用于促进伤口愈合的组合物的制作方法

本发明大致关于伤口愈合，具体而言关于用于促进伤口愈合的组合物。

背景技术：

糖尿病是一种严重的全球性问题，全球约有2亿8千5百万人受到糖尿病的影响。多达25％的糖尿病病患会发生糖尿病足部溃疡，导致不良的生活质量及下肢截肢的风险。包括血糖控制、清创、移除传染媒介物、湿性敷料及卸除伤口高压等目前糖尿病伤口的临床治疗方法可加速伤口闭合，但对于所有具有糖尿病伤口的病患尚无有效的治疗策略。有些病患无法使用这些标准方法治愈，这表示需要进一步研究调查受损伤口愈合的主要及分子事件。

伤口愈合是一个复杂的生物过程，可分为四个重迭阶段：止血、发炎、增生和组织重塑。在止血阶段，血小板凝集并迅速引发纤维蛋白凝块的形成，可在皮肤伤口损伤后保护伤口并防止细菌侵入。发炎阶段在2-3天内开始，如嗜中性细胞和巨噬细胞的白血球通过受伤组织分泌的趋化因子被吸引至伤口损伤处。增量的白血球亦参与清除入侵的病原体并通过产生炎性细胞因子而诱发炎性反应。在增生阶段，新生血管过程与纤维母细胞及角质细胞增生和细胞外基质的沉积同时发生。最后，在组织重塑阶段发生许多活动，包括肌纤维母细胞的出现、细胞外基质的重塑及瘢痕形成。

肿瘤内皮标志物1(tem1)，也被称为内皮唾酸蛋白(endosialin)或cd248，最初被鉴定为是在肿瘤血管中的一个高度上调蛋白。tem1由六个结构域(domain)组成，包括n端凝集素样(lectin-like)结构域(tem1结构域1，tem1d1)、寿司样(sushi-like)结构域(tem1d2)、三重复的表皮生长因子(egf)样结构域(tem1d3)、粘蛋白样结构域(tem1d4)、跨膜结构域(tem1d5)和胞质结构域(tem1d6)。最近的报告显示，与野生型小鼠相较之下，tem1敲除的小鼠在大肠癌异种移植的肿瘤生长、入侵及转移上显现出降低。也已证实tem1通过其胞质结构域促进肿瘤生长及炎症性关节炎。这些结果显示tem1在生理及病理条件下具有一定作用。

技术实现要素：

一方面，本发明关于一种将组合物用于制备在所需主体中促进伤口愈合和/或加速开放性伤口闭合的医药品的用途，该组合物包含：(a)治疗有效量的重组多肽，该重组多肽含有与seqidno:2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；及(b)医药可接受媒剂、载体、稀释剂、赋形剂和/或盐类。

或者，本发明关于一种在所需主体中促进伤口愈合和/或加速开放性伤口闭合的医药组合物，其包含：(a)治疗有效量的重组多肽，包含与seqidno:2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；及(b)医药可接受媒剂、载体、稀释剂、赋形剂和/或盐类。

本发明还关于一种在所需主体中促进伤口愈合和/或加速开放伤口闭合的方法，包含：将一种组合物施与所需主体，该组合物包含：(a)治疗有效量的重组多肽，其包含与seqidno:2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；及(b)医药可接受媒剂、载体、稀释剂、赋形剂和/或盐类。

在本发明一个具体实例中，该重组多肽包含肿瘤内皮标志物1的结构域2和3，而不包含肿瘤内皮标志物1的结构域1、4、5和6。

在本发明另一个具体实例中，该重组多肽包含肿瘤内皮标志物1的结构域3，而不包含肿瘤内皮标志物1的结构域1、2和4至6。

在另一个具体实例中，该重组多肽包含肿瘤内皮标志物1的结构域1至4，而不包含肿瘤内皮标志物1的结构域5和6。

在另一个具体实例中，该重组多肽包含肿瘤内皮标志物1的结构域2至4，而不包含肿瘤内皮标志物1的结构域1、5和6。

在另一个具体实例中，该重组多肽包含肿瘤内皮标志物1的结构域3和4，而不包含肿瘤内皮标志物1的结构域1、2、5和6。

在另一个具体实例中，该重组多肽包含与seqidno:2氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。

