羟丙基β‑环糊精组合物及方法与流程

文档序号：14039723阅读：1488来源：国知局

1.相关申请案交叉参考

本申请案主张以下美国临时申请案的权益：于2016年6月3日提出申请的第62/345,721号；于2016年5月3日提出申请的第62/331,385号；于2016年3月29日提出申请的第62/314,765号；于2016年3月15日提出申请的第62/308,736号；于2016年1月8日提出申请的第62/276,728号；于2015年12月4日提出申请的第62/263,599号；于2015年11月2日提出申请的第62/249,876号；于2015年10月23日提出申请的第62/245,974号；于2015年7月6日提出申请的第62/189,114号；于2015年6月12日提出申请的第62/175,075号；及于2015年6月10日提出申请的第62/173,889号，其各自的全部内容皆以引用方式并入本文中。

2.关于由联邦政府发起的研究或开发的声明

本发明在与国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)、卫生与公共服务部的机构(agencyofthedepartmentofhealthandhumanservices)的合作研究与发展协议(cooperativeresearchanddevelopmentagreement)的实施中产生。美国政府对本发明具有某些权利。

3.

背景技术：

c型尼曼-匹克病(niemann-pickdiseasetypec，npc)是由npc1或npc2基因中的体染色体隐性突变引起的溶酶体脂质储存病症。症状通常在围产期开始表现且贯穿生命进展。该病症通常包括神经症状，例如小脑共济失调、发音困难、癫痫、垂直凝视麻痹、运动受损、吞咽困难、精神病发作及进行性失智症，以及诸如肝、脾或肺等其他器官中的全身症状。npc已被描述为细胞胆固醇运输缺陷，但在脑中，亦发生诸如gm2及gm3神经节苷酯等其他脂质的累积(vanier,2010,orphanetjournalofrarediseases，第5卷:16)。由于不同临床表现及疾病过程，npc1疾病通常分为婴儿早期发作(<2岁)、婴儿晚期发作(2至<6岁)、幼年发作(6至<15岁)及青少年/成人发作(>15岁)。

治疗人类的npc的努力集中于受质减少疗法，例如利用(例如)正丁基脱氧野艽霉素(麦格司他(miglustat)，)抑制鞘糖脂合成，或经由清除机制改善整体脂质储存，特定而言胆固醇及鞘糖脂的储存。

已显示2-羟丙基-β-环糊精可缓和npc细胞中的过量胆固醇储存(abi-mosleh,l.等人，proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa,2009，第106卷(46)，第19316-19321页)，此与自细胞的质膜萃取胆固醇的相关环糊精的先前报导一致(rodal,s.k.等人，1999,molecularbiologyofthecell,第10卷，第961-974页)。亦观察到羟丙基β-环糊精在npc的动物模型中具有有益效应。举例而言，据报导包含2-羟丙基-β-环糊精的组合物可逆转npc1剔除小鼠的肝及脑中胆固醇的缺陷型溶酶体运输，且引起与无治疗相比这些突变体的生命延长(liu,b.等人，2009,proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa,第106卷(7)，第2377-2382页；davidson等人，2009,plosone4:e6951)。

在美国、巴西及日本，在同情使用豁免下，已向人类npc患者投与各种羟丙基β-环糊精组合物，个案报告各种体征及症状方面有一些改良。然而，尚未完成用以测定安全性及效能的羟丙基β-环糊精组合物的盲化临床试验(ottinger,e.a.等人，2014,currenttopicsinmedicinalchemistry,第14卷(3)，第330-339页)。由于个案报告中可能的观察者偏差，需要控制临床研究以确认羟丙基β-环糊精提供临床益处。

npc的有效治疗需要自婴儿开始长期鞘内或脑室内投与，且先前用于人类患者中的羟丙基β-环糊精的非经肠级组合物含有使得其不适于长期直接投与婴儿及儿童的脑脊髓液的杂质：丙二醇，认为其具有耳毒性；无羟丙基取代的β-环糊精分子，已知其形成沉淀且具有急性毒性(muller及brauns,1985,internationaljournalofpharmaceutics,第26卷，第77-88页)；及细菌内毒素，其具有高度发炎性。因此，需要纯度较高的羟丙基β-环糊精的医药组合物。

另外，羟丙基β-环糊精的所有现存非经肠级组合物含有具有不同羟丙基取代度的羟丙基β-环糊精物质的复杂混合物。混合物内这些物质的比率在不同供货商之间广泛不同，且甚至在来自单一供货商的各批次间变化。未知这些不同物质如何促进复杂混合物的药理学效应。因此，需要羟丙基β-环糊精的医药组合物，其具有这些物质的更精确界定且精确控制的混合物或指纹。

最后，需要在gmp条件下以商业规模制造适于长期鞘内或脑室内投与、具有低含量的杂质且具有特定及结构上界定的组合物的羟丙基β-环糊精的医药组合物的方法。

4.

技术实现要素：

我们分析了i期临床试验的初始数据，其中具有1型npc疾病的患者通过使用现存非经肠级组合物hpb(roquette)鞘内投与2-羟丙基β-环糊精(“hpbcd”)来治疗。在由nih执行的此非随机化、开放标记、单一中心研究中，hpb是以递增剂量经由腰注射投与患者的未用药队列。在我们的某些分析中，我们还包括了在个别ind下在另一机构处经鞘内hpb治疗的三个患者的数据。

我们的分析确认hpb的鞘内投与在1型npc疾病中提供治疗益处。使用标准聚集结果量度(即npc临床严重程度量表)，观察到与已研究未治疗疾病的自然史的患者的队列中的0/13相比，7/15患者具有稳定或改良疾病。使用由数据的事后分析告知的新复合终点，我们发现11/15研究患者显示稳定或改良疾病，相对于自然史队列中仅4/13具有稳定疾病。

然而，更详细分析显示，尽管hpbcd的鞘内投与改良1型npc疾病的某些体征及症状，但其仅减缓其他体征及症状的进展，且自相矛盾地似乎加速其他症状的进展。具体而言，在接受鞘内hpb的患者中，听力损失似乎加速。我们对于hpb的代表性批次的分析揭示，此非经肠级产物包含具有不同取代度的β-环糊精分子的复杂混合物；未知这些物质中哪种促进各种临床域的所观察到的改良、进展的减缓及进展的加速。

为准备hpbcd将以更频繁的给药直接投与脑脊髓液达较长时间段的临床试验，我们研发了降低以下物质的含量的方法：丙二醇，其是假定耳毒素；无羟丙基取代的β-环糊精分子，已知其形成沉淀；及细菌内毒素，其具有高度发炎性。尽管所述方法成功减少指定杂质，但我们观察到利用氧化铝的吸附层析不论单独使用或与溶剂沉淀组合使用亦改变组成指纹，从而实质上降低具有单一羟丙基取代(ds-1)的β-环糊精分子的量并降低具有2个羟丙基(ds-2)的β-环糊精分子的量。具有低取代度(ds-0，按预期；及ds-1及ds-2，意外)的分子的盛行率的降低增加混合物的平均取代度(dsa)。

尽管存在自hpb的指纹变化，但令人惊奇地，已知参与胆固醇代谢及运输的基因的表达无变化，如通过活体外基因表达剖析实验所评价。此发现将容许通过鞘内或脑室内途径向具有npc疾病的患者的csf投与更高度纯化及组成不同的hpbcd组合物达较长时段、任选地以更频繁的给药、具有治疗效果以及改进的安全性。

因此，在第一方面中，提供在一或多个羟基位置处由羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物，该混合物任选地包括未经取代的β-环糊精分子。该混合物包含总共小于1％的未经取代的β-环糊精(“ds-0”)及经1个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-1”)；总共至少85％的经3个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-3”)、经4个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-4”)、经5个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-5”)及经6个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-6”)；及总共小于1％的经9个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-9”)及经10个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-10”)，其各自如通过电喷雾质谱(electrospraymsspectrum)的峰高度所测定。

在某些实施例中，总共小于0.1％的β-环糊精混合物是ds-0及ds-1。在一些实施例中，总共小于0.01％的β-环糊精混合物是ds-0及ds-1。在一些实施例中，总共至少87％的β-环糊精混合物是ds-3、ds-4、ds-5及ds-6。在一些实施例中，总共至少90％的β-环糊精混合物是ds-3、ds-4、ds-5及ds-6。在一些实施例中，总共小于0.1％的β-环糊精混合物是ds-9及ds-10。在某些实施例中，总共小于0.01％的β-环糊精混合物是ds-9及ds-10。

在另一方面中，混合物包含总共小于1％的未经取代的β-环糊精(“ds-0”)及经1个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-1”)及总共小于1％的经9个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-9”)及经10个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-10”)，其各自如通过电喷雾质谱的峰高度所测定，且混合物具有在0.50至0.80范围内的平均摩尔取代(“ms”)。

在某些实施例中，总共小于0.1％的β-环糊精混合物是ds-0及ds-1。在一些实施例中，总共小于0.01％的β-环糊精混合物是ds-0及ds-1。在一些实施例中，总共小于0.1％的β-环糊精混合物是ds-9及ds-10。在某些实施例中，总共小于0.01％的β-环糊精混合物是ds-9及ds-10。在各个实施例中，ms在0.60至0.70的范围内。在这些实施例中的一些中，ms在0.64至0.68的范围内。在某些实施例中，ms是约0.66至0.67。

在另一方面中，提供医药组合物，该医药组合物包含本文所述β-环糊精混合物及医药上可接受的稀释剂。

在一些实施例中，组合物包含不超过0.5％的丙二醇，如通过美国药典羟丙基β-环糊精专论(usphydroxypropylbetadexmonograph)中所述的hplc方法所测量。在一些实施例中，组合物包含不超过0.01％的丙二醇，如通过美国药典羟丙基β-环糊精专论中所述的hplc方法所测量。在一些实施例中，医药组合物包含不超过5eu的内毒素/克β-环糊精混合物。在具体实施例中，医药组合物包含不超过1.5eu的内毒素/克β-环糊精混合物。在一些实施例中，医药组合物包含不超过1ppm的环氧丙烷，根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。

在典型实施例中，医药组合物适于鞘内或脑室内投与。在一些实施例中，医药组合物具有约300mosm/kg至约450mosm/kg的渗透压。在一些实施例中，组合物包含约10mg/ml至约200mg/ml的β-环糊精混合物。

在另一方面中，医药组合物包含在一或多个羟基位置处经羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物及对于鞘内、脑室内或静脉内投与医药上可接受的稀释剂，该混合物任选地包括未经取代的β-环糊精分子。组合物包含不超过5eu的内毒素/克β-环糊精混合物、不超过0.5％的丙二醇(如通过美国药典羟丙基β-环糊精专论中所述的hplc方法所测量)、及不超过1ppm的环氧丙烷(根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定)。

在一些实施例中，组合物包含不超过1.5eu的内毒素/克β-环糊精混合物。在一些实施例中，组合物包含不超过0.01％的丙二醇，如通过美国药典羟丙基β-环糊精专论中所述的hplc方法所测量。在某些实施例中，混合物包含总共小于3％的未经取代的β-环糊精(“ds-0”)、经1个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-1”)及经2个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-2”)；总共至少65％的经5个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-5”)、经6个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-6”)及经7个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-7”)；及总共小于3％的经9个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-9”)及经10个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-10”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。

在另一方面中，提供治疗c型尼曼-匹克病的方法，该方法包括向有需要的患者投与治疗有效量的医药组合物。

在典型实施例中，组合物是经鞘内或通过脑室内投与来投与。在一些实施例中，该方法包括向患者投与约300mg至约2000mgβ-环糊精混合物。在某些实施例中，组合物是每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次或每三个月一次投与。在某些实施例中，该方法包括每两周一次向患者投与约900mg至约1800mgβ-环糊精混合物。在某些实施例中，该方法包括每两周一次向患者投与约900mgβ-环糊精混合物。

在一些实施例中，该方法包括投与足以调节脑脊髓液中以下中的一或多者的含量的量的β-环糊精混合物：τ蛋白、类淀粉肽、神经丝微蛋白(nfl)、胶质原纤维酸性蛋白(gfap)、固醇、氧化固醇、几丁三糖酶活性、钙结合蛋白、溶酶体相关膜蛋白1(lamp-1)、gm2或gm3神经节苷酯、神经鞘胺醇及神经鞘胺醇-1-磷酸盐(s1p)。

在一些实施例中，该方法包括投与足以调节血浆中以下中的一或多种的含量的量的β-环糊精混合物：7-酮胆固醇、7β-羟基胆固醇、24s-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇及胆甾烷-3β,5α,6β-三醇。

在一些实施例中，该方法包括投与足以调节尿液中以下中的一或多种的含量的量的β-环糊精混合物：3β-磺氧基-7β-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-ca)、甘氨酸结合的3β-磺氧基-7β-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-cg)及牛磺酸结合的3β-磺氧基-7β-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-ct)。

