们后观察到了与功能恢复增加相关的树突分枝以及轴突生长的刺激(andresetal.,2011)。然而，一些约束限制了这些细胞在临床实践中的使用。这是因为伦理约束使由胎儿分离这些细胞变得困难。nsc的另一来源将是svz的大脑活组织检查，在缺血的情况下，这仅可以在死后进行，从而大大限制了来源的量并使得不可能在患者中求助于自体移植。
研究的另一种方法是使用更易获得的其它干细胞，如间质干细胞(msc)。friedenstein及其合作者在1970年首次鉴别了这些细胞，他们将这些细胞表征为粘附至塑料制品并且是稀少的(friedensteinetal.,1970)。已经鉴别和使用了一些来源，其主要包括骨髓，而还有牙髓(yalvacetal.，2009；yamagataetal.，2013)、毛囊(wangetal.，2013)、胎盘(in'tankeretal.，2004)或脐带(ericesetal.，2000；kranzetal.，2010)。
与所有干细胞相似，msc可以分化为特化细胞并自更新。msc能够体外分化为多种细胞类型，并且在适合的环境中和适合的条件下，它们能够分化为非间质表型，如神经元或心肌细胞表型(esneaultetal.，2008；tomaetal.,2002)。这些细胞易于从骨髓获得和提取并且它们容易且快速增殖，这使得可以进行自体同源移植，从而能够限制患者难以耐受的免疫抑制剂治疗的使用。此外，在膜上间质干细胞不表达ii型(hla-dr或hla，ii型)主要组织相容性复合体(mhc)并且仅表达少量i型(hla-abc或hla，i型)mhc。另外，dinicola及其合作者在2002年证实在与msc共培养的条件下t淋巴细胞增殖减少，这处于剂量依赖性且可逆的方式(dinicola,2002)。除t淋巴细胞之外，msc可以对其它炎症细胞，如自然杀伤细胞、树突状细胞或巨噬细胞具抗炎作用(aggarwal&pittenger,2005；eckertetal.,2013)。在心脏、神经或者免疫疾病的背景下进行的临床试验未推理地显示出给予msc后的严重的副作用(malgierietal.,2010)。
在脑缺血中，临床前研究和一些临床研究已显示出给予msc后所获得的缺血后功能益处，如haoetal.,2014和kaladkaandmuir,2014中所总结的。
在临床研究方面，bang及其合作者(2005)首次向经受脑缺血的患者给予msc。该首次研究在几位患者(5位，相比于25位对照)中进行，但是显示未出现肿瘤发展以及在患有中风的患者中自体同源给予msc的可能的可行性。作者在治疗后3至6个月观察到治疗患者缺血后功能恢复的改善。在2010年，通过在16位中风患者中iv给予msc确认了这些结果。具体地，观察到治疗的患者的死亡率相对降低。通过mrs，在5年的观察期内显示出治疗对功能恢复的有益作用(leeetal.,2010)。从那时起，其它研究使得可以强化这种新型治疗策略的可行性和安全性的见解(bhasinetal.,2011；suárez-monteagudoetal.,2009)。一些现象解释了msc的效力，如它们有关神经原或血管原生长因子(fgf2、ngfb、egf、vegf-a、igf1、bdnf)的旁分泌性质。
然而，尽管它们提供了许多优势，但是在给予至缺血性区域后，msc具有非常限制的存活率。实际上，根据toma及其合作者(2002)，99％的细胞在前24小时内死亡，植入后4天仅有0.5％的植入缺血性环境的msc存活。一些现象解释了这种细胞损失(tomaetal.，2002)。实际上，炎症、缺氧、失巢凋亡(缺少支持)或者周围媒介中存在促凋亡因子引起了细胞凋亡的引发。此外，由于脑缺血的特征在于脑血流量的减少，因此移植的细胞缺少它们存活所必需的能量基底。另外，补充至缺血性区域的嗜中性白细胞和巨噬细胞将产生氧化自由基，对此song及其合作者(song,chaetal.，2010)显示在心脏缺血的情况下，对间质干细胞的附着的不良影响。当发生时，细胞通过整合素蛋白对周围媒介的细胞外基质的粘附引起了细胞中的积极信号并抑制细胞凋亡，而在缺少支持的情况下发生了相反现象(song,songetal.，2010)。此外，在缺血后，金属蛋白酶破坏了细胞外基质并且这些金属蛋白酶的持续限制了ecm的重构。根据toma及其合作者，认为注射的细胞的死亡的主要因素之一是缺少生长支持，引发失巢凋亡。该现象与自由基的存在是同时的，这进一步限制了向宿主组织引入移植物。另外，对缺血而言的组织再生极大地依赖于治愈区域的血管化。