在另一个具体实例中，该重组多肽包含seqidno:2的氨基酸序列。

在另一个具体实例中，该重组多肽包含seqidno:4的氨基酸序列。

在又一个具体实例中，该重组多肽是由包含seqidno:1核苷酸序列的dna所编码。

在另一个具体实例中，该医药品的剂型选自由凝胶、乳霜、糊剂、洗剂、喷剂、悬浮液、溶液、分散油膏、水凝胶及软膏所组成的群组。

在另一个具体实例中，该伤口选自由糖尿病足部溃疡、手术伤口、切伤、撕裂伤、擦伤、穿刺伤口及挤压性损伤所组成的群组中的至少一种，或其中该伤口是由磨皮、一度烧伤、二度烧伤、三度烧伤、化学烧伤或激光换肤所造成。

在另一个具体实例中，伤口延伸至皮下组织肌纤膜。

在另一个具体实例中，该主体为糖尿病患。

在又一个具体实例中，该主体罹患糖尿病足部溃疡。

在本发明另一个具体实例中，该重组多肽包含不多于130个氨基酸残基。

在本发明另一个具体实例中，该重组多肽由seqidno:2的氨基酸序列所组成。

尽管在不背离本揭示内容的新颖概念的精神和范围下可进行各种变化和修饰，结合以下附图及下列优选具体实例的说明，可清楚描述前述及其他本发明的各种方面。

附图说明本发明一种或多种具体实例，且与书面叙述一起用于解释本发明的原理，整个附图中尽可能使用相同的附图标记来指代一个具体实例的相同或类似的组件。

附图说明

图1显示重组tem1d3(rtem1d3)促进内皮细胞增生。以rtem1d3刺激明显增加人类脐静脉内皮细胞(huvecs)的增生。所显示的数据为平均值±sem(n＝3)。*p<0.05，**p<0.01，以邦弗朗尼(bonferroni)法事后检验的单因子变异数分析(one-wayanova)。

图2a-b显示rtem1d3促进内皮细胞迁移。(a，b)以rtem1d3刺激明显增加huvec的迁移。当rtem1d3被热灭活，rtem1d3的效果即被除去。所显示的数据为平均值±sem(n＝3)。***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的单因子变异数分析。

图3a-b显示rtem1d3促进内皮细胞管腔形成。(a，b)以rtem1d3刺激明显增加huvec的管腔形成。当rtem1d3被热灭活，rtem1d3的效果即被除去。所显示的数据为平均值±sem(n＝3)。*p<0.05，***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的单因子变异数分析。

图4a-b显示rtem1d3在小鼠中显著改善皮肤伤口愈合。(a，b)在野生型c57bl/6小鼠上产生伤口(直径7mm)，并以磷酸盐缓冲生理食盐水(pbs，n＝6)或rtem1d3(0.2mg/kg/小鼠，n＝8)局部施予小鼠。在第1、3、5及7天分析伤口闭合速率。所显示的数据为平均值±sem。***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的双因子变异数分析。ns代表无显著性。

图5a-b显示rtem1d3治疗在小鼠伤口中增加血管生成。(a，b)自经由pbs(n＝6)或rtem1d3(0.2mg/kg/小鼠，n＝6)处理4天的野生型c57bl/6小鼠获得皮肤伤口切片，进行cd31染色，且分析在伤口肉芽组织的cd31的荧光强度。所显示的数据为平均值±sem。***p<0.001，非成对t检验。

图6显示rtem1d1-4促进内皮细胞增生。以rtem1d1-4刺激显著增加huvec的增生。所显示的数据为平均值±sem(n＝5)。**p<0.01，***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的单因子变异数分析。