在一些实施例中，该方法包括投与足以维持或降低选自以下的npc严重程度量表的一或多个域评分的量的β-环糊精混合物：活动、精细动作技能、认知、言语、吞咽、眼运动、记忆力、听力及癫痫。

在另一方面中，提供制备β-环糊精混合物的方法，其包括利用氧化铝上的吸附层析处理hbp。

在一些实施例中，该方法包括氧化铝上的吸附层析与溶剂沉淀的组合。在一些实施例中，溶剂沉淀使用水与丙酮作为沉淀剂进行。在其他实施例中，溶剂沉淀使用甲醇与丙酮作为沉淀剂进行。

在另一方面中，在一或多个羟基位置处经羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物通过用氧化铝上的吸附层析与溶剂沉淀的组合处理hbp制得，该混合物任选地包括未经取代的β-环糊精分子。

在又一方面中，提供使在一或多个羟基位置处经羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物合格用于供鞘内或脑室内投与的医药组合物的方法，该混合物任选地包括未经取代的β-环糊精分子。该方法包括(a)实施混合物的电喷雾质谱(ms)分析；(b)测量峰高度；及(c)基于峰高度计算整个混合物中每一β-环糊精物质的百分比。如果其中混合物包含总共小于1％的ds-0及ds-1；总共至少85％的ds-3、ds-4、ds-5及ds-6；及总共小于1％的ds-9及ds-10，那么该混合物对于使用来说是合格的——亦即具有足以使用的品质。

在另一方面中，本发明提供包含未经取代的β-环糊精分子及在一或多个羟基位置处经羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物作为医药活性成份的医药组合物，其中该混合物具有每个β-环糊精约3至约7的羟丙基平均数(“dsa”)。在较佳实施例中，医药组合物包含不超过0.5％的丙二醇、不超过1.5eu的内毒素/克β-环糊精混合物，且不超过1％的混合物未经羟丙基取代(“ds-0”)。在各个较佳实施例中，β-环糊精混合物的平均摩尔取代(ms)在约0.58至约0.68范围内(dsa在约4.06至4.76范围内)。在这些较佳实施例中的某些中，混合物的ms为0.58至0.68(dsa为4.06至4.76)，且在一些实施例中ms为约0.63。在各个较佳实施例中，混合物的平均摩尔取代(ms)在约0.65至约0.68范围内(dsa4.6-4.7)，且在一些实施例中，平均摩尔取代为约0.67。

在一些实施例中，混合物中的β-环糊精由以下结构的葡萄糖单元组成：

其中r¹、r²及r³在每次出现时皆独立地是-h或-hp，其中hp包含一或多个羟丙基。

在一些实施例中，每个β-环糊精中hp的平均出现次数是约3至约7。

在一些实施例中，组合的r¹及r²的总出现次数的至少15％是hp。

在一些实施例中，r³的出现次数的至少30％是hp。

在一些实施例中，总共至少70％的β-环糊精具有每个β-环糊精约4至约6的hp的平均出现次数。

在一些实施例中，dsa是约3至约4。在一些实施例中，dsa是3.3±0.3。在一些实施例中，dsa是3.7±0.3。

在一些实施例中，dsa是约3.5至约4.5。在一些实施例中，dsa是3.8±0.3。在一些实施例中，dsa是4.2±0.3。

在一些实施例中，dsa是约4至约5。在一些实施例中，dsa是4.3±0.3。在一些实施例中，dsa是4.7±0.3。

在一些实施例中，dsa是约4.5至约5.5。在一些实施例中，dsa是4.8±0.3。在一些实施例中，dsa是5.2±0.3。

在一些实施例中，dsa是约5至约6。在一些实施例中，dsa是5.3±0.3。在一些实施例中，dsa是5.7±0.3。

在一些实施例中，dsa是约5.5至约6.5。在一些实施例中，dsa是5.8±0.3。在一些实施例中，dsa是6.2±0.3。

在一些实施例中，dsa是约6至约7。在一些实施例中，dsa是6.3±0.3。在一些实施例中，dsa是6.7±0.3。

在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±1的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±1内的ds。

在一些实施例中，羟丙基在β-环糊精的羟基位置处作为结构[ch2ch(ch3)o]nh的羟丙基链取代，其中n≥1且每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是约3至约7。在一些实施例中，至少70％的羟丙基链具有n＝1。在一些实施例中，小于30％的羟丙基链具有n＝2。在一些实施例中，小于10％的羟丙基链具有n>2。在一些实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是约4至约6。在一些实施例中，总共至少70％的β-环糊精具有每个β-环糊精约4至约6的羟丙基链的平均数。

在一些实施例中，本文公开的医药组合物含有小于约10国际单位(iu)、例如小于约6iu、小于约3iu或小于约1.5iu的内毒素/克医药活性成份。内毒素的含量通过鲎变形细胞溶解物测试来测定。

在一些实施例中，医药活性成份含有小于约2重量％、例如小于约1重量％的未经取代的β-环糊精。

在一些实施例中，医药活性成份含有小于约0.5重量％、例如小于约0.2重量％的丙二醇或丙二醇寡聚物。

在一些实施例中，医药活性成份含有小于约1ppm的环氧丙烷。

在一些实施例中，医药组合物包含医药活性成份，其中于室温下在约24小时后通过uv光谱法测量时，医药活性成份于1ml蒸馏水中的20％(w/v)溶液溶解至少2mg(例如至少3mg、至少4mg或至少5mg)未酯化胆固醇。

在一些实施例中，医药组合物展现较cyclo低的耳毒性。在一些实施例中，耳毒性通过豪斯耳科研究中心-柯氏器官1(houseearinstitute-organofcorti1)(hei-oc1)细胞中的毒性活体外测定。在一些实施例中，耳毒性通过个体(例如小鼠、大鼠、猫、狗或人类)中的脑干听性诱发反应(baer)测试活体内测定。

在一些实施例中，医药组合物适于鞘内或脑室内投与。

在一些实施例中，医药组合物具有约300mosm/kg至约450mosm/kg的渗透压。

在一些实施例中，医药组合物包含约10mg/ml至约200mg/ml医药活性成份。

在一些实施例中，医药组合物的单一医药活性成份通过纯化hbp、hp、cyclo或w7hppharma获得。在某些实施例中，医药组合物的单一医药活性成份通过纯化hbp获得。在某些实施例中，医药组合物的单一医药活性成份通过纯化cyclo获得。在一些实施例中，纯化包括亲水或疏水相互作用或亲和力纯化且可涉及层析方法，例如通过hplc或凝胶层析纯化。

本公开内容亦提供治疗c型尼曼-匹克病的方法，其包括通过(例如)鞘内或脑室内投与向有需要的个体投与治疗有效量的如本文所述医药组合物。在一些实施例中，该方法包括向患者投与约300mg至约3000mg医药活性成份。在一些实施例中，投与是每周、每两周、每三周、每月、每两个月或每三个月进行。举例而言，该方法可包括每两周向个体投与约600mg至约1800mg医药活性成份。

在一些实施例中，该方法包括投与足以调节脑脊髓液中以下中的一或多者的含量的量的医药活性成份：τ蛋白、类淀粉肽、神经丝微蛋白(nfl)、胶质原纤维酸性蛋白(gfap)、固醇、氧化固醇、几丁三糖酶活性、钙结合蛋白、溶酶体相关膜蛋白1(lamp-1)、gm2或gm3神经节苷酯、神经鞘胺醇及神经鞘胺醇-1-磷酸盐(s1p)。

在一些实施例中，该方法包括投与足以调节血浆中以下中的一或多种的含量的量的医药活性成份：7-酮胆固醇、7-羟基胆固醇、24s-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇及胆甾烷-3β,5α,6β-三醇。

在一些实施例中，该方法包括投与足以调节尿液中以下中的一或多种的含量的量的医药活性成份：3-磺氧基-7-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-ca)、甘氨酸结合的3-磺氧基-7-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-cg)及牛磺酸结合的3-磺氧基-7-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-ct)。

在一些实施例中，该方法进一步包括维持或降低选自以下的npc严重程度量表的一或多个域评分：活动、精细动作技能、认知、言语、吞咽、眼运动、记忆力、听力及癫痫。

5.附图说明

图1图解说明促成根据yanjanin等人，“linearclinicalprogression,independentofageofonset,inniemann–pickdisease,typec”,am.j.med.genet.partb153b:132-140(2010)的标准npc临床严重程度量表的临床域。

图2概述实例1中所述i期临床试验的初始分析的结果。

图3概述实例1中所述i期临床试验的其他分析。

图4概述使用自基线的变化的i期临床试验数据的分析。

图5概述使用整体npc评分的i期临床试验的早期结果。

图6概述去除听力影响的i期临床试验的早期结果。

图7概述促使新颖“npc复合”终点或严重程度评分的临床域。

图8概述使用新颖npc复合终点的i期临床试验的早期结果。

图9绘示使用cd-筛选方法的代表性hplc层析图。

图10绘示在cd-筛选方法中使用不同溶剂的比较hplc层析图。上迹线：甲醇；下迹线：乙腈。

图11绘示使用cd-筛选管柱的具有不同取代度(ds)的羟丙基β-环糊精的质谱萃取离子层析图。

图12绘示使用lichrospherec18反相管柱的代表性hplc层析图。

图13绘示在lichrospherec18反相层析方法中使用不同溶剂的比较hplc层析图。上迹线：甲醇；下迹线：乙腈。

图14绘示使用lichrospherec18管柱的具有不同取代度(ds)的羟丙基β-环糊精的质谱萃取离子层析图。

图15绘示在hilic管柱中使用不同溶剂的比较hplc层析图。上迹线：在水中呈梯度的79％乙腈(79％acetonitrileinwatergradient)；下迹线：75％乙腈。

图16绘示使用hilic管柱的具有不同取代度(ds)的羟丙基β-环糊精的质谱萃取离子层析图。

图17绘示使用硅胶管柱的代表性hplc层析图。

图18绘示使用硅胶管柱的具有不同取代度(ds)的羟丙基β-环糊精的质谱萃取离子层析图。

图19显示商业kleptose(roquette，批次e0223)(上迹线)及在通过与d-柠檬烯复合纯化后(下迹线)的重迭hplc迹线。x轴显示滞留时间(分钟)。

图20显示与商业kleptose(roquette，批次e0223)相比在使用水/丙酮混合物溶剂沉淀后获得的试样的hplc迹线(上迹线)。

图21显示商业kleptose(roquette，批次e0223)(上迹线)及在通过树脂及木炭处理纯化后(下迹线)的重迭hplc迹线。x轴显示滞留时间(分钟)。

图22显示商业kleptose(roquette，批次e0223)(上迹线)及在通过氧化铝澄清纯化后的重迭hplc迹线。下迹线显示在氧化铝澄清后的纯化滤液的数据；中间迹线显示在氧化铝澄清后纯化第一次冲洗的数据。x轴显示滞留时间(分钟)。

图23显示自hpb的氧化铝层析获得的级分a至h(排除e)中的每一者的比较hplc迹线。级分a至h分别对应于试样5.4.3.2.2a至5.4.3.2.2h(排除e)。x轴显示滞留时间(分钟)。

图24显示自通过kleptose的氧化铝层析纯化收集的级分a至h中的每一者的杂质含量的百分比的图。x轴上的a至h分别对应于试样5.4.3.2.2a至5.4.3.2.2h。y轴显示杂质含量％。pg％＝丙二醇％(对角线条)；全部其他杂质％＝总环糊精相关的杂质％(黑色条)；bcd％＝未经取代的β-环糊精％(中空条)；hpbcdds-1％＝经单取代的β-环糊精％(反对角线条)。

图25绘示鉴别丙二醇(欲测量的杂质)及乙二醇(内标准品)的kleptose的示例性气相层析图。x轴显示时间(分钟)；y轴显示反应。

图26绘示丙二醇衍生物的示例性气相层析图。x轴显示时间(分钟)；y轴显示反应(毫伏)。

图27绘示用以测定气相层析试样中丙二醇浓度的校正图。pg/eg＝如所指示丙二醇对乙二醇的比率。

图28绘示使用欧洲药典(europeanpharmacopeial)方法的kleptose(dsa为4.1)的示例性¹hnmr谱。

图29提供第一实验室的电喷雾ms谱数据，其中图29a显示hpb谱且图29b显示cyclo^tm的谱。向谱添加数字以鉴别每一峰中的羟丙基部分的数目。

图30提供第二实验室的电喷雾ms数据，其中图30a显示hpb的谱且图30b显示cyclo^tm的谱。

图31比较由两个不同实验室实施的hpb的三个不同批次的电喷雾ms数据。

图32提供使用与用于产生图31中所示kleptose数据相同的条件的由两个不同实验室实施的cyclo^tm的两个不同批次的电喷雾ms谱。

图33显示电喷雾ms谱，其中与图29至32相比，y轴扩展以显示1090m/z与1230m/z之间的峰。图33a是自cyclo^tm获得的谱。图33b是自hpb获得的谱。