还存在寻找克服现有技术这些缺陷、缺点和障碍的新型组合物，具体地，可以具体地治疗/终止中风，治疗中风的后果/影响，减少中风治疗成本和改善中风治疗的治疗性/给药方案的组合物的确实需要。
技术实现要素：
本发明的目标是通过提供药物组合物用于作为用于预防和/或治疗由脑缺氧病理条件所引起的中枢神经系统的组织损伤的药剂的应用来准确满足这些需要，所述组合物包含：
-由以下通式(i)所表示的生物相容性聚合物
aaxxyy(i)
其中：
a代表单体，
x代表-r1coor2或者-r9(c＝o)r10基团，
y代表o-或n-磺酸酯基团，其对应于以下化学式-r3oso3r4、-r5nso3r6、-r7so3r8中的一种
其中：
r1、r3、r5和r9独立地代表基于脂肪烃的链，其可选地是支链的和/或不饱和的并且其可选地含有一个或多个芳香环，
r2、r4、r6和r8独立地代表氢原子或阳离子，
r7和r10独立地代表键或者可选地支链的和/或不饱和的基于脂肪烃的链，
“a”代表单体的数目，
“x”代表基团x对单体a的取代度
“y”代表基团y对单体a的取代度，以及
-真核细胞。
在本文件中，术语“中枢神经系统的组织损伤”旨在表示可以在中枢神经系统中出现的任何组织损伤。例如，其可以是由于物理冲击，例如与外伤有关的物理冲击所造成的组织损伤、由于缺血性休克，例如由于与例如血管闭塞、血管出血或缺氧休克有关的瞬间和/或持久脑血流量减少所造成的组织损伤。
在本发明文档中，术语“脑缺氧病理状况”旨在表示能够导致脑供氧减少的任何病理状况和/或事件。
例如，其可以是血管事件、心动停止、低血压、与手术期间麻醉有关的一种或多种并发症、窒息、一氧化碳中毒、溺水、一氧化碳或烟雾的吸入、脑损伤、勒颈、哮喘发作、外伤、由于缺血性休克、产期缺氧等所造成的组织损伤等。
在本文件中，术语“单体”旨在表示例如选自糖、酯、醇、氨基酸或核苷酸的单体。
在本文件中，构成式i的聚合物的基本元素的单体a可以是相同或不同的。
在本文件中，单体的连接可以使得可以形成聚合物骨架，例如，具有聚酯、多元醇或多糖性质或者核酸或蛋白质类型的聚合物骨架。
在本文件中，在聚酯中，可以存在例如来自生物合成或化学合成的共聚物，例如，脂族聚酯，或者天然来源的共聚物，例如，聚羟基烷基酸酯。
在本文件中，多糖及其衍生物可以是细菌、动物、真菌和/或植物来源的。它们可以是例如单链多糖，例如，聚葡萄糖，例如，右旋糖酐(dextran)、纤维素、β-葡聚糖(glucan)，或者包含更多复合单元的其它单体，例如黄原胶，例如，葡萄糖、甘露糖和葡糖醛酸，或者葡萄糖醛(glucuronan)和糖葡萄糖醛(glucoglucuronan)。
在本文件中，植物来源的多糖可以是单链的，例如，纤维素(葡萄糖)、果胶(半乳糖醛酸)、脱氧半乳聚糖或淀粉，或者可以是更复杂的，例如，海藻酸盐(半乳糖醛酸和甘露糖醛酸)。
在本文件中，真菌来源的多糖可以是(例如)立体葡聚糖(steroglucan)。
在本文件中，动物来源的多糖可以是例如几丁质或壳聚糖(氨基葡萄糖)。
式(i)中由“a”定义的单体a的数目可以使得所述式(i)的聚合物的分子量大于约2000道尔顿(其对应于10个葡萄糖单体)。式(i)中由“a”定义的单体a的数目可以使得所述式(i)的聚合物的分子量小于约2000000道尔顿(其对应于10000个葡萄糖单体)。有利地，所述式(i)的聚合物的分子量可以为2至100千道尔顿。
在本文件中，在代表x的-r1coor2基团中，r1可以是c1至c6烷基，例如，甲基、乙基、丁基、丙基或戊基，优选地甲基基团，并且r2可以是键、c1至c6烷基，例如，甲基、乙基、丁基、丙基或戊基，或者r21r22基团，其中r21为阴离子，r22为选自碱金属的组的阳离子。
优选地，基团x为式-r1coor2的基团，其中r1为甲基基团-ch2-，r2为r21r22基团，其中r21为阴离子，r22为选自碱金属的组的阳离子，优选地，基团x是式-ch2-coo-的基团。