图7a-b显示rtem1d1-4促进内皮细胞迁移。(a，b)以rtem1d1-4刺激显著增加huvec的迁移。所显示的数据为平均值±sem(n＝4)。*p<0.05，***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的单因子变异数分析。

图8a-b显示rtem1d1-4促进内皮细胞管腔形成。(a，b)以rtem1d1-4刺激显著增加huvec的管腔形成。使用血管内皮生长因子(vegf)作为阳性对照组。所显示的数据为平均值±sem(n＝3)。**p<0.01，***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的单因子变异数分析。

图9显示rtem1d1-4刺激人类hacat细胞增生，以1％fbs加上rtem1d1-4显著增加hacat细胞的增生。使用表皮生长因子(egf)作为阳性对照组。所显示的数据为平均值±sem(n＝3)。***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的单因子变异数分析。

图10a-b显示rtem1d1-4促进人类hacat细胞迁移。(a，b)以5％fbs加上rtem1d1-4显著增加hacat细胞的迁移。使用表皮生长因子(egf)作为阳性对照。所显示的数据为平均值±sem(n＝3)。*p<0.05，***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的单因子变异数分析。

具体实施方式

本发明更详细地叙述于下列仅为说明的实施例，因为本文中许多修改及变化对于本领域的技术人员是明显的。现将详细描述本发明各具体实例。参照附图，整体而言相同的数字表示相同成分。如在本文叙述及随后整个权利要求中所使用，“一”、“一种”及“该”的含义除非上下文另有明确说明，否则也包括复数。此外，如在本文叙述及随后整个权利要求中所使用，“在…之中”的含义除非上下文另有明确说明，否则应包括“在…之中”及“在…之上”。再者，标题或副标题可在说明书中使用以方便读者，其不应影响本发明的范围。此外，在本说明书中使用的一些术语被更具体地定义于下。

定义

在本说明书中使用的术语一般而言具有在技术中、本发明上下文内及各术语被使用的特定上下文中的通常意义。用来描述本发明的某些术语将于以下或在本说明书别处中讨论，以提供从业者对于本发明叙述的另外导引。为方便起见，某些术语可被突出显示，例如使用斜体字和/或引号。使用突出显示并不影响术语的范围及含义；无论该术语是否被突出显示，其范围及含义在相同上下文中是相同的。应该理解的是，相同的事物可以一种以上的方式叙述。因此，替代的语言及同义词可用于本文中所讨论的任何一个或多个术语，一个术语无论是否在本文中阐述或讨论，其均未赋予任何特殊意义。提供某些术语的同义词，一个或多个同义词的叙述并不排除其它同义词的使用。在本说明书中任一处使用的实施例，包括本文所讨论的任何术语的例子，均仅用以说明，因而绝不限制本发明或任何例示性术语的范围及意义。同样地，本发明并不限于在本说明书中所给予的各种具体实例。

除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语均具有如所属技术领域中具有通常知识者所通常理解的相同含义。如有冲突，应以本文件包括的定义为准。

在本文中，“大约”、“约”或“近乎”一般应表示在给定数值或范围的20％之内，优选为10％之内，且更优选为5％之内。本文中所给出的数值数量是约数，表示即使未明确指出，也可推定其隐含了术语“大约”、“约”或“近乎”。

术语“治疗”是指施予有效量的治疗药剂至所需主体。此主体可被保健专家根据任何适当诊断方法的结果来鉴定。

“有效量”是指在受治疗主体上赋予治疗效果所需要的活性化合物的量。如本领域的技术人员所认知，有效剂量会因为以下情况而有所变化，包括施药途径、赋形剂的使用以及与其他治疗性处理共同使用的可能性。