图34提供进一步比较hpb与cyclo^tm之间的差异的电喷雾ms数据，其中图34a显示hpb谱且图34b显示cyclo^tm的谱。向谱添加数字以鉴别每一峰中的羟丙基部分的数目。

图35提供995m/z与1095m/z之间的hpb与cyclo^tm之间的额外ms谱差异，其中图35a显示hpb谱且图35b显示cyclo^tm的谱。

图36提供显示利用氧化铝吸附的纯化对取代指纹的影响的电喷雾ms数据。图36a显示hpb起始材料的谱且图36b提供批次cyl-4063的谱，该批次通过氧化铝上的吸附层析与溶剂沉淀(水-丙酮)的组合来纯化。

图37显示经一系列hpb浓度(0.1mm至10mm)处理的gm18453及gm05659细胞中的选择胆固醇稳态相关基因的表达的变化倍数。

图38显示胆固醇稳态基因的亚组中针对npc1突变为纯合的gm18453细胞中的表达的变化倍数，其中对于以下四种不同组合物在处理后表达在统计学上显著不同(p<0.001)：std(hpb“标准”)；ac(通过氧化铝层析的hpb纯化)；sp(通过溶剂沉淀的hpb纯化)；及ap(通过氧化铝层析及溶剂沉淀的hpb纯化)。

图39显示在gm18453细胞分别经通过包括吸附至铝的方法纯化的hpb及一批hpb处理时受影响最显著、通过统计显著性分级的生物路径。

图40显示自一批hpb的制备型cd-筛选层析分离获得的各个级分的层析图，注释示出层析分离的羟丙基β-环糊精物质的取代度。

图41显示hpb、“l”部分、“m”部分及“h”部分的电喷雾ms谱，注释以由羟丙基取代度鉴别信号，其中图41a显示hpb批次e0245；图41b显示“l”部分(仅级分2)；图41c显示“m”部分(级分4-15的汇集)；且图41d显示“h”部分(级分16-24的汇集)。

图42显示10个受用1.0mm“l”、“m”及“h”部分处理npc细胞影响最大的生物路径，以统计显著性递降的次序分级。

图43显示自一批hpb(批次e0245)的制备型铝吸附层析分离获得的各个级分的层析图，注释示出经汇集产生部分“a”-“f”及“k”的用数字表示的级分，且注释示出层析分离的羟丙基β-环糊精物质的取代度。

图44显示在不同纯化方法后hpbcd混合物的层析图，其中图44a显示在方法ii-ix后纯化hpbcd混合物的层析图，且图44b显示在方法x及xi后纯化hpbcd混合物的层析图。

图45概述针对18个月时npci期临床试验数据执行的分析。

图46显示18个月时i期临床试验数据的年变化率。

图47显示18个月时i期临床试验数据自基线的平均变化。

图48显示18个月时i期临床试验数据的反应者分析。

图49显示治疗对听力的影响。

图50概述治疗对听力的影响。

6.具体实施方式

6.1.实验观察

如下文实例1中详细阐述，我们分析了由nih执行的i期临床试验的初始数据，其中具有1型npc疾病的患者通过使用现存非经肠级组合物hpb(roquette)鞘内投与2-羟丙基β-环糊精(“hpbcd”)来治疗。在此非随机化、开放标记、单一中心研究中，hpb是以递增剂量经由腰注射投与患者的未用药队列。在我们的某些分析中，我们还包括了在个别ind下在另一机构处经鞘内hpb治疗的三个患者的数据。

我们的分析确认hpb的鞘内投与在1型npc疾病中提供治疗益处。使用标准聚集结果量度(即npc临床严重程度量表)(参见yanjanin等人，“linearclinicalprogression,independentofageofonset,inniemann–pickdisease,typec,”am.j.med.genet.partb153b:132-140(2010)；亦参见本文中的图1及表1)，观察到与已研究未治疗疾病的自然史的患者的队列中的0/13相比，7/15患者具有稳定或改良疾病(参见图5)。使用由数据的事后分析告知的新复合终点(图7)，我们发现11/15研究患者显示稳定或改良疾病，相对于自然史队列中仅4/13具有稳定疾病(参见图8)。在我们的某些分析中，我们使用了去除听力及听性脑干反应(abr)的npc临床严重程度评分。

然而，更详细分析显示，尽管hpbcd的鞘内投与改良1型npc疾病的某些体征及症状，但其仅减缓其他体征及症状的进展，且自相矛盾地似乎加速其他症状的进展。具体而言，在接受鞘内hpb的患者中，听力损失似乎加速(参见例如图2、3、4)。

如下文实例3中详细阐述，我们通过层析方法分析hpb的代表性批次。这些分析揭示，此非经肠级产物包含具有不同取代度的β-环糊精分子的复杂混合物(参见例如图11、14、16、18)；未知这些物质中哪种促进各种临床域的所观察到的改良、进展的减缓及进展的加速。

实例5中所述使用电喷雾质谱的其他分析表明，与不同市售羟丙基β-环糊精组合物cyclo^tm的取代指纹相比，实例1中所述的i期临床试验中所用的羟丙基β-环糊精组合物hpb的取代指纹存在显著差异。我们发现hpb具有取代指纹的低批次间变化及低含量的杂质(尤其丙二醇)。相比之下，我们发现cyclo^tm展现其取代指纹的高批次间变化及显著较高含量的丙二醇(一种假定耳毒素)。

为准备hpbcd将以更频繁的给药直接投与脑脊髓液达较长时间段的临床试验，我们研发了降低以下物质的含量的方法：丙二醇，其是假定耳毒素；无羟丙基取代的β-环糊精分子，已知其形成沉淀；及细菌内毒素，其具有高度发炎性，如实例6及7中所述。尽管所述方法成功减少指定杂质，但我们观察到利用氧化铝的吸附层析不论单独使用或与溶剂沉淀组合使用亦改变组成指纹，从而实质上降低具有单一羟丙基取代(ds-1)的β-环糊精分子的量并降低具有两个取代(ds-2)的β-环糊精分子的量(参见实例7；表20)。具有低取代度(ds-0，按预期；及ds-1及ds-2，意外)的分子的盛行率的降低增加混合物的平均取代度(dsa)。

如实例8中详述及图35-38中概述，使用吸附至铝进一步纯化的hpb及一批hpb的基因表达剖析实验进一步表明，针对npc1突变为纯合的细胞上的羟丙基β-环糊精混合物的活性是由具有不同羟丙基取代度的物质单独贡献的活性的复合物。尽管与hpb相比组成指纹变化，但令人惊奇地，已知参与胆固醇代谢及运输的基因的表达无变化。此发现将容许通过鞘内或脑室内途径向具有npc疾病的患者的csf投与新颖的更高度纯化及组成不同的hpbcd组合物达较长时段、具有治疗效果以及增加的安全性。

6.2.医药组合物

本发明提供包含在一或多个羟基位置处经羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物作为医药活性成份的医药组合物，该混合物任选地包括未经取代的β-环糊精分子。

6.2.1.医药活性成份

医药活性成份是在一或多个羟基位置处经羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物，该混合物任选地包括未经取代的β-环糊精分子。在本公开内容中，术语“医药活性成份”与“活性医药成份”同义使用。

6.2.1.1.平均取代度

如本文所用的“在一或多个羟基位置处经羟丙基取代”是指用羟丙基或羟丙基寡聚物置换β-环糊精分子的一或多个羟基的氢。例如，“在一或多个羟基位置处经羟丙基取代”可指在β-环糊精分子上的一或多个o-h键内插入一或多个—ch2ch(ch3)o—取代基，从而产生一或多个醚键。

β-环糊精的混合物中每脱水葡萄糖单元的羟丙基的数目是“摩尔取代”或“ms”，且根据关于羟丙基β-环糊精的美国药典专论(uspnf2015)(“美国药典羟丙基β-环糊精专论”)中阐述的程序测定，该专论的内容以引用方式整体并入本文中。在本公开内容中，术语“平均摩尔取代”或“msa”与在美国药典羟丙基β-环糊精专论中使用的术语“ms”同义使用，且术语“葡萄糖单元”与在美国药典羟丙基β-环糊精专论中使用的术语“脱水葡萄糖单元”作为同义词使用。

如本文所用的“取代度”或“ds”是指β-环糊精分子上直接或间接取得的羟丙基的总数目。举例而言，含有各自经1个羟丙基取代的葡萄糖单元的β-环糊精分子具有ds＝7。在另一实例中，七个葡萄糖单元中的仅一个经羟丙基取代且羟丙基自身经另一羟丙基取代的β-环糊精分子(例如，hp单次出现且包含2个羟丙基的β-环糊精)具有ds＝2。

如本文所用的“每个β-环糊精中羟丙基的平均数”(亦称作“平均取代度”、“平均ds”或“dsa”)是指β-环糊精群体中的羟丙基的总数目除以β-环糊精分子的数目。在阐释性实例中，含有各自经1个羟丙基取代的葡萄糖单元的β-环糊精及含有各自经2个羟丙基取代的葡萄糖单元的β-环糊精的相等份数混合物具有dsa＝10.5(ds＝7及ds＝14的相等份数β-环糊精的平均数)。在另一阐释性实例中，33.3％七个葡萄糖单元中的仅一个经羟丙基取代的β-环糊精(即，ds＝1)及66.7％含有各自经1个羟丙基取代的葡萄糖单元的β-环糊精(即，ds＝7)的混合物具有dsa＝5.0。

dsa通过用ms乘以7确定。如本文所用的dsa与在美国药典羟丙基β-环糊精专论中定义的术语“取代度”同义使用。

在一些实施例中，混合物中的β-环糊精由以下结构的葡萄糖单元组成：

其中r¹、r²及r³在每次出现时皆独立地是-h或-hp，其中hp包含一或多个羟丙基。

在一些实施例中，hp包含1个羟丙基。在一些实施例中，hp基本上由1个羟丙基组成。在一些实施例中，hp由1个羟丙基组成。

在一些实施例中，每个β-环糊精中hp的平均出现次数是约3至约7，例如约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约7、约4至约6、约4至约5、约5至约7、约5至约6或约6至约7。

在一些实施例中，r³＝hp的总出现次数大于r¹＝hp或r²＝hp的总出现次数。在某些实施例中，r³＝hp的总出现次数大于r¹＝hp且r²＝hp的总组合出现次数。

在一些实施例中，组合的r¹及r²的总出现次数的至少约5％、例如至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约45％是hp。

在一些实施例中，组合的r¹及r²的总出现次数的不超过约95％、例如不超过约90％、不超过约85％、不超过约80％、不超过约75％、不超过约70％、不超过约65％、不超过约60％、不超过约55％或不超过约50％是hp。

在一些实施例中，作为hp的组合的r¹及r²的百分比在以下范围内：约5％至约95％，例如约10％至约95％、约15％至约95％、约20％至约95％、约25％至约95％、约30％至约95％、约35％至约95％、约40％至约95％、约45％至约95％、约50％至约95％、约55％至约95％、约60％至约95％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％；例如约5％至约90％、约10％至约90％、约15％至约90％、约20％至约90％、约25％至约90％、约30％至约90％、约35％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％、约50％至约90％、约55％至约90％、约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约85％至约90％；例如约5％至约85％、约10％至约85％、约15％至约85％、约20％至约85％、约25％至约85％、约30％至约85％、约35％至约85％、约40％至约85％、约45％至约85％、约50％至约85％、约55％至约85％、约60％至约85％、约65％至约85％、约70％至约85％、约75％至约85％、约80％至约85％；例如约5％至约80％、约10％至约80％、约15％至约80％、约20％至约80％、约25％至约80％、约30％至约80％、约35％至约80％、约40％至约80％、约45％至约80％、约50％至约80％、约55％至约80％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％；例如约5％至约75％、约10％至约75％、约15％至约75％、约20％至约75％、约25％至约75％、约30％至约75％、约35％至约75％、约40％至约75％、约45％至约75％、约50％至约75％、约55％至约75％、约60％至约75％、约65％至约75％、约70％至约75％；例如约5％至约70％、约10％至约70％、约15％至约70％、约20％至约70％、约25％至约70％、约30％至约70％、约35％至约70％、约40％至约70％、约45％至约70％、约50％至约70％、约55％至约70％、约60％至约70％、约65％至约70％；例如约5％至约65％、约10％至约65％、约15％至约65％、约20％至约65％、约25％至约65％、约30％至约65％、约35％至约65％、约40％至约65％、约45％至约65％、约50％至约65％、约55％至约65％、约60％至约65％；例如约5％至约60％、约10％至约60％、约15％至约60％、约20％至约60％、约25％至约60％、约30％至约60％、约35％至约60％、约40％至约60％、约45％至约60％、约50％至约60％、约55％至约60％；例如约5％至约55％、约10％至约55％、约15％至约55％、约20％至约55％、约25％至约55％、约30％至约55％、约35％至约55％、约40％至约55％、约45％至约55％、约50％至约55％；例如约5％至约50％、约10％至约50％、约15％至约50％、约20％至约50％、约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％、约40％至约50％、约45％至约50％；例如约5％至约45％、约10％至约45％、约15％至约45％、约20％至约45％、约25％至约45％、约30％至约45％、约35％至约45％、约40％至约45％；例如约5％至约40％、约10％至约40％、约15％至约40％、约20％至约40％、约25％至约40％、约30％至约40％、约35％至约40％；例如约5％至约35％、约10％至约35％、约15％至约35％、约20％至约35％、约25％至约35％、约30％至约35％；例如约5％至约30％、约10％至约30％、约15％至约30％、约20％至约30％、约25％至约30％；例如约5％至约25％、约10％至约25％、约15％至约25％、约20％至约25％；例如约5％至约20％、约10％至约20％、约15％至约20％；例如约5％至约15％、约10％至约15％；或约5％至约10％。