在本文件中，在代表x的-r9(c＝o)r10基团中，r9可以是c1至c6烷基，例如，甲基、乙基、丁基、丙基或戊基，优选地甲基基团，并且r10可以是键或c1至c6烷基，例如，甲基、乙基、丁基、丙基、戊基或己基。
在本文件中，在对应于下式-r3oso3r4、-r5nso3r6和-r7so3r8中的一种并且代表基团y的基团中，r3可以是键、c1至c6烷基，例如，甲基、乙基、丁基、丙基或戊基，优选地甲基基团，r5可以是键、c1至c6烷基，例如，甲基、乙基、丁基、丙基或戊基，优选地甲基基团，r7可以是键、c1至c6烷基，例如，甲基、乙基、丁基、丙基或戊基，优选地甲基基团，并且r4、r6和r8可以独立地为氢原子或阳离子m+，例如m+可以是碱金属。
优选地，基团y是式r7so3r8的基团，其中r7是键，r8是选自包含钠、钾、铷和铯的组的碱金属。优选地，基团y是-so3-na+基团。
通式(i)中由“y”定义的基团y对全部单体a的取代度可以为30％至150％，并且优选为约100％。
在本文件中，在以上取代度的定义中，术语“100％的取代度‘x’”旨在表示以下事实：本发明的聚合物的每个单体a在统计学上含有基团x。同样地，术语“100％的取代度‘y’”旨在表示以下事实：本发明的聚合物的每个单体在统计学上含有基团y。大于100％的取代度反映了以下事实：每个单体在统计学上具有大于一个所讨论的类型的基团；相反地，小于100％的取代度反映了以下事实：每个单体在统计学上具有小于一个所讨论的类型的基团；
聚合物还可以包含功能性化学基团，其表示为z并且不同于x和y。
在本文件中，基团z可以是相同的或不同的，并且可以独立地选自包含氨基酸、脂肪酸、脂肪醇、神经酰胺或它们的混合物或者靶向核苷酸序列的组。
基团z还可以表示活性药剂，其可以是相同的或不同的。它们可以是例如治疗剂、诊断剂、抗炎剂、抗微生物剂、抗生素、生长因子、酶。
在本文件中，基团z可以有利地为饱和或不饱和的脂肪酸。其可以是例如脂肪酸，其选自包含乙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、二十四烷酸、蜡酸、肉豆蔻油酸(myristoleicacid)、棕榈油酸、杉皮酸、油酸、反油酸、反式异油酸、亚油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、双高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。优选地，脂肪酸为乙酸。
在本文件中，基团z可以有利地为l或d系列的氨基酸，其选自包含丙氨酸、天门冬酰胺、芳香族链，例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲状腺素或组氨酸的组。
有利地，基团z可以为聚合物赋予额外的生物或生理化学性质。例如，基团z可以增加所述聚合物的溶解度或亲脂性，使其能够例如更好地组织扩散或穿透，例如，两亲性的增加可以促进穿过血脑屏障。
其中存在z的聚合物对应于下式ii：
aaxxyyzz
其中a、x、y、a、x和y为如上所定义的，并且z代表基团z的取代度。
在本文件中，“z”所表示的基团z的取代度可以为0％至50％，优选地等于30％。
基团x、y和z可以独立地键合至单体a和/或独立地彼此键合。当基团x、y和z中至少一个独立地键合至不同于前者的基团x、y和z时，所述基团x、y或z中的一个键合至单体a。
因此，基团z可以直接共价键合至单体a或者共价键合至基团x和/或y。
在本文件中，组合物可以包含相对于组合物总重量按重量计0.01微克至100mg的生物相容性聚合物的浓度。例如，组合物可以包含相对于组合物总重量的按重量计10微克至10毫克。
在本文件中，组合物中生物相容性聚合物的浓度和/或组合物的给予剂量方案可以取决于对根据本发明的组合物所设想的给予途径。
例如，对于颅内给予，其可以为1至5ml的单次给予，或者通过微型泵在例如几天内给予。例如，组合物可以包含浓度为0.001至1mg.ml-1的生物相容性聚合物。