由美国卫生与公众服务部食品和药物管理局公告的“产业及审查人员在治疗成人健康志愿者临床试验评估安全起始剂量的基准”(guidanceforindustryandreviewersestimatingthesafestartingdoseinclinicaltrialsfortherapeuticsinadulthealthyvolunteers)揭示“人类等效剂量”可通过下列公式计算获得：

hed＝动物剂量(mg/kg)×(动物重量(kg)/人类重量(kg))^0.33

在本文中，当数字或范围被引用，本领域的技术人员将会理解，其意图包括用于本发明相关特定领域的适当、合理的范围。

就约0.2-1000mg而言，其意指在如部分发明中所特别揭示的范围内的所有十分之一及整数单位数量。因此，0.2、0.3、0.4和1、2、3、4…999.7、999.8、999.9和1000单位数量均包括为本发明的具体实例。

关于局部使用，该剂量可根据伤口开口的大小来计算。通常可制备特定浓度的药物溶液并依据伤口的大小施用一定量的药物。在下文所揭示的小鼠模型实施例中，剂量为0.2mg/kg，其等于每只小鼠为5μg，并等于每平方厘米伤口面积10μg。该伤口约为0.5cm²。因此，在一个具体实例中，该剂量在每平方厘米伤口面积0.1μg至100mg的范围。

tem1(seqidno:3；全长)代表肿瘤内皮标志物1。

tem1d3(seqidno:2)代表tem1结构域3。编码tem1d3的dna序列为seqidno:1。本发明关于重组tem1d3(rtem1d3)单独作为血管生成因子及可促进皮肤伤口愈合的发现。

tem1d1-4(seqidno:4)代表tem1结构域1至结构域4。

方法和材料

rtem1d1-4及rtem1d3的制备。为了制备rtem1d1-4(其由凝集素样结构域、寿司样结构域、egf样重复序列(egf-likerepeat)和粘蛋白样结构域所组成)，将含有人类tem1上述结构域的psectaq2-a载体(invitrogen)在胚胎肾脏hek293蛋白表达系统中用于表达及分泌rtem1d1-4。使用镍螯合sepharose柱(amershampharmaciabiotech)，将rtem1d1-4于条件培养液(conditionedmedium)中进行纯化。rtem1d1-4的纯度通过考马斯蓝(coomassieblue)染色及蛋白免疫印迹法评估。该rtem1d1-4由多肽(seqidno:3的trp²¹-gln⁶⁸¹)构成。为了制备rtem1d3，将tem1基因的egf样结构域构建至ppiczα-a载体(invitrogen)中。将构建好的载体转染到毕氏酵母菌(pichiapastoris)，并将重组rtem1d3从发酵培养液中纯化。rtem1d3的纯度通过考马斯蓝染色及蛋白免疫印迹法评估。该rtem1d3由多肽(seqidno:3的cys²³⁵-cys³⁵⁰)构成。

内皮细胞增生、迁移及管腔形成。为了评估rtem1d1-4或rtem1d3刺激人类脐静脉内皮细胞(huvec)增生的能力，根据制造商的说明(roche)使用四唑鎓盐wst-1(4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2h-5-四唑并]-1,3-苯二磺酸酯)。以不同浓度的rtem1d1-4或rtem1d3处理huvec达48小时。添加wst-1至各小孔，并于波长450nm下测量吸光度。使用具有6.5-mm直径聚碳酸酯滤器(8-μm孔径)的transwell(corningcostarcorp.)测量huvec迁移。将不同浓度的rtem1d1-4或rtem1d3置于下部小孔中，以1×10⁵的密度接种huvec至各上部小孔中(含1％fbs的m199培养液)，并于37℃下使其迁移4小时。以刘氏染色法将细胞染色，在光学显微镜(olympus)下计数总迁移的细胞。为了分析管腔形成能力，将huvec以1×10⁵/ml的密度再悬浮于含4％fbs的m199中。将以各种浓度的rtem1d1-4或rtem1d3处理的细胞悬浮液加入μ-slideangiogenesis(integratedbiodiagnostics)的小孔中，其含有生长因子减少的matrigel(bdbiosciences)。以olympus显微镜拍摄微血管样构造。在2-巯基乙醇存在下通过加热将rtem1d3灭活。