在一些实施例中，r³的出现次数的至少约5％、例如至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％是hp。

在一些实施例中，r³的出现次数的不超过约95％、例如不超过约90％、不超过约85％、不超过约80％、不超过约75％、不超过约70％、不超过约65％、不超过约60％或不超过约55％是hp。

在一些实施例中，作为hp的r³的出现次数的百分比在以下范围内：约20％至约90％，例如约25％至约90％、约30％至约90％、约35％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％、约50％至约90％、约55％至约90％、约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约85％至约90％、约20％至约85％、约25％至约85％、约30％至约85％、约35％至约85％、约40％至约85％、约45％至约85％、约50％至约85％、约55％至约85％、约60％至约85％、约65％至约85％、约70％至约85％、约75％至约85％、约80％至约85％、约20％至约80％、约25％至约80％、约30％至约80％、约35％至约80％、约40％至约80％、约45％至约80％、约50％至约80％、约55％至约80％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％、约20％至约75％、约25％至约75％、约30％至约75％、约35％至约75％、约40％至约75％、约45％至约75％、约50％至约75％、约55％至约75％、约60％至约75％、约65％至约75％、约70％至约75％、约20％至约70％、约25％至约70％、约30％至约70％、约35％至约70％、约40％至约70％、约45％至约70％、约50％至约70％、约55％至约70％、约60％至约70％、约65％至约70％、约20％至约65％、约25％至约65％、约30％至约65％、约35％至约65％、约40％至约65％、约45％至约65％、约50％至约65％、约55％至约65％、约60％至约65％、约20％至约60％、约25％至约60％、约30％至约60％、约35％至约60％、约40％至约60％、约45％至约60％、约50％至约60％、约55％至约60％、约20％至约55％、约25％至约55％、约30％至约55％、约35％至约55％、约40％至约55％、约45％至约55％、约50％至约55％、约20％至约50％、约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％、约40％至约50％、约45％至约50％、约20％至约45％、约25％至约45％、约30％至约45％、约35％至约45％、约40％至约45％、约5％至约40％、约10％至约40％、约15％至约40％、约20％至约40％、约25％至约40％、约30％至约40％、约35％至约40％、约20％至约35％、约25％至约35％、约30％至约35％、约20％至约30％、约25％至约30％或约20％至约25％。

在一些实施例中，至少约70％、例如至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的β-环糊精总共具有每个β-环糊精约4至约7、例如约4至约6、约4至约5、约5至约7、约5至约6或约6至约7的hp的平均出现次数。

在一些实施例中，总共具有每个β-环糊精约4至约7、例如约4至约6、约4至约5、约5至约7、约5至约6或约6至约7的hp的平均出现次数的β-环糊精的百分比在以下范围内：约50％至约99％，例如约55％至约99％、约60％至约99％、约65％至约99％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％；例如约50％至约97％、例如约55％至约97％、约60％至约97％、约65％至约97％、约70％至约97％、约75％至约97％、约80％至约97％、约85％至约97％、约90％至约97％、约95％至约97％；例如约50％至约95％、约55％至约95％、约60％至约95％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％；例如约50％至约90％、约55％至约90％、约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约85％至约90％；例如约50％至约85％、约55％至约85％、约60％至约85％、约65％至约85％、约70％至约85％、约75％至约85％、约80％至约85％；例如约50％至约80％、约55％至约80％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％；例如约50％至约75％、约55％至约75％、约60％至约75％、约65％至约75％、约70％至约75％；例如约50％至约70％、约55％至约70％、约60％至约70％、约65％至约70％；例如约50％至约65％、约55％至约65％、约60％至约65％；例如约50％至约60％、约55％至约60％；或例如约50％至约55％。

在某些实施例中，本公开内容的医药组合物包含未经取代的β-环糊精分子及在一或多个羟基位置处经羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物作为医药活性成份，其中该混合物具有每个β-环糊精分子约3至约7的羟丙基的平均数(dsa)。

在一些实施例中，dsa是约3至约5，例如约3至约4。在一些实施例中，dsa是3.3±0.3、3.5±0.3或3.7±0.3。在其他实施例中，dsa是3.2±0.2、3.3±0.2、3.4±0.2、3.5±0.2、3.6±0.2、3.7±0.2或3.8±0.2。在其他实施例中，dsa是3.1±0.1、3.2±0.1、3.3±0.1、3.4±0.1、3.5±0.1、3.6±0.1、3.7±0.1、3.8±0.1或3.9±0.1。

在一些实施例中，dsa是约3.5至约5.5，例如约3.5至约4.5。在一些实施例中，dsa是3.8±0.3、4.0±0.3或4.2±0.3。在其他实施例中，dsa是3.7±0.2、3.8±0.2、3.9±0.2、4.0±0.2、4.1±0.2、4.2±0.2或4.3±0.2。在其他实施例中，dsa是3.6±0.1、3.7±0.1、3.8±0.1、3.9±0.1、4.0±0.1、4.1±0.1、4.2±0.1、4.3±0.1或4.4±0.1。

在一些实施例中，dsa是约4至约6，例如约4至约5。在一些实施例中，dsa是4.3±0.3、4.5±0.3或4.7±0.3。在其他实施例中，dsa是4.2±0.2、4.3±0.2、4.4±0.2、4.5±0.2、4.6±0.2、4.7±0.2或4.8±0.2。在其他实施例中，dsa是4.1±0.1、4.2±0.1、4.3±0.1、4.4±0.1、4.5±0.1、4.6±0.1、4.7±0.1、4.8±0.1或4.9±0.1。

在一些实施例中，dsa是约4.5至约6.5，例如约4.5至约5.5。在一些实施例中，dsa是4.8±0.3、5.0±0.3或5.2±0.3。在其他实施例中，dsa是4.7±0.2、4.8±0.2、4.9±0.2、5.0±0.2、5.1±0.2、5.2±0.2或5.3±0.2。在其他实施例中，dsa是4.6±0.1、4.7±0.1、4.8±0.1、4.9±0.1、5.0±0.1、5.1±0.1、5.2±0.1、5.3±0.1或5.4±0.1。

在一些实施例中，dsa是约5至约7，例如约5至约6。在一些实施例中，dsa是5.3±0.3、5.5±0.3或5.7±0.3。在其他实施例中，dsa是5.2±0.2、5.3±0.2、5.4±0.2、5.5±0.2、5.6±0.2、5.7±0.2或5.8±0.2。在其他实施例中，dsa是5.1±0.1、5.2±0.1、5.3±0.1、5.4±0.1、5.5±0.1、5.6±0.1、5.7±0.1、5.8±0.1或5.9±0.1。

在一些实施例中，dsa是约5.5至约6.5。在一些实施例中，dsa是5.8±0.3、6.0±0.3或6.2±0.3。在其他实施例中，dsa是5.7±0.2、5.8±0.2、5.9±0.2、6.0±0.2、6.1±0.2、6.2±0.2或6.3±0.2。在其他实施例中，dsa是5.6±0.1、5.7±0.1、5.8±0.1、5.9±0.1、6.0±0.1、6.1±0.1、6.2±0.1、6.3±0.1或6.4±0.1。

在一些实施例中，dsa是约6至约7。在一些实施例中，dsa是6.3±0.3、6.5±0.3或6.7±0.3。在其他实施例中，dsa是6.2±0.2、6.3±0.2、6.4±0.2、6.5±0.2、6.6±0.2、6.7±0.2或6.8±0.2。在其他实施例中，dsa是6.1±0.1、6.2±0.1、6.3±0.1、6.4±0.1、6.5±0.1、6.6±0.1、6.7±0.1、6.8±0.1或6.9±0.1。

在一些实施例中，dsa是约4.1±15％、约4.2±15％、约4.3±15％、约4.4±15％或约4.5±15％，例如约4.1±10％、约4.2±10％、约4.3±10％、约4.4±10％或约4.5±10％，例如约4.1±5％、约4.2±5％、约4.3±5％、约4.4±5％或约4.5±5％。举例而言，在某些实施例中，dsa是约4.31±10％、约4.32±10％、约4.33±10％、约4.34±10％、约4.35±10％、约4.36±10％或约4.37±10％，例如约4.31±5％、约4.32±5％、约4.33±5％、约4.34±5％、约4.35±5％、约4.36±5％或约4.37±5％。在特定实施例中，dsa是约4.34±10％，例如约4.34±5％。

在一些实施例中，dsa是约4.3±15％、约4.4±15％、约4.5±15％、约4.6±15％或约4.7±15％，例如约4.3±10％、约4.4±10％、约4.5±10％、约4.6±10％或约4.7±10％，例如约4.3±5％、约4.4±5％、约4.5±5％、约4.6±5％或约4.7±5％。举例而言，在某些实施例中，dsa是约4.47±10％、约4.48±10％、约4.49±10％、约4.50±10％、约4.51±10％、约4.52±10％或约4.53±10％，例如约4.47±5％、约4.48±5％、约4.49±5％、约4.50±5％、约4.51±5％、约4.52±5％或约4.53±5％。在特定实施例中，dsa是约4.50±10％，例如约4.50±5％。

在一些实施例中，dsa是约6.1±15％、约6.2±15％、约6.3±15％、约6.4±15％或约6.5±15％，例如约6.1±10％、约6.2±10％、约6.3±10％、约6.4±10％或约6.5±10％，例如约6.1±5％、约6.2±5％、约6.3±5％、约6.4±5％或约6.5±5％。举例而言，在某些实施例中，dsa是约6.34±10％、约6.35±10％、约6.36±10％、约6.37±10％、约6.38±10％、约6.39±10％或约6.40±10％，例如约6.34±5％、约6.35±5％、约6.36±5％、约6.37±5％、约6.38±5％、约6.39±5％或约6.40±5％。在特定实施例中，dsa是约6.37±10％，例如约6.37±5％。

在一些实施例中，dsa是约6.3±15％、约6.4±15％、约6.5±15％、约6.6±15％或约6.7±15％，例如约6.3±10％、约6.4±10％、约6.5±10％、约6.6±10％或约6.7±10％，例如约6.3±5％、约6.4±5％、约6.5±5％、约6.6±5％或约6.7±5％。举例而言，在某些实施例中，dsa是约6.50±10％、约6.51±10％、约6.52±10％、约6.53±10％、约6.54±10％、约6.55±10％或约6.56±10％，例如约6.50±5％、约6.51±5％、约6.52±5％、约6.53±5％、约6.54±5％、约6.55±5％或约6.56±5％。在特定实施例中，dsa是约6.53±10％，例如约6.53±5％。

未经取代的β-环糊精分子及在一或多个羟基位置处经羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物内的取代度的分布可以变化。举例而言，含有各自经1个羟丙基取代的葡萄糖单元的β-环糊精及含有各自经2个羟丙基取代的葡萄糖单元的β-环糊精的相等份数混合物具有dsa＝10.5(ds＝7及ds＝14的相等份数β-环糊精的平均数)。尽管dsa＝10.5，但在此实例中，混合物内无具有ds＝10或ds＝11的β-环糊精。在其他情形下，β-环糊精的混合物内的大多数β-环糊精具有接近dsa的ds。

在本公开内容的一些实施例中，混合物内至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±xσ内的ds，其中σ是标准偏差，且x是1、2或3。举例而言，在一些实施例中，混合物内至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±1σ内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±1σ内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±1σ内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±1σ内的ds。

在一些实施例中，混合物内至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±2σ内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±2σ内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±2σ内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±2σ内的ds。

在一些实施例中，混合物内至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±3σ内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±3σ内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±3σ内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±3σ内的ds。

在一些实施例中，至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±1内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±1内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±1内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±1内的ds。

在一些实施例中，至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±0.8内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±0.8内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±0.8内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±0.8内的ds。

在一些实施例中，至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±0.6内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±0.6内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±0.6内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±0.6内的ds。

在一些实施例中，至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±0.5内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±0.5内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±0.5内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±0.5内的ds。