在本文件中，术语“真核细胞”旨在表示本领域技术人员所知的任何真核细胞。例如，其可以是哺乳动物真核细胞，例如，动物或人真核细胞。其可以是例如任何真核细胞而不论其分化阶段，例如，选自包含成年或胚胎真核细胞、胚胎干细胞和成熟干细胞的组的细胞。其可以是例如来自脐带血的真核细胞、骨髓细胞、脂肪组织细胞、间充质细胞。
其还可以是多潜能或全能性干细胞，或进入分化途径的细胞，例如，间充质干细胞。其还可以是胚胎干细胞以外的多潜能或全能性干细胞。
它可以是例如相对于个体异源、异体同源或自体同源的细胞。优选地，细胞是自体同源细胞。
有利地，当细胞为自体同源时，出于管理、安全性、可行性、效率和经济原因，根据本发明的组合物可以是优选的。
有利地，当细胞为自体同源时，它们优选地分离自个体并且在根据本发明的组合物中使用和/或在移除和分离后24小时内的治疗中使用而无需其它添加。有利地，这种单次给予使得可以克服并符合管理要求/限制。
在本文件中，包含在组合物中的细胞的量可以为1至5×107个细胞。
在本文件中，术语“药物组合物”旨在表示本领域技术人员所知的任何药物组合物形式。在本文件中，药物组合物可以是例如可注射溶液。其可以是例如可注射溶液，例如，用于局部或全身注射，例如，在生理盐水中，在可注射葡萄糖溶液中，在存在赋形剂(例如，右旋糖酐)的情况下，例如，在本领域技术人员所知的浓度，例如，1毫克至几毫克/ml。药物组合物可以是例如旨在用于口服给予的药剂，其选自包含液体制剂、口服泡腾给药方案形式、口服粉末、多颗粒系统和口腔分散药物形式的组。
例如，当药物组合物用于口服给予时，其可以处于液体制剂的形式，其选自包含溶液、糖浆、混悬液和乳液的组。当药物组合物处于口服泡腾给药方案形式时，其可以选自包含片剂、颗粒和粉末的组。当药物组合物处于口服粉末或多颗粒系统的形式时，其可以处于选自包含珠、颗粒、迷你片剂和微粒的组的形式。当药物组合物处于口服分散给药方案形式时，其可以处于选自包含口服分散片剂、冻干薄片、薄膜、咀嚼片剂、片剂、胶囊或医用口香糖的组的形式。
根据本发明，药物组合物可以是用于口服给予，例如，口腔和/或舌下给予的药物组合物，例如，选自包含口腔或舌下片剂、糖锭、滴剂和喷雾溶液的组。
根据本发明，药物组合物可以是用于局部、透皮给予的药物组合物，例如，选自包含软膏、乳膏、凝胶、洗剂、贴片和泡沫的组。
根据本发明，药物组合物可以是用于鼻部给予的药物组合物，例如，选自包含滴鼻剂、鼻喷雾和鼻粉剂的组。
根据本发明，药物组合物可以是用于肠胃外给予，例如，皮下、肌内、静脉内或鞘内给予的药物组合物。
在本文件中，可以根据其给予配制和/或调节组合物。例如，对于静脉内或肌内给予，可以给予组合物以递送每公斤体重0.1至5mg的生物相容性聚合物的剂量，或者对于口服给予，可以例如以每天总计例如15至500mg的生物相容性聚合物的量以每天2至5次等量摄入来给予组合物，或者对于颅内给予，组合物可以包含0.001至1mg.ml-1生物相容性聚合物的浓度，或者对于舌下给予，组合物可以包含1至100mg/ml生物相容性聚合物的浓度，或者对于空气给予，可以给予组合物以递送每公斤体重0.1至5mg的生物相容性聚合物的剂量。
本发明的组合物还可以包含至少一种其它活性成分，具体地，一种其它治疗活性成分，例如，取决于所使用的药物制剂，用于同时、单独或随时间顺序使用。这种其它成分可以是例如在例如可以在患有中枢神经系统组织损伤的患者中发展的机会疾病的治疗中使用的活性成分。其还可以是本领域技术人员所知的药物产品，例如，抗生素、抗炎剂、抗凝血剂、生长因子、血小板提取物、神经保护剂或抗抑郁剂、抗胆固醇剂，如抑制素等。
在本文件中，生物相容性聚合物和细胞的给予可以是同时的、顺序的或伴随的。
根据本发明，给予中的至少一种可以口服或通过注射进行。可以以相同方式或不同地进行两种给予。例如，给予中的至少一种可以口服或通过注射进行。例如，生物相容性聚合物和细胞的给予可以通过注射进行，生物相容性聚合物的给予可以通过口服进行，而细胞可以通过全身注射或局部注射进行。给予还可以取决于损伤的位置。
根据本发明，真核细胞的使用，具体地，它们的给予可以在生物相容性聚合物的第一次给予后的5分钟至3个月，例如，5分钟至1周，优选地，5分钟至24小时的时段内进行。