皮肤伤口愈合分析。于第0天将c57bl/6雄性小鼠(8-12周龄；体重25±2g)产生7mm直径的背部伤口。将10微升的pbs或溶于pbs的rtem1d3(0.2mg/kg/小鼠)直接施用于伤口区域，每日一次，第1天至第7天，连续7天。在第1、3、5及7天分析伤口闭合率。

以免疫荧光染色法测量伤口的血管生成。于第0天将c57bl/6雄性小鼠(8-12周龄)产生7mm直径的背部伤口。将10μl的pbs或rtem1d3(0.2mg/kg/小鼠)直接施用于伤口区域，每日一次，再连续4天。由pbs或rtem1d3处理的小鼠获得皮肤伤口切片，通过大鼠抗小鼠cd31抗体(bdbioscience)进行cd31染色，且使用imagej软件分析在伤口肉芽组织的cd31的荧光强度。

角质细胞增生及迁移。根据制造商的说明(roche)使用四唑鎓盐wst-1(4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2h-5-四唑并]-1,3-苯二磺酸酯)检测rtem1d1-4在hacat增生活性上的影响。以不同浓度的rtem1d1-4处理hacat细胞48小时。将wst-1加入各小孔，并于波长450nm下测量吸光度。以transwell系统(8-μm孔径)评估hacat细胞的迁移能力，该hacat细胞被接种于上部腔室中，并被吸引至含rtem1d1-4的下部腔室。以5×10⁴的密度将hacat细胞接种至各上部小孔中(含5％fbs的dmem培养液)，并于37℃下使其迁移16小时。以刘氏染色法将细胞染色，在光学显微镜(olympus)下计数总迁移的细胞。

统计分析。使用以邦弗朗尼(bonferroni)法事后检验的单因子变异数分析(one-wayanova)及参数非成对t检验(unpairedttest)分析统计显著性。使用以邦弗朗尼法事后检验的双因子变异数分析(two-wayanova)比较两组以上组别之间的差异。使用对数排序检验(log-ranktest)分析生存数据。p值<0.05被认为是具有统计显著性。

实施例

在不意图限制本发明的范围的条件下，下文提供根据本发明具体实例的例示性的仪器、装置、方法及其相关结果。需要说明的是，标题或副标题可用于实施例中以方便读者，其不应限制本发明的范围。此外，本文提出并揭示某些理论；然而，无论其对或错，均不应限制本发明的范围，只要该发明是根据本发明实施而不考虑任何特定理论或作用流程。

实施例1

rtem1d1-4及rtem1d3增强内皮细胞增生、迁移及管腔形成

分别以wst-1分析评估rtem1d3及rtem1d1-4对huvec增生的影响。以rtem1d3或rtem1d1-4处理均可增加huvec增生(图1和6)。使用transwell分析huvec的趋化移动性以测试rtem1d1-4和rtem1d3对于huvec迁移的影响。rtem1d3及rtem1d1-4均可依剂量依赖性诱导huvec迁移(图2a-b和7a-b)。在不同浓度的rtem1d3或rtem1d1-4存在下培养6小时后，微血管样构造形成完整网络，且rtem1d3和rtem1d1-4均可明显地在huvec中诱导管腔形成的剂量依赖性反应(图3a-b和图8a-b)。

实施例2

rtem1d3通过增加血管生成加速皮肤伤口闭合

为了测试rtem1d3在小鼠上是否能改善皮肤伤口愈合，在野生型c57bl/6雄性小鼠上形成7mm的背部伤口。24小时后，再局部给予小鼠rtem1d37天，并记录伤口面积。结果显示，在以rtem1d3治疗小鼠后，伤口闭合速率有显著增加(图4)。此外，在rtem1d3治疗后，小鼠的伤口区域中血管生成增加(图5)。这些结果显示，rtem1d3可以是一种血管生成因子，也可以加速皮肤伤口愈合。