在一些实施例中，至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±0.4内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±0.4内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±0.4内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±0.4内的ds。

在一些实施例中，至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±0.3内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±0.3内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±0.3内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±0.3内的ds。

在一些实施例中，至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±0.2内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±0.2内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±0.2内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±0.2内的ds。

在一些实施例中，至少约50％、例如至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的β-环糊精具有dsa±0.1内的ds。在一些实施例中，至少70％的β-环糊精具有dsa±0.1内的ds。在一些实施例中，至少90％的β-环糊精具有dsa±0.1内的ds。在一些实施例中，至少95％的β-环糊精具有dsa±0.1内的ds。

在一些实施例中，ms在以下范围内：0.40至0.80，例如0.41至0.79、0.42至0.78、0.43至0.77、0.44至0.76、0.45至0.75、0.46至0.74、0.47至0.73、0.48至0.72、0.49至0.71、0.50至0.70、0.51至0.69、0.52至0.68、0.53至0.67、0.54至0.66、0.55至0.65、0.56至0.64、0.57至0.63、0.58至0.62或0.59至0.61。

在某些实施例中，ms是约0.40、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44、约0.45、约0.46、约0.47、约0.48、约0.49、约0.50、约0.51、约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59、约0.60、约0.61、约0.62、约0.63、约0.64、约0.65、约0.66、约0.67、约0.68、约0.69、约0.70、约0.71、约0.72、约0.73、约0.74、约0.75、约0.76、约0.77、约0.78、约0.79或约0.80。

在某些实施例中，ms是约0.571-0.686(dsa为约4.0至约4.8)。在这些实施例中的一些中，ms在约0.58至约0.68范围内。在当前较佳实施例中，ms在0.58-0.68的范围内。

在各个实施例中，ms是至少约0.55。在某些实施例中，ms是至少约0.56、0.57、0.58、0.59或0.60。在某些实施例中，ms是不超过约0.70。在具体实施例中，ms是不超过约0.69、0.68、0.67、0.66或0.65。

羟丙基可作为单体键合至β-环糊精，或可自身依序键合至一或多个额外羟丙基以形成羟丙基寡聚物，其随后键合至β-环糊精。在一些实施例中，羟丙基在β-环糊精的羟基位置处作为结构-[ch2ch(ch3)o]nh的羟丙基链取代，其中n≥1且每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是约3至约7，例如约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约7、约4至约6、约4至约5、约5至约7、约5至约6或约6至约7。在一些实施例中，n是1、2、3或4。

在一个阐释性实例中，结构-ch2ch(ch3)oh的羟丙基链在羟丙基链中包括1个羟丙基(即，n＝1)。在另一阐释性实例中，结构-[ch2ch(ch3)o]3h的羟丙基链在羟丙基链中包括3个羟丙基(即，n＝3)。

在某些实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是3.3±0.3、3.4±0.3、3.6±0.3或3.8±0.3。在其他实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是4.0±0.3、4.2±0.3、4.4±0.3、4.6±0.3或4.8±0.3。在其他实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是5.0±0.3、5.2±0.3、5.4±0.3、5.6±0.3或5.8±0.3。且在其他实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是6.0±0.3、6.2±0.3、6.4±0.3、6.6±0.3或6.7±0.3。

在一些实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是3.2±0.2、3.3±0.2、3.4±0.2、3.5±0.2、3.6±0.2、3.7±0.2或3.8±0.2。在其他实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是4.0±0.2、4.1±0.2、4.2±0.2、4.3±0.2、4.4±0.2、4.5±0.2、4.6±0.2、4.7±0.2或4.8±0.2。在其他实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是5.0±0.2、5.1±0.2、5.2±0.2、5.3±0.2、5.4±0.2、5.5±0.2、5.6±0.2、5.7±0.2或5.8±0.2。且在其他实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是6.0±0.2、6.1±0.2、6.2±0.2、6.3±0.2、6.4±0.2、6.5±0.2、6.6±0.2、6.7±0.2或6.8±0.2。

在一些实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是3.1±0.1、3.2±0.1、3.3±0.1、3.4±0.1、3.5±0.1、3.6±0.1、3.7±0.1、3.8±0.1或3.9±0.1。在其他实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是4.0±0.1、4.1±0.1、4.2±0.1、4.3±0.1、4.4±0.1、4.5±0.1、4.6±0.1、4.7±0.1、4.8±0.1或4.9±0.1。在其他实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是5.0±0.1、5.1±0.1、5.2±0.1、5.3±0.1、5.4±0.1、5.5±0.1、5.6±0.1、5.7±0.1、5.8±0.1或5.9±0.1。且在其他实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是6.0±0.1、6.1±0.1、6.2±0.1、6.3±0.1、6.4±0.1、6.5±0.1、6.6±0.1、6.7±0.1、6.8±0.1或6.9±0.1。

在一些实施例中，至少约50％、例如约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的羟丙基链具有n＝1。在一些实施例中，至少70％的羟丙基链具有n＝1。在一些实施例中，至少90％的羟丙基链具有n＝1。

在一些实施例中，具有n＝1的羟丙基链的百分比在以下范围内：约50％至约99％，例如约55％至约99％、约60％至约99％、约65％至约99％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％；例如约50％至约97％，例如约55％至约97％、约60％至约97％、约65％至约97％、约70％至约97％、约75％至约97％、约80％至约97％、约85％至约97％、约90％至约97％、约95％至约97％；例如约50％至约95％、约55％至约95％、约60％至约95％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％；例如约50％至约90％、约55％至约90％、约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约85％至约90％；例如约50％至约85％、约55％至约85％、约60％至约85％、约65％至约85％、约70％至约85％、约75％至约85％、约80％至约85％；例如约50％至约80％、约55％至约80％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％；例如约50％至约75％、约55％至约75％、约60％至约75％、约65％至约75％、约70％至约75％；例如约50％至约70％、约55％至约70％、约60％至约70％、约65％至约70％；例如约50％至约65％、约55％至约65％、约60％至约65％；例如约50％至约60％、约55％至约60％；或例如约50％至约55％。

在一些实施例中，小于约50％、例如约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或约3％的羟丙基链具有n＝2。在一些实施例中，小于30％的羟丙基链具有n＝2。在一些实施例中，小于10％的羟丙基链具有n＝2。

在一些实施例中，具有n＝2的羟丙基链的百分比在以下范围内：约5％至约50％，例如约10％至约50％、约15％至约50％、约20％至约50％、约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％、约40％至约50％、约45％至约50％；例如约5％至约45％、约10％至约45％、约15％至约45％、约20％至约45％、约25％至约45％、约30％至约45％、约35％至约45％、约40％至约45％；例如约5％至约40％、约10％至约40％、约15％至约40％、约20％至约40％、约25％至约40％、约30％至约40％、约35％至约40％；例如约5％至约35％、约10％至约35％、约15％至约35％、约20％至约35％、约25％至约35％、约30％至约35％；例如约5％至约30％、约10％至约30％、约15％至约30％、约20％至约30％、约25％至约30％；例如约5％至约25％、约10％至约25％、约15％至约25％、约20％至约25％；例如约5％至约20％、约10％至约20％、约15％至约20％；例如约5％至约15％、约10％至约15％；或约5％至约10％。

在一些实施例中，小于约50％、例如约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或约3％的羟丙基链具有n>2。在一些实施例中，小于10％的羟丙基链具有n>2。

在一些实施例中，具有n>2的羟丙基链的百分比在以下范围内：约5％至约50％，例如约10％至约50％、约15％至约50％、约20％至约50％、约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％、约40％至约50％、约45％至约50％；例如约5％至约45％、约10％至约45％、约15％至约45％、约20％至约45％、约25％至约45％、约30％至约45％、约35％至约45％、约40％至约45％；例如约5％至约40％、约10％至约40％、约15％至约40％、约20％至约40％、约25％至约40％、约30％至约40％、约35％至约40％；例如约5％至约35％、约10％至约35％、约15％至约35％、约20％至约35％、约25％至约35％、约30％至约35％；例如约5％至约30％、约10％至约30％、约15％至约30％、约20％至约30％、约25％至约30％；例如约5％至约25％、约10％至约25％、约15％至约25％、约20％至约25％；例如约5％至约20％、约10％至约20％、约15％至约20％；例如约5％至约15％、约10％至约15％；或例如约5％至约10％。

在一些实施例中，每个β-环糊精中羟丙基链的平均数是约4至约6。在一些实施例中，至少约60％、例如至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约97％的β-环糊精总共具有每个β-环糊精约4至约6的羟丙基链的平均数。在一些实施例中，总共具有每个β-环糊精约4至约6的羟丙基链的平均数的β-环糊精的百分比在以下范围内：约60％至约97％，例如约65％至约97％、约70％至约97％、约75％至约97％、约80％至约97％、约85％至约97％、约90％至约97％；例如约60％至约95％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％；例如约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约85％至约90％；例如约60％至约85％、约65％至约85％、约70％至约85％、约75％至约85％、约80％至约85％；例如约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％；例如约60％至约75％、约65％至约75％、约70％至约75％；例如约60％至约70％、约65％至约70％；或例如约60％至约65％。

6.2.1.2.取代指纹

6.2.1.2.1.ds-0

在典型实施例中，医药活性成份含有小于约2％、例如小于约1.5％、小于约1.4％、小于约1.3％、小于约1.2％、小于约1.1％、小于约1.0％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％、小于约0.2％、小于约0.1％、小于约0.09％、小于约0.08％、小于约0.07％、小于约0.06％或小于约0.05％的未经取代的β-环糊精(“ds-0”；“bcd”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。

在典型实施例中，不超过1％的β-环糊精混合物未经羟丙基取代(bcd)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。

在一些实施例中，医药活性成份中未经取代的β-环糊精的含量在以下范围内：约0.05％至约2％，例如约0.05％至约1.5％、约0.05％至约1.4％、约0.05％至约1.3％、约0.05％至约1.2％、约0.05％至约1.1％、约0.05％至约1.0％、约0.05％至约0.8％、约0.05％至约0.6％、约0.05％至约0.5％、约0.05％至约0.4％、约0.05％至约0.3％、约0.05％至约0.2％、约0.05％至约0.1％、约0.05％至约0.07％、约0.07％至约1.5％、约0.07％至约1.4％、约0.07％至约1.3％、约0.07％至约1.2％、约0.07％至约1.1％、约0.07％至约1.0％、约0.07％至约0.8％、约0.07％至约0.6％、约0.07％至约0.5％、约0.07％至约0.4％、约0.07％至约0.3％、约0.07％至约0.2％、约0.07％至约0.1％、约0.1％至约1.5％、约0.1％至约1.4％、约0.1％至约1.3％、约0.1％至约1.2％、约0.1％至约1.1％、约0.1％至约1.0％、约0.1％至约0.8％、约0.1％至约0.6％、约0.1％至约0.5％、约0.1％至约0.4％、约0.1％至约0.3％、约0.1％至约0.2％、约0.2％至约1.5％、约0.2％至约1.4％、约0.2％至约1.3％、约0.2％至约1.2％、约0.2％至约1.1％、约0.2％至约1.0％、约0.2％至约0.8％、约0.2％至约0.6％、约0.2％至约0.5％、约0.2％至约0.4％、约0.2％至约0.3％、约0.3％至约1.5％、约0.3％至约1.4％、约0.3％至约1.3％、约0.3％至约1.2％、约0.3％至约1.1％、约0.3％至约1.0％、约0.3％至约0.8％、约0.3％至约0.6％、约0.3％至约0.5％、约0.3％至约0.4％、约0.4％至约1.5％、约0.4％至约1.4％、约0.4％至约1.3％、约0.4％至约1.2％、约0.4％至约1.1％、约0.4％至约1.0％、约0.4％至约0.8％、约0.4％至约0.6％、约0.4％至约0.5％、约0.5％至约1.5％、约0.5％至约1.4％、约0.5％至约1.3％、约0.5％至约1.2％、约0.5％至约1.1％、约0.5％至约1.0％、约0.5％至约0.8％、约0.5％至约0.6％、约0.6％至约1.5％、约0.6％至约1.4％、约0.6％至约1.3％、约0.6％至约1.2％、约0.6％至约1.1％、约0.6％至约1.0％、约0.6％至约0.8％、约0.8％至约1.5％、约0.8％至约1.4％、约0.8％至约1.3％、约0.8％至约1.2％、约0.8％至约1.1％、约0.8％至约1.0％、约1.0％至约1.5％、约1.0％至约1.4％、约1.0％至约1.3％、约1.0％至约1.2％、约1.0％至约1.1％、约1.1％至约1.5％、约1.1％至约1.4％、约1.1％至约1.3％、约1.1％至约1.2％、约1.2％至约1.5％、约1.2％至约1.4％、约1.2％至约1.3％、约1.3％至约1.5％、约1.3％至约1.4％或约1.4％至约1.5％。