根据本发明，可以例如每天一次、每天两次或每周一次给予组合物。例如，其可以是每天1次、每天2次或更多次的给予。
根据本发明，组合物可以例如在1天至3个月，例如，2个月的期间内给予。例如，组合物可以在3个月的期间内给予，其中给予频率为每15天。
根据本发明，生物聚合物可以例如在1天至3个月，例如，2个月的期间内给予，其中频率为例如1天1次，并且可以在相同的或不同的期间内给予真核细胞，例如，在1天至3个月的期间内，以每周的频率进行。
根据本发明，当聚合物的给予和细胞的给予是顺序的时，每种给予的给药方案可以是给予聚合物然后给予细胞。例如，细胞可以在聚合物给予后1分钟至24小时，聚合物给予后30分钟至12小时给予，聚合物给予后45分钟至6小时，聚合物给予后1小时给予。
本发明还涉及用于治疗患有脑缺血的患者的方法，其以任何顺序包括以下步骤：
i.至少一种生物相容性聚合物的给予，和
ii.至少一种真核细胞的给予，
其中给予是伴随、顺序或交替的。
生物相容性聚合物为如上所定义的。
真核细胞为如上所定义的。
根据本发明，患者可以是任何哺乳动物。患者可以是例如动物或人。
根据本发明，给予的真核细胞可以是相对于所述患者异源或同源异体的细胞。
根据本发明，生物相容性聚合物的给予方法和/或途径可以如上所定义。
根据本发明，细胞的给予方法和/或途径可以如上所定义。
根据本发明，生物相容性聚合物的给予频率可以如上所定义。
根据本发明，真核细胞的给予频率可以如上所定义。
根据本发明，当生物相容性聚合物和细胞的给予是顺序的时，每种给予的给药方案可以是给予生物相容性聚合物然后给予细胞。例如，细胞可以在生物相容性聚合物给予后1分钟至48小时，聚合物给予后30分钟至12小时，聚合物给予后45分钟至6小时，聚合物给予后1小时给予。
有利地，真核细胞是间充质成熟干细胞。
换言之，即使在本发明中提及了组合物，但是应清楚理解组合物的每种化合物可以与其它化合物伴随给予(例如，在单种组合物或在两种组合物中，这些组合物各自包含一种或多种上述组分，每种化合物或组合物的给予方法可能是相同或不同的)，或彼此独立地给予，例如，顺序给予，例如，生物相容性聚合物的独立给予、真核细胞的独立给予，这些给予在同一个患者上伴随、顺序或以交替方式以上述的顺序或另一种顺序进行的。这些各种的给予可以彼此独立或以相关方式(组合物或共给予)通过相同的或不同的给予方法(注射、摄入、局部给予等)每天给予一次或多次，持续可以是或可以不是连续的一天或多天。
本发明的主题还是用于预防和/或治疗由脑血管缺血所引起的中枢神经系统组织损伤的药物试剂盒，其包含：
i.生物相容性聚合物，和
ii.至少一种真核细胞。
生物相容性聚合物为如上所定义的。
真核细胞为如上所定义的。
本发明的主题还是药物组合物用于生产用于治疗由脑血管缺血所引起的中枢神经系统组织损伤的药剂的用途，该药物组合物包含：
i.生物相容性聚合物，和
ii.至少一种真核细胞
生物相容性聚合物为如上所定义的。
真核细胞为如上所定义的。
在该实施方式中，术语“药剂”旨在表示如上定义的药物组合物。
本发明人已意外地且出乎意料地证实根据本发明的组合物有利地能够显著减少缺血性损伤。
另外，本发明人还证实根据本发明的组合物有利地能够进行较早的和持久的缺血后功能恢复。
本发明人还证实在给予根据本发明的组合物后，根据本发明的组合物有利地能够较早地改善神经功能和感觉运动表现。
此外，本发明人还证实根据本发明的组合物有利地使得可以限制/减少由例如与例如中风有关的组织损伤所引起的梗死体积。
另外，本发明人还证实根据本发明的组合物有利地使得可以保护和/或刺激显示出与例如中风和/或放射治疗有关的损伤的脑组织再生。
在阅读通过说明的方式所提供的附图所示的以下实施例，其它优势也可以进一步显现于本领域技术人员。
附图说明
图1显示了目标在于研究生物相容性聚合物对脑损伤和神经缺陷的影响的实验规程图。在该图中，mcao表示大脑中动脉闭塞，lp表示肢体放置测试；ns表示神经学评分；of表示旷场；mri表示磁共振成象。
图2是表示不施加(1)或者在引起损伤的缺血性事件后2天(d2)或14天(d14)施加生物相容性聚合物后(2)的梗死(虚线内区域)的中枢神经系统(脑)的照片(图2a)。图2b显示了在不施加(白色条)或施加生物相容性聚合物(黑色条)的情况下作为天数(x轴)的函数的损伤体积(y轴)的图表。