实施例3

rtem1d1-4有效地增强人类角质细胞的增生和迁移

图9显示rtem1d1-4刺激人类hacat细胞增生。1％fbs加上rtem1d1-4可显著增加hacat细胞的增生。使用表皮生长因子(egf)作为阳性对照。所显示的数据为平均值±sem(n＝3)。***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的单因子变异数分析。

图10a-b显示rtem1d1-4促进人类hacat细胞的迁移(a，b)。5％fbs加上rtem1d1-4可显著增加hacat细胞的迁移。使用表皮生长因子(egf)作为阳性对照。所显示的数据为平均值±sem(n＝3)。*p<0.05，***p<0.001，以邦弗朗尼法事后检验的单因子变异数分析。

上述所呈现的本发明例示性具体实例的描述仅用于说明及叙述的目的，并非意欲穷尽或限制本发明所揭示的确切形式。依据上述教导的许多修改和变化是可能的。

选择及叙述具体实例及实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用，以便使其他本领域的技术人员能够利用本发明及各个实施例，藉以进行各种修改以适合所预期的特定用途。替代的具体实例在不脱离其精神及范围下对于本发明所属领域中的技术人员将变得明显。因此，本发明的范围是由所附的权利要求所定义，而非本文先前所述的说明及例示性具体实例所定义。

某些参考文献，可包括专利、专利申请及各种出版物，在本发明说明中被引用及讨论。这些参考文献的引用和/或讨论仅仅是用来阐明本发明说明，而并非承认任何此类参考文献为本发明的“先前技术”。在本说明书中所引用及讨论的所有参考文献均以其整体并入本文作参考，正如同每一参考文献个别并入作为参考一般。

序列表

<110>宝血纯化科技股份有限公司

<120>用于促进伤口愈合的组合物

<130>10035-003pct

<150>62199676

<151>2015-07-31

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>348

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<400>1

tgcagccctgacaacgggggctgcgaacacgaatgtgtggaggaggtggatggtcacgtg60

tcctgccgctgcactgagggcttccggctggcagcagacgggcgcagttgcgaggacccc120

tgtgcccaggctccgtgcgagcagcagtgtgagcccggtgggccacaaggctacagctgc180

cactgtcgcctgggtttccggccagcggaggatgatccgcaccgctgtgtggacacagat240

gagtgccagattgccggtgtgtgccagcagatgtgtgtcaactacgttggtggcttcgag300

tgttattgtagcgagggacatgagctggaggctgatggcatcagctgc348

<210>2

<211>116

<212>prt

<213>智人

<400>2

cysserproaspasnglyglycysgluhisglucysvalglugluval

151015

aspglyhisvalsercysargcysthrgluglypheargleualaala

202530

aspglyargsercysgluaspprocysalaglnalaprocysglugln

354045

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505560

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65707580

glucysglnilealaglyvalcysglnglnmetcysvalasntyrval

859095

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100105110

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115

<210>3

<211>757

<212>prt

<213>智人

<400>3

metleuleuargleuleuleualatrpalaalaalaglyprothrleu

151015

glyglnaspprotrpalaalagluproargalaalacysglyproser

202530

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354045

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100105110

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115120125

glnargcysvalalaleuglualaserglygluhisargtrpleuglu

130135140

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180185190

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195200205

alaserleuleucysvallysglnprogluglyglyvalglytrpser

210215220

argalaglyproleucysleuglythrglycysserproaspasngly

225230235240

glycysgluhisglucysvalglugluvalaspglyhisvalsercys

245250255

argcysthrgluglypheargleualaalaaspglyargsercysglu

260265270

aspprocysalaglnalaprocysgluglnglncysgluproglygly

275280285

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290295300

aspaspprohisargcysvalaspthraspglucysglnilealagly

305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

leuaspaspglygluaspglugluaspgluaspglualatrplysala

370375380

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385390395400

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420425430

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435440445

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450455460

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465470475480

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485490495

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515520525

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565570575

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645650655

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660665670

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