在各个实施例中，组合物包含不超过约0.01％的bcd、不超过约0.02％的bcd、不超过约0.03％的bcd、不超过约0.04％的bcd或不超过约0.05％的bcd的β-环糊精混合物。

6.2.1.2.2.ds-1

在典型实施例中，小于4％的β-环糊精混合物是经仅1个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-1”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。

在各个实施例中，小于3.9％、小于3.8％、小于3.7％、小于3.6％或小于3.5％的β-环糊精混合物是ds-1。在某些实施例中，医药活性成份包含小于3.5％、3.4％、3.3％、3.2％、3.1％或3.0％的ds-1。在特定实施例中，医药活性成份包含小于2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％或2.0％的ds-1。在一些实施例中，β-环糊精分子的混合物包含小于1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％或1.0％的ds-1。在目前较佳实施例中，医药活性成份包含小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的ds-1、甚至小于约0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％的ds-1。在某些较佳实施例中，组合物包含小于0.03％、甚至低至0.02％的ds-1。

在当前较佳实施例中，组合物包含小于约0.05％的bcd及小于约0.03％的ds-1。

6.2.1.2.3.ds-2

在各个实施例中，β-环糊精混合物具有低百分比的经2个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-2”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。

在各个实施例中，小于3.9％、小于3.8％、小于3.7％、小于3.6％或小于3.5％的β-环糊精混合物是ds-2。在某些实施例中，医药活性成份包含小于3.5％、3.4％、3.3％、3.2％、3.1％或3.0％的ds-2。在特定实施例中，医药活性成份包含小于2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％或2.0％的ds-2。在一些实施例中，β-环糊精分子的混合物包含小于1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％或1.0％的ds-2。在目前较佳实施例中，医药活性成份包含小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的ds-2、甚至小于约0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％的ds-2。在某些较佳实施例中，组合物包含小于0.03％、甚至低至0.02％的ds-2。6.2.1.2.4.ds-3

在典型实施例中，混合物包含作为总混合物的百分比的至少10％具有3个羟丙基取代的β-环糊精分子(“ds-3”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。在各个实施例中，至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％或至少25％的β-环糊精混合物是ds-3。

在各个实施例中，混合物包含作为总混合物的百分比的不超过30％、例如不超过29％、不超过28％、不超过27％、不超过26％、不超过25％、不超过24％、不超过23％、不超过22％、不超过21％、不超过20％、不超过19％、不超过18％、不超过17％、不超过16％或不超过15％的ds-3。

在某些实施例中，整个混合物中ds-3的百分比在以下范围内：10％至30％，例如11％至29％、12％至28％、13％至27％、14％至26％、15％至25％、16％至24％、17％至23％、18％至22％或19％至21％。

在各个实施例中，混合物包含约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％的ds-3。

6.2.1.2.5.ds-4

在典型实施例中，混合物包含作为总混合物的百分比的至少20％具有4个羟丙基取代的β-环糊精分子(“ds-4”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。在各个实施例中，至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％或至少35％的β-环糊精混合物是ds-4。

在各个实施例中，混合物包含作为总混合物的百分比不超过40％、例如不超过39％、不超过38％、不超过37％、不超过36％、不超过35％、不超过34％、不超过33％、不超过32％、不超过31％、不超过30％、不超过29％、不超过28％、不超过27％、不超过26％或不超过25％的ds-4。

在某些实施例中，整个混合物中ds-4的百分比在以下范围内：20％至40％，例如21％至39％、22％至38％、23％至37％、24％至36％、25％至35％、26％至34％、27％至33％、28％至32％或29％至31％。

在各个实施例中，混合物包含约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％或约35％的ds-4。

6.2.1.2.6.ds-5

在典型实施例中，混合物包含作为总混合物的百分比的至少15％具有5个羟丙基取代的β-环糊精分子(“ds-5”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。在各个实施例中，至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％或至少30％的β-环糊精混合物是ds-5。

在各个实施例中，混合物包含作为总混合物的百分比的不超过35％、例如不超过34％、不超过33％、不超过32％、不超过31％、不超过30％、不超过29％、不超过28％、不超过27％、不超过26％、不超过25％、不超过24％、不超过23％、不超过22％、不超过21％或不超过20％的ds-5。

在某些实施例中，整个混合物中ds-5的百分比在以下范围内：15％至35％，例如16％至34％、17％至33％、18％至32％、19％至31％、20％至30％、21％至29％、22％至28％、23％至27％或24％至26％。

在各个实施例中，混合物包含约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％或约30％的ds-5。

6.2.1.2.7.ds-6

在典型实施例中，混合物包含作为总混合物的百分比的至少5％具有6个羟丙基取代的β-环糊精分子(“ds-6”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。在各个实施例中，至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％或至少20％的β-环糊精混合物是ds-6。

在各个实施例中，混合物包含作为总混合物的百分比不超过25％、例如不超过24％、不超过23％、不超过22％、不超过21％、不超过20％、不超过19％、不超过18％、不超过17％、不超过16％、不超过15％、不超过14％、不超过13％、不超过12％、不超过11％或不超过10％的ds-6。

在某些实施例中，整个混合物中ds-6的百分比在以下范围内：5％至25％，例如6％至24％、7％至23％、8％至22％、9％至21％、10％至20％、11％至19％、12％至18％、13％至17％或14％至16％。

在各个实施例中，混合物包含约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％或约17％的ds-6。6.2.1.2.8.ds-7

在典型实施例中，作为总混合物的百分比小于10％的β-环糊精混合物是经7个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-7”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。在各个实施例中，小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的β-环糊精混合物是ds-7。

在某些实施例中，整个混合物中ds-7的百分比在以下范围内：1％至10％、例如2％至9％、3％至8％、4％至7％或5％至6％。

在各个实施例中，混合物包含约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的ds-7。

6.2.1.2.9.ds-8

在典型实施例中，β-环糊精混合物包含作为总混合物的百分比小于2％的经8个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-8”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。在各个实施例中，小于1.5％、小于1.4％、小于1.3％、小于1.2％、小于1.1％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％、小于0.09％、小于0.08％、小于0.07％、小于0.06％、小于0.05％、小于0.04％、小于0.03％、小于0.02％或小于0.01％的β-环糊精是ds-8。

在某些实施例中，整个混合物中ds-8的百分比在以下范围内：0.01％至2％，例如0.02％至1.9％、0.03％至1.8％、0.04％至1.7％、0.05％至1.6％、0.06％至1.5％、0.07％至1.4％、0.08％至1.3％、0.09％至1.2％、0.1％至1.1％、0.2％至1％、0.3％至0.9％、0.4％至0.8％或0.5％至0.7％。

在各个实施例中，混合物包含约1.5％、约1.4％、约1.3％、约1.2％、约1.1％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％或约0.01％的ds-8。

6.2.1.2.10.ds-9

在典型实施例中，作为总混合物的百分比不超过1％的β-环糊精混合物是经9个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-9”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。在各个实施例中，不超过0.9％、不超过0.8％、不超过0.7％、不超过0.6％、不超过0.5％、不超过0.4％、不超过0.3％、不超过0.2％、不超过0.1％、不超过0.09％、不超过0.08％、不超过0.07％、不超过0.06％、不超过0.05％、不超过0.04％、不超过0.03％、不超过0.02％或不超过0.01％的β-环糊精是ds-9。

6.2.1.2.11.ds-10

在典型实施例中，作为总混合物的百分比不超过1％的β-环糊精混合物是经10个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-10”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。在各个实施例中，不超过0.9％、不超过0.8％、不超过0.7％、不超过0.6％、不超过0.5％、不超过0.4％、不超过0.3％、不超过0.2％、不超过0.1％、不超过0.09％、不超过0.08％、不超过0.07％、不超过0.06％、不超过0.05％、不超过0.04％、不超过0.03％、不超过0.02％或不超过0.01％的β-环糊精是ds-10。

6.2.1.2.12.概况

在各个实施例中，β-环糊精混合物含有作为整个混合物的百分比总共至少75％的ds-3、ds-4、ds-5及ds-6。在某些实施例中，混合物中总共至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％的β-环糊精是ds-3、ds-4、ds-5及ds-6。

在各个实施例中，β-环糊精混合物包含作为整个混合物的百分比总共在以下范围内的ds-3、ds-4、ds-5及ds-6：约75％至约98％，例如约76％至约97％、约77％至约96％、约78％至约95％、约79％至约94％、约80％至约93％、约81％至约92％、约82％至约91％、约83％至约90％、约84％至约89％、约85％至约88％或约86％至约87％。

在典型实施例中，β-环糊精混合物包含作为整个混合物的百分比总共至少25％的ds-5及ds-6。在某些实施例中，混合物中总共至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％或至少50％的β-环糊精是ds-5及ds-6。

在各个实施例中，β-环糊精混合物包含作为整个混合物的百分比总共在以下范围内的ds-5及ds-6：约25％至约50％，例如约26％至约49％、约27％至约48％、约28％至约47％、约29％至约46％、约30％至约45％、约31％至约44％、约32％至约43％、约33％至约42％、约34％至约41％、约35％至约40％、约36％至约39％或约37％至约38％。

在各个实施例中，作为整个混合物的百分比具有最大盛行率的β-环糊精物质是ds-4。

6.2.1.3.起始材料

在某些实施例中，本发明阐述医药组合物，其中单一医药活性成份通过纯化一或多种选自以下的羟丙基β-环糊精产物来获得：hbp、hp、cyclo及w7hppharma。

hbp及hp是可自roquettepharma,lestrem,france获得的羟丙基β-环糊精产物。hbp是dsa为约4.3的羟丙基β-环糊精的非经肠级内毒素控制的组合物。hp是具有较hbp高的dsa的羟丙基β-环糊精的内毒素控制的组合物。cyclo是dsa为约6.37的非经肠级羟丙基β环糊精，且可以粉末化或无菌液体形式自sphingobiotechnology,inc.(ctdholdings,inc.的部门，alachua,florida,usa)获得。w7hppharma是dsa为约4.1至约5.1(例如dsa为约4.5)的可自wackerchemieag,münchen,germany获得的医药级羟丙基-β-环糊精。

在阐释性实例中，医药组合物是其中单一医药活性成份通过纯化hbp获得的那种。在某些实施例中，医药组合物是其中单一医药活性成份通过亲水相互作用、例如通过hplc纯化、或通过亲和力纯化(例如亲和力层析)来纯化hbp(roquette)而获得的那种。在各个实施例中，医药活性成份通过本文实例6、7及9中所述程序中的一或多者纯化hbp(roquette)来获得。

在多个实施例中，纯化提供具有增加活性(例如增加的对未酯化胆固醇的亲和力)的hbp的部分或级分。

在其他实施例中，医药组合物是其中单一医药活性成份通过亲水相互作用、例如通过hplc纯化、或通过亲和力纯化(例如亲和力层析)来纯化cyclo(ctd)而获得的那种。在各个实施例中，医药活性成份通过本文实例6、7及9中所述程序中的一或多者利用氧化铝上的吸附层析纯化cyclo来获得。

在一些实施例中，自cyclo(ctd)纯化的医药组合物包含在一或多个羟基位置处经羟丙基取代的β-环糊精分子的混合物及对于鞘内、脑室内或静脉内投与医药上可接受的稀释剂，该混合物任选地包括未经取代的β-环糊精分子。组合物包含不超过5eu的内毒素/克β-环糊精混合物、不超过0.5％的丙二醇(如通过美国药典羟丙基β-环糊精专论中所述的hplc方法所测量)、及不超过1ppm的环氧丙烷(根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定)。

在一些实施例中，自cyclo(ctd)纯化的医药组合物包含不超过1.5eu的内毒素/克β-环糊精混合物。在一些实施例中，组合物包含不超过0.01％的丙二醇，如通过美国药典羟丙基β-环糊精专论中所述的hplc方法所测量。

在某些实施例中，自cyclo(ctd)纯化的医药活性成份包含总共小于5％、例如小于4.5％、小于4％、小于3.5％、小于3％、小于2.5％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.5％或小于0.1％的未经取代的β-环糊精(“ds-0”)、经1个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-1”)及经2个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-2”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。

在某些实施例中，自cyclo(ctd)纯化的医药活性成份包含总共至少50％、例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的经5个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-5”)、经6个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-6”)及经7个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-7”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。

在某些实施例中，自cyclo(ctd)纯化的医药活性成份包含总共小于5％、例如小于4.5％、小于4％、小于3.5％、小于3％、小于2.5％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.5％或小于0.1％的经9个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-9”)及经10个羟丙基取代的β-环糊精(“ds-10”)，如通过电喷雾质谱的峰高度所测定。

在其他实施例中，医药组合物是其中单一医药活性成份通过亲水相互作用、例如通过hplc纯化、或通过亲和力纯化(例如亲和力层析)来纯化w7hp而获得的那种。在各个实施例中，医药活性成份通过本文实例6、7及9中所述程序中的一或多者纯化w7hp来获得。