图3显示了在给予(实心三角形)或不给予(空心三角形)生物相容性聚合物后作为时间函数的肢体放置测试结果(*重复测量anovap<0.05)的图表(图3a)。图3b显示了在给予(实心条)或不给予(空心条)生物相容性聚合物后3天左右使用转角测试(cornertest)评估的偏侧性结果的条形图(*平均值与参考值0的比较，p<0.05)。图3c显示了在给予(实心条)或不给予(空心条)生物相容性聚合物后2或4周后，使用粘附拔出测试的(adhesivewithdrawaltest)细微感觉运动恢复的评估的条形图(*p<0.05，单因素anova)，y轴表示时间(秒)。
图4显示了通过mri研究结合行为测试，即bwt(横梁行走测试)；lp(肢体放置测试)；ns(神经学评分)和pa(被动回避)，目标为研究生物相容性聚合物和成熟干细胞(间充质干细胞)的共同给予的效果的实验规程图。
图5显示了不施加(1)或在引起损伤的缺血性事件后2天(d2)或14天(d14)施加生物相容性聚合物后(2)，施加间充质干细胞后(3)以及施加生物相容性聚合物和间充质干细胞(4)后的梗死(虚线内区域)的中枢神经系统(脑)的照片(图5a)。图5b是显示在不施加(白色条)或施加生物相容性聚合物(黑色条)、施加间充质干细胞(水平划线)或施加生物相容性聚合物和间质充干细胞后(对角划线)的情况下，作为天数(x轴)的函数的损伤体积(y轴)的图。
图6显示了给予(实心方块)或不给予(空心三角)生物相容性聚合物后，给予间充质细胞(实心圆)以及给予生物相容性聚合物和间充质细胞(划线方块)后，作为时间函数的肢体放置测试结果(*重复测量anovap<0.05)的图表(图6a)。图6b显示了在给予(实心条)或不给予(空心条)生物相容性聚合物，给予间充质干细胞以及给予间充质干细胞和生物相容性聚合物后3天左右使用转角测试的偏侧性评估结果的柱状图(*平均值与参考值0的比较，p<0.05)。图6c是在给予(实心条)或不给予(空心条)生物相容性聚合物，施加间充质干细胞(水平划线条)或应用生物相容性聚合物和间充质干细胞(对角划线条)后2或4周后，使用粘附拔出测试的细微感觉运动恢复的评估的柱状图(*p<0.05，单因素anova)，y轴表示时间(秒)。
图7显示了载体/载体(a)、载体/间充质干细胞(b)、生物相容性聚合物/载体(c)和生物相容性聚合物/间充质干细胞(d)组中大脑中动脉闭塞后35天时缺血性区域中血管化的光学显微照片。比例尺为500μm。
具体实施方式
实施例
实施例1：根据本发明的生物相容性聚合物对由脑缺血引起的脑损伤和功能缺陷的效果的评估
在本实施例中，生物相容性聚合物是otr3公司以贸易编号otr4131出售的聚合物，其描述于frescalineg.etal.,tissueengparta.2013jul；19(13-14):1641-53.doi:10.1089/ten.tea.2012.0377中，并且是可商购的。
大鼠为spraguedawley株雄性大鼠。
为了定义otr4131生物相容性聚合物对脑损伤和功能缺陷的效果，在由闭塞的大脑中动脉造成短暂性脑缺血的大鼠中进行图1所示的实验规程。
具体地，通过吸入o2/n2o混合物(各自比例为1/3)中5％的异氟烷3分钟使动物麻醉，然后在手术期间通过面罩递送2-2.5％的异氟烷来维持。将大鼠背部朝下平躺放置。在颈部水平进行切口。分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，然后将闭塞线引入颈外动脉并向上至大脑中动脉的近端部分。1小时后，除去线以允许再灌注，例如，如letourneuretal.,2011"impactofgeneticandrenovascularchronicarterialhypertensionontheacutespatiotemporalevolutionoftheischemicpenumbra:asequentialstudywithmriintherat"jcerebbloodflowmetab.2011feb；31(2):504-13或quittetetal.,"effectsofmesenchymalstemcelltherapy,inassociationwithpharmacologicallyactivemicrocarriersreleasingvegf,inanischaemicstrokemodelintherat."actabiomater.2015mar；15:77-88中描述的。
引起缺血后1小时，静脉内给予1.5mg/kg的otr4131，然后唤醒动物。
为了评估治疗对缺血体积的影响，在引起脑缺血后48小时和14天进行mri(磁共振成象(7t,pharmascan,brukerbiospin,ettlingen,germany))研究。为了进行该研究，通过吸入1/3o2/n2o混合物中5％的异氟烷3分钟使动物麻醉，然后通过2-2.5％的异氟烷保持麻醉。根据rare8快速采集模式，使用再聚焦回波，重复时间5000毫秒，回波时间16.25毫秒，平均数(nex实验数目)＝2，256×256像素的阵列以及3.84×3.84cm的画面大小或fov(视场)，即0.15×0.15×0.75mm3的标称分辨率，使用解剖学t2序列。每只动物进行20个连续切片，总采集时间4分钟。
图2a显示了短暂性脑缺血后2或14天后获得的mri图像。如该图所示，与未接受生物相容性聚合物的大鼠相比，在缺血开始后1小时，注射生物相容性聚合物后观察到梗死的减少(虚线围绕的区域)。当闭塞后1小时给予治疗时，在d2和d14观察到梗死体积明显减少(图2)。
还在改变注射时间的情况下进行该实验：在引起脑缺血后2小时30分或6小时注射，并显示没有明显结果(结果未提供)。换言之，在引起缺血后2小时30分或6小时，单次注射生物相容性聚合物对缺血所引起的梗死没有任何作用。
还进行了生物相容性聚合物对功能恢复的作用的评估。为了进行该评估，根据quittetetal.,"effectsofmesenchymalstemcelltherapy,inassociationwithpharmacologicallyactivemicrocarriersreleasingvegf,inanischaemicstrokemodelintherat."actabiomater.2015mar；15:77-88或freretetal.,2006"long-termfunctionaloutcomefollowingtransientmiddlecerebralarteryocclusionintherat:correlationbetweenbraindamageandbehavioralimpairment."behavneurosci.2006dec；120(6):1285-98中描述的方法进行了一系列感觉运动和认知测试。
图3显示了所得结果。如该图所示，引起缺血后1小时注射生物相容性聚合物使得功能恢复改善，例如，如与未接受注射的大鼠相比，在评估感官表现的肢体放置测试中(重复测量anovap<0.05)(图3a，实心三角形)，以及与未接受注射的大鼠相比，通过将平均值与参考值比较，p>0.05，评估动物的偏侧性的转角测试中(图3b，实心条)所示。
另外，通过粘附拔出测试，随后对感觉运动表现进行了细微评价。图3c显示了所得结果。如该图所示，2周时，与未接受生物相容性聚合物的另一组相比，在闭塞后1h接受生物相容性聚合物给予的动物(实心条)具有更快地在受缺血影响的健侧上感知到粘合剂存在的倾向(单因素anova，p＝0.1)。在第4周的重复测试显示出关于在健侧位置上感知出粘合剂的趋势的持久性(单因素anova，p＝0.1)。对于用生物相容性聚合物处理的动物，后者增加了健侧上粘合剂显著更快的拔出，从而证明了通过生物相容性聚合物引起的感觉运动表现的更快速改善。
实施例2：生物相容性聚合物和间充质干细胞的共同给予对由缺血性休克引起的脑损伤和功能缺陷的效果的评估
在本实施例中，大鼠和生物相容性聚合物与实施例1中的那些相同。