在某些实施例中，纯化一或多种选自hbp、hp、cyclo及w7hppharma的羟丙基β-环糊精产物包含复合物形成、沉淀及吸附层析中的一或多者。在一些实施例中，纯化包含一种方法，例如吸附层析。在一些实施例中，纯化包含两种或更多种方法，例如沉淀与吸附层析组合。在纯化包含两种或更多种组合使用的方法的情形下，这些方法可以任何次序组合以纯化羟丙基β-环糊精产物。在阐释性实例中，hbp或cyclo可首先经受吸附层析，随后来自层析步骤的一或多个选择级分可经受溶剂沉淀以形成沉淀溶剂系统以实现进一步纯化。在替代实例中，hbp可首先经受溶剂沉淀以形成沉淀溶剂系统，随后沉淀可经受吸附层析以实现进一步纯化。

在一些实施例中，一或多种羟丙基β-环糊精产物(例如hbp或cyclo)的纯化由于去除未经取代(ds＝0)及/或经单取代(ds＝1)的β-环糊精而引起dsa增加。在阐释性实例中，具有dsa＝4.34的hbp的商业试样含有0.6％未经取代的β-环糊精(ds＝0)及3.68％经单取代的β-环糊精(ds＝1)。可使用以下方程计算去除ds＝0及ds＝1物质后的dsa：

x(0)+y(1)+z(dsa)＝4.34

x+y+z＝1

其中x＝未经取代的β-环糊精的分数；y＝经单取代的β-环糊精的分数；z＝ds≥2的β-环糊精的分数。在此情况下，去除具有ds＝0及ds＝1的β-环糊精后所得试样的dsa是4.5。

因此，在某些实施例中，本发明提供纯化一或多种选自以下的羟丙基β-环糊精产物的方法：hbp、hp、cyclo及w7hppharma，特定而言hbp或cyclo，其中该纯化方法降低产物中丙二醇或丙二醇寡聚物的量(例如，通过溶剂沉淀)及/或未经取代的β-环糊精(ds＝0)的量及/或经单取代的β-环糊精(ds＝1)的量(例如，通过吸附层析)。在其中降低产物中未经取代的β-环糊精(ds＝0)的量及/或经单取代的β-环糊精(ds＝1)的量的某些该实施例中，纯化产物表现出增加的dsa。因此，在某些实施例中，本发明提供增加一或多种选自以下的羟丙基β-环糊精产物的dsa的方法：hbp、hp、cyclo及w7hppharma，特定而言hbp或cyclo，该方法包括例如根据一或多种本文所述纯化步骤(例如吸附层析)降低产物中未经取代的β-环糊精(ds＝0)及/或经单取代的β-环糊精(ds＝1)的量。

尽管hbp、hp、cyclo及w7hppharma各自具有如上文所论述的报告dsa，但dsa是平均量度，且因此，这些羟丙基β-环糊精产物中的每一者皆包括具有变化ds值的羟丙基β-环糊精。在一些实施例中，本文所述医药活性成份通过自这些产物中的一或多者分离一或多种具有本文所述dsa的羟丙基β-环糊精部分来获得。

6.2.2.内毒素含量

在某些实施例中，本公开内容的医药组合物含有低含量的细菌内毒素。低含量的细菌内毒素容许通过某些途径(例如经由鞘内或脑室内投与)以较利用具有较高含量的内毒素的其他组合物所可安全进行者更长的持续时段及更高的量投与所公开的医药组合物。

如本文所用的”iu”是指细菌内毒素的国际单位，亦称作美国药典(usp)内毒素单位(“eu”)。组合物中细菌内毒素的含量(iu；与eu同义)通过鲎变形细胞溶解物试验根据以下中所述程序来测定：“<85>bacterialendotoxinstest,”theunitedstatespharmacopeialconvention,interimrevisionannouncement，日期为2011年4月1日(“usp内毒素专论”)，其全文以引用方式并入本文中。

在一些实施例中，医药组合物含有小于约10iu、例如小于约6、约5、约4、约3、约2、约1.5、约1.2、约1iu、约0.8iu、约0.6iu、约0.5iu、约0.4iu、约0.3iu、约0.2iu、约0.1iu、约0.07iu或约0.05iu内毒素/克医药活性成份。在一些实施例中，医药组合物含有以下范围内的含量的细菌内毒素：约0.05iu至约10iu、例如约0.05iu至约6iu、约0.05iu至约5iu、约0.05iu至约4iu、约0.05iu至约3iu、约0.05iu至约2iu、约0.05iu至约1.5iu、约0.05iu至约1.2iu、约0.05iu至约1iu、约0.05iu至约0.8iu、约0.05iu至约0.6iu、约0.05iu至约0.5iu、约0.05iu至约0.4iu、约0.05iu至约0.3iu、约0.05iu至约0.2iu或约0.05iu至约0.1iu内毒素/克β-环糊精混合物。

在某些实施例中，医药组合物包含不超过5eu/gβ-环糊精混合物、不超过4eu/gβ-环糊精混合物、不超过3eu/gβ-环糊精混合物或不超过2eu/gβ-环糊精混合物。在较佳实施例中，医药组合物包含不超过1.5eu/gβ-环糊精混合物。在某些实施例中，医药组合物包含不超过1.4eu/gβ-环糊精混合物、不超过1.3eu/gβ-环糊精混合物、不超过1.2eu/gβ-环糊精混合物、不超过1.1eu/gβ-环糊精混合物或不超过1.0eu/gβ-环糊精混合物。

6.2.3.过程杂质

包含羟丙基β-环糊精的混合物的医药组合物可含有自羟丙基β-环糊精的合成产生的杂质。这些杂质可包括未反应的起始材料(例如未经取代的β-环糊精及环氧丙烷)及反应副产物(例如丙二醇及丙二醇寡聚物)。在某些实施例中，本文所述医药组合物展现这些杂质中的一或多者的降低含量。

6.2.3.1.丙二醇

在一些实施例中，医药活性成份包含小于约1％、例如小于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％的丙二醇，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。在各个实施例中，医药活性成份包含小于约0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的丙二醇，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。在某些实施例中，医药组合物包含小于约0.09％、0.08％、0.07％或小于约0.05％的丙二醇，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。在当前较佳实施例中，医药活性成份包含不超过0.5％的丙二醇，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。

在一些实施例中，医药活性成份包含约0.05％至约1％的丙二醇，例如约0.05％至约0.8％、约0.05％至约0.6％、约0.05％至约0.5％、约0.05％至约0.4％、约0.05％至约0.3％、约0.05％至约0.2％、约0.05％至约0.1％、约0.05％至约0.07％、约0.07％至约1％、约0.07％至约0.8％、约0.07％至约0.6％、约0.07％至约0.5％、约0.07％至约0.4％、约0.07％至约0.3％、约0.07％至约0.2％、约0.07％至约0.1％、约0.1％至约1％、约0.1％至约0.8％、约0.1％至约0.6％、约0.1％至约0.5％、约0.1％至约0.4％、约0.1％至约0.3％、约0.1％至约0.2％、约0.2％至约1％、约0.2％至约0.8％、约0.2％至约0.6％、约0.2％至约0.5％、约0.2％至约0.4％、约0.2％至约0.3％、约0.3％至约1％、约0.3％至约0.8％、约0.3％至约0.6％、约0.3％至约0.5％、约0.3％至约0.4％、约0.4％至约1％、约0.4％至约0.8％、约0.4％至约0.6％、约0.4％至约0.5％、约0.5％至约1％、约0.5％至约0.8％、约0.5％至约0.6％、约0.6％至约1％、约0.6％至约0.8％或约0.8％至约1.0％，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。

在一些实施例中，医药活性成份包含小于约0.01％的丙二醇单体，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。在一些实施例中，医药活性成份包含小于约0.2％的丙二醇二聚体，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。在一些实施例中，医药活性成份包含小于约0.2％的丙二醇三聚体，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。

6.2.3.2.环氧丙烷

在一些实施例中，医药活性成份含有小于约1ppm、例如小于约0.8ppm、小于约0.6ppm、小于约0.5ppm、小于约0.4ppm、小于约0.3ppm、小于约0.2ppm、小于约0.1ppm、小于约0.07ppm或小于约0.05ppm的环氧丙烷，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。举例而言，医药活性成份可具有约1、约0.8、约0.6、约0.5、约0.4、约0.3、约0.2、约0.1、约0.07或约0.05ppm的环氧丙烷，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。

在一些实施例中，医药活性成份具有以下范围内的量的环氧丙烷：约0.05至约1ppm，例如约0.05至约0.8、约0.05至约0.6、约0.05至约0.5、约0.05至约0.4、约0.05至约0.3、约0.05至约0.2、约0.05至约0.1、约0.1至约1、约0.1至约0.8、约0.1至约0.6、约0.1至约0.5、约0.1至约0.4、约0.1至约0.3、约0.1至约0.2、约0.2至约1、约0.2至约0.8、约0.2至约0.6、约0.2至约0.5、约0.2至约0.4、约0.2至约0.3、约0.3至约1、约0.3至约0.8、约0.3至约0.6、约0.3至约0.5、约0.3至约0.4、约0.4至约1、约0.4至约0.8、约0.4至约0.6、约0.4至约0.5、约0.5至约1、约0.5至约0.8、约0.5至约0.6、约0.6至约1、约0.6至约0.8或约0.8至约1ppm，其根据美国药典羟丙基β-环糊精专论所测定。

6.2.4.其他组成特征

本文提供包含本公开内容的医药活性成份及任选地一或多种额外治疗剂(例如章节4.3.3.中所述的组合治疗剂)的羟丙基β-环糊精组合物。

在某些实施例中，医药组合物包含约100mg至约2000mg、例如约100至约1800、约100至约1600、约100至约1500、约100至约1200、约100至约1000、约100至约800、约100至约600、约100至约500、约100至约400、约100至约300、约100至约200、约200至约2000、约200至约1800、约200至约1600、约200至约1500、约200至约1200、约200至约1000、约200至约800、约200至约600、约200至约500、约200至约400、约200至约300、约300至约2000、约300至约1800、约300至约1600、约300至约1500、约300至约1200、约300至约1000、约300至约800、约300至约600、约300至约500、约300至约400、约400至约2000、约400至约1800、约400至约1600、约400至约1500、约400至约1200、约400至约1000、约400至约800、约400至约600、约400至约500、约500至约2000、约500至约1800、约500至约1600、约500至约1500、约500至约1200、约500至约1000、约500至约800、约500至约600、约600至约2000、约600至约1800、约600至约1600、约600至约1500、约600至约1200、约600至约1000、约600至约800、约800至约2000、约800至约1800、约800至约1600、约800至约1500、约800至约1200或约800至约1000mg的医药活性成份。举例而言，医药组合物可包含约100、约200、约300、约400、约500、约600、约800、约1000、约1200、约1400、约1500、约1600、约1800或约2000mg的医药活性成份。

在一些实施例中，供投与的医药组合物(例如适于鞘内投与的医药组合物)具有以下浓度的医药活性成份：约10mg/ml至约200mg/ml，例如约10至约180、约10至约150、约10至约120、约10至约100、约10至约80、约10至约60、约10至约50、约10至约40、约10至约30、约10至约20、约20至约200、约20至约180、约20至约150、约20至约120、约20至约100、约20至约80、约20至约60、约20至约50、约20至约40、约20至约30、约30至约200、约30至约180、约30至约150、约30至约120、约30至约100、约30至约80、约30至约60、约30至约50、约30至约40、约40至约200、约40至约180、约40至约150、约40至约120、约40至约100、约40至约80、约40至约60、约40至约50、约50至约200、约50至约180、约50至约150、约50至约120、约50至约100、约50至约80、约50至约60、约60至约200、约60至约180、约60至约150、约60至约120、约60至约100、约60至约80、约80至约200、约80至约180、约80至约150、约80至约120、约80至约100、约100至约200、约100至约180、约100至约150、约100至约120、约120至约200、约120至约180、约120至约150、约150至约200、约150至约180或约180至约200mg/ml。举例而言，医药组合物可具有以下浓度的医药活性成份：约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190或约200mg/ml。在某些实施例中，供鞘内投与的医药组合物具有约200mg/ml的浓度的医药活性成份。

在某些实施例中，本文所述医药组合物在投与动物时展现低耳毒性水平。在一些实施例中，医药组合物展现较cyclo低的耳毒性。耳毒性可通过豪斯耳科研究中心-柯氏器官1(hei-oc1)细胞内的毒性活体外评价或通过动物(例如小鼠、大鼠、猫、狗、猴、黑猩猩或人类)中的脑干听性诱发反应(baer)测试活体内评价。参见(例如)leigh-paffenroth,e.等人“objectivemeasuresofototoxicity,”2005年9月，第9卷，第1期，第10-16页，perspectivesonhearingandhearingdisorders:researchanddiagnostics,specialinterestdivision6oftheamericanspeech-language-hearingassociation，其全文以引用方式并入本文中。