根据文档quittetetal.,"effectsofmesenchymalstemcelltherapy,inassociationwithpharmacologicallyactivemicrocarriersreleasingvegf,inanischaemicstrokemodelintherat"actabiomater.2015mar；15:77-88中描述的方法，由spraguedawley大鼠的股骨和胫骨提取间充质干细胞。
为了定义otr4131生物相容性聚合物和间充质干细胞的共同给予对脑损伤和功能缺陷的效果，根据如以上实施例1描述的管腔内方法，在由闭塞的大脑中动脉造成的短暂性脑缺血的大鼠中进行图4中所示的实验规程。
进行共酮给予对梗死体积以及对缺血后功能恢复的效果的评估。
为了评估治疗对缺血体积的影响，在引起脑缺血后48小时和14天进行mri(磁共振成象)研究，如以上实施例1所述。
48小时后的mri分析显示对于用rgta和rgta-msc共同给予处理的动物，相对于对照组，梗死体积减少(单因素anova，p<0.05)，如图5a所示(虚线内的区域)。具体地，清楚地显示与未接受注射的受试者相比，共同给予有利地能够在48小时减少损伤体积，并且出乎意料地，使得可以在14天后显著减少损伤体积，特别是与单独用生物相容性聚合物或单独用msc处理的动物相比(图5a和b)。因此，该实验清楚地显示根据本发明的组合物和/或生物相容性聚合物和细胞的给予使得可以获得在它们不存在的情况下和/或当它们单独给予时所观察不到的新的技术效果。
还进行了生物相容性聚合物和干细胞的共同给予对功能恢复的作用的评估。为了进行评估，进行了一系列感觉运动和认知测试。
图6显示了所得结果。如该图所示，治疗对感觉运动和认知表现的作用，通过肢体放置测试的早期感觉恢复的评估(图6a)显示生物相容性聚合物-间充质干细胞组动物的恢复(划线正方形)优于另外三组(重复测量anovap<0.05)。
对于通过转角测试评估的偏侧性，功能恢复的增强也很显著，所述增强是通过仅对于生物相容性聚合物-间充质干细胞组动物的不同于设置为0(非偏侧性值)的参考值的偏侧优势指数所显示的(图6b)。最后，对于粘附拔出测试，已显示仅对生物相容性聚合物-间充质干细胞组动物，在受缺血影响的健侧中从封闭后第二周开始粘附拔出加快(单因素anovap<0.05)(图6c，划线条)。
因此，这些结果清楚显示生物相容性聚合物和真核细胞，具体地间充质干细胞(msc)的组合使得可以获得并治疗中枢神经系统的组织损伤。具体地，其还出乎意料地使得能够比未治疗的动物更大程度的功能恢复，并且还使得能够比仅使用生物相容性聚合物或单独使用msc治疗的动物更大程度的功能恢复。
还进行了离体评估。为了进行该评估，在0.1mpbs中漂洗脑的切片3次5分钟，然后在0.1mpbs/3％bsa(牛血清白蛋白，
因此，使用reca-1抗体(大鼠内皮细胞抗体-1)对内皮细胞的标记，通过免疫荧光评估使其缺血的组织的血管化。在适当情况下，标记使得可以鉴别阴影区域中白线所表示的组织的血管结构并使其明显。
如显示所获得的电子显微镜照片的图7所示，标记显示在不存在生物相容性聚合物或者生物相容性聚合物和间充质干细胞的组合的情况下，在梗死区域中未观察到血管化的结构的保持(图7a和c)。仅在存在生物相容性聚合物(图7b)或者生物相容性聚合物和间充质干细胞的组合(图7d)的情况下，可以观察到血管结构的保持。另外，图7d清楚地显示生物相容性聚合物和间充质干细胞的组合使得可以获得对血管结构保持的出乎意料和未预期的作用。
因此，本实施例清楚地显示根据本发明的组合物有利地使得可以防止和/或治疗由脑血管缺血引起的中枢神经系统的组织损伤。另外，本实施例清楚地显示根据本发明的组合物还使得可以治疗由中枢神经系统的组织损伤所引起的可能的功能缺陷。另外，本实施例清楚地显示根据本发明的组合物有利地使得可以减少恢复时间和/或使得可以由组织损伤所引起的可能的功能缺陷恢复。
因此，本实施例清楚地显示在例如通过限制梗死体积的组织保护方面，以及在如上所述的功能恢复方面，根据本发明的组合物在缺血中具有显著的有益作用。这些有益作用还添加了梗死区域中血管系统结构保持的改善。
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