在一些实施例中，医药组合物(例如适于鞘内投与的医药组合物)具有以下范围内的渗透压：约300至约450mosm/kg，例如约300至约400、约300至约350、约350至约450或约350至约400mosm/kg。在一些实施例中，组合物的渗透压为约300、约320、约350、约380、约400、约420或约450mosm/kg。

适于如本文所述医药组合物(例如适于鞘内或脑室内投与的医药组合物)的稀释剂包括等渗盐水溶液。亦可将组合物(例如适于鞘内投与的医药组合物)用elliotts溶液(缓冲鞘内电解质/右旋糖注射剂，来自lukaremedical,llc,scotchplains,newjersey,usa)稀释。

在一些实施例中，注射用医药组合物通过将活性医药成份(β-环糊精分子的混合物)溶解于水中、添加氯化钠至0.9％w/v及视需要用0.01n氢氧化钠调节ph至6.0-8.0来制得。随后将医药组合物无菌过滤至小瓶中并经高压灭菌。产物稳定且可储存于15℃至25℃下。

组合物通常作为通常包括医药上可接受的载剂的无菌医药组合物的一部分供应。此组合物可呈任何适宜形式(取决于期望投与方法)。举例而言，医药组合物可调配为水溶液且通过鞘内注射或鞘内输注。

在一些实施例中，医药组合物包含含有每个剂量一定量的本公开内容的医药活性成份的单位剂型。该单位可含有(例如但不限于)约5mg至约5g、例如5mg至约4g、5mg至约3g、5mg至约2g、5mg至约1g、约50mg至约5g、约50mg至约4g、约50mg至约3g、约50mg至约2g、约50mg至约1g、约200mg至约5g、约200mg至约4g、约200mg至约3g、约200mg至约2g、约200mg至约1g、约400mg至约5g、约400mg至约4g、约400mg至约3g、约400mg至约2g、约400mg至约1g、约500mg至约5g、约500mg至约4g、约500mg至约3g、约500mg至约2g、约500mg至约1g、约600mg至约5g、约600mg至约4g、约600mg至约3g、约600mg至约2g、约600mg至约1g、约800mg至约5g、约800mg至约4g、约800mg至约3g、约800mg至约2g、约800mg至约1g、约1g至约5g、约1g至约4g、约1g至约3g、约1g至约2g、约1200mg至约5g、约1200mg至约4g、约1200mg至约3g、约1200mg至约2g、约1400mg至约5g、约1400mg至约4g、约1400mg至约3g、约1400mg至约2g、约1600mg至约5g、约1600mg至约4g、约1600mg至约3g、约1600mg至约2g、约1800mg至约5g、约1800mg至约4g、约1800mg至约3g或约1800mg至约2g的医药活性成份。某些实施例包括含有约900mg、约1200mg及约1800mg医药活性成份的单位剂量。

在某些实施例中，单位剂量可含有在约200mg与约900mg之间的本公开内容的医药活性成份，例如约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg或约900mg医药活性成份。

本公开内容的羟丙基β-环糊精混合物的医药组合物可通过将具有期望纯度的医药活性成份与业内常用的可选医药上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(其所有在本文中皆称作“载剂”)(即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子清洁剂、抗氧化剂及其他各种各样的添加剂)混合来制备以作为冻干调配物或水溶液储存。参见remington’spharmaceuticalsciences，第16版(osol编辑，1980)。

在一些实施例中，使用缓冲剂以帮助将ph维持在接近生理条件的范围内：约2mm至约50mm，例如约2至约40、约2至约30、约2至约20、约2至约10、约10至约50、约10至约40、约10至约30、约10至约20、约20至约50、约20至约40、约20至约30或约40至约50mm。举例而言，一或多种缓冲剂可以约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50mm的浓度存在。用于本发明的适宜缓冲剂包括有机及无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲液(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)及乙酸盐缓冲液(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液及三甲胺盐(例如tris)。

在一些实施例中，添加在以下范围内的量的防腐剂以妨碍微生物生长：0.01％-1％(w/v)，例如0.1％-1％、0.2％-1％、0.3％-1％、0.5％-1％、0.01％-0.5％、0.02％-0.5％、0.05％-0.5％、0.1％-0.5％、0.2％-0.5％、或0.05％-0.2％(w/v)。举例而言，可添加约0.02％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.5％、约0.8％(w/v)的量的防腐剂。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲基酯、对羟基苯甲酸丙基酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤化物(例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵及苯扎碘铵)、氯化六甲双铵及对羟基苯甲酸烷基酯(例如对羟基苯甲酸甲基酯或对羟基苯甲酸丙基酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇及3-戊醇。

在一些实施例中，添加等渗剂(有时称作“稳定剂”)以确保本发明的液体组合物的等渗性且所述等渗剂包括多元糖醇，例如三元或更多元糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇及甘露醇。稳定剂是指广泛种类的赋形剂，其功能可在从增积剂(bulkingagent)至稳定治疗剂或有助于防止变性或黏附至容器壁的添加剂的范围内。典型稳定剂可为多元糖醇(上文所列举)；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、l-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、卫矛醇、甘油及诸如此类，包括环多醇，例如纤维醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油及硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个或更少残基的肽)；蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖；以及三糖，例如棉子糖；及多糖，例如葡聚糖。在一些实施例中，稳定剂以0.1至10,000重量/重量份数医药活性成份、例如0.1至1,000、0.2至2,000、0.5至5,000、1至10,000或1至1,000重量/重量份数医药活性成份存在。举例而言，稳定剂可以约0.2、约0.5、约1、约5、约10、约20、约50、约100、约200、约500、约1,000、约2,000、约5,000或约8,000重量/重量份数医药活性成份存在。

在一些实施例中，添加离子表面活性剂以有助于溶解治疗剂以及保护活性成份抵抗搅动诱导的聚集。在一些实施例中，添加非离子表面活性剂或清洁剂(亦称作“润湿剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护活性成份抵抗搅动诱导的聚集。适宜非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、普流尼克(pluronic)多元醇、聚氧乙烯山梨醇酐单醚(-20、-80等)。在一些实施例中，非离子表面活性剂以在以下范围存在：约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，例如约0.05mg/ml至约0.2mg/ml、约0.07mg/ml至约0.2mg/ml、约0.1mg/ml至约0.3mg/ml或约0.1mg/ml至约0.5mg/ml。例如，非离子表面活性剂可以约0.05、约0.07、约0.08、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.8或约1.0mg/ml存在。

其他各种各样的赋形剂包括增积剂(例如，淀粉)、螯合剂(例如，edta)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维他命e)及共溶剂。

在一些实施例中，除本公开内容的医药活性成份(本文所述β-环糊精的混合物)外，本文的医药组合物亦含有治疗剂(例如第二治疗剂)的组合。合适的组合治疗剂的实例提供于下文章节4.3.3.中。

在一些实施例中，本文所述医药组合物将脂质溶解于水性介质中。水性介质可为(例如)蒸馏水或去离子水，或可为个体体内的水性环境(例如，血液、脑脊髓液或淋巴液)。组合物的溶解能力通常可通过溶液的uv透射性质测量，例如如通过uv光谱法或通过hplc所监测，其中透射降低与溶液内形成悬浮液相关。在一些实施例中，溶解的脂质包含未酯化或酯化胆固醇；胆固醇代谢物，例如7-酮胆固醇、7β-羟基胆固醇、24s-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇及胆甾烷-3β,5α,6β-三醇；神经鞘酯；糖脂；神经酰胺；神经节苷酯，例如gm2((2s,3r,4e)-3-羟基-2-(十八酰基氨基)十八碳-4-烯-1-基2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-吡喃半乳糖基-(1→4)-[5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-d-甘油-α-d-半乳糖基-壬-2-酮吡喃糖基(ulopyranonosyl)-(2→3)]-β-d-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-d-葡萄吡喃糖苷)或gm3(单唾液酸二己糖基神经节苷酯)；或其任意组合。

如本文所用，每体积的重量(“重量/体积”或“w/v”)溶液是指溶解于一定体积的水中的溶质的重量。在阐释性实例中，羟丙基β-环糊精的10％(w/v)溶液具有于10ml水溶液中的1g溶质。在另一实例中，羟丙基β-环糊精的20％(w/v)溶液具有1ml水溶液中的200mg溶质。

在一些实施例中，在约24小时后(例如)通过uv光谱法测量时，于室温下1ml本文所述医药活性成份的20％(w/v)溶液将至少2mg、例如至少3mg、至少4mg、至少5mg、至少6mg、至少7mg、至少8mg或至少10mg未酯化胆固醇溶解于蒸馏水中。在一些实施例中，在约24小时后测量时，于室温下约200mg医药活性成份将至少2mg、例如至少3mg、至少4mg、至少5mg、至少6mg、至少7mg、至少8mg或至少10mg未酯化胆固醇溶解于蒸馏水中。

6.3.治疗方法

本公开内容提供治疗c型尼曼-匹克病(npc)(例如c1型尼曼-匹克病(npc1)或c2型尼曼-匹克病(npc2))的方法，其包括向患有尼曼-匹克病的个体投与治疗有效量的如本文所述医药组合物。

如本文所用“个体”是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、猫、狗、牛、猪、马。在一些实施例中，哺乳动物是灵长类动物，例如猴、黑猩猩或人类。举例而言，个体可为人类个体，即人类患者。在某些实施例中，患者是小儿患者或成人患者。小儿人类患者包括患有特征为在婴儿早期发作(小于2岁)、婴儿晚期发作(2至小于6岁)、幼年发作(6至小于15岁)及青少年发作(15岁或更大)的疾病的小儿患者。

术语“治疗”(“treat”、“treating”或“treatment”)是指投与本文所述医药组合物以便有益地调节与基线值相比一或多种脂质生物标记的含量或如章节4.3.4.中所述的治疗效应的水平。示例性治疗期涉及重复投与本文所述医药组合物，其中如章节4.3.4.2中所定义的npc严重程度量表的一或多个域的评分与先前基线值相比降低。

术语“维持”(“maintain”、“maintaining”或“maintenance”)是指投与本文所述医药组合物以保持一或多个如章节4.3.4中所述的生物效应的基线值恒定。与未投与或投与安慰剂相比，投与的维持期可防止npc进展。维持期的阐释性实例是重复投与本文所述医药组合物，其中如章节4.3.4.2中所定义的npc严重程度量表的一或多个域的评分保持与基线值相同的水平下。

6.3.1.羟丙基β-环糊精医药组合物的投与

在一些实施例中，该方法包括每次投与向个体投与约200mg至约3000mg，例如约200至约2800、约200至约2600、约200至约2500、约200至约2400、约200至约2200、约200至约2000、约200至约1800、约200至约1600、约200至约1500、约200至约1200、约200至约1100、约200至约1000、约200至约800、约200至约700、约200至约600、约200至约500、约200至约400、约200至约300；约300至约3000、约300至约2800、约300至约2600、约300至约2500、约300至约2400、约300至约2200、约300至约2000、约300至约1800、约300至约1600、约300至约1500、约300至约1200、约300至约1100、约300至约1000、约300至约800、约300至约700、约300至约600、约300至约500、约300至约400；例如约400至约3000、约400至约2800、约400至约2600、约400至约2500、约400至约2400、约400至约2200、约400至约2000、约400至约1800、约400至约1600、约400至约1500、约400至约1200、约400至约1100、约400至约1000、约400至约800、约400至约700、约400至约600、约400至约500；例如约500至约3000、约500至约2800、约500至约2600、约500至约2500、约500至约2400、约500至约2200、约500至约2000、约500至约1800、约500至约1600、约500至约1500、约500至约1200、约500至约1100、约500至约1000、约500至约800、约500至约700、约500至约600；例如约600至约3000、约600至约2800、约600至约2600、约600至约2500、约600至约2400、约600至约2200、约600至约2000、约600至约1800、约600至约1600、约600至约1500、约600至约1200、约600至约1100、约600至约1000、约600至约800、约600至约700；例如约700至约3000、约700至约2800、约700至约2600、约700至约2500、约700至约2400、约700至约2200、约700至约2000、约700至约1800、约700至约1600、约700至约1500、约700至约1200、约700至约1100、约700至约1000、约700至约800；例如约800至约3000、约800至约2800、约800至约2600、约800至约2500、约800至约2400、约800至约2200、约800至约2000、约800至约1800、约800至约1600、约800至约1500、约800至约1200、约800至约1100、约800至约1000；例如约1000至约3000、约1000至约2800、约1000至约2600、约1000至约2500、约1000至约2400、约1000至约2200、约1000至约2000、约1000至约1800、约1000至约1600、约1000至约1500、约1000至约1200、约1000至约1100；例如约1100至约3000、约1100至约2800、约1100至约2600、约1100至约2500、约1100至约2400、约1100至约2200、约1100至约2000、约1100至约1800、约1100至约1600、约1100至约1500、约1100至约1200；例如约1200至约3000、约1200至约2800、约1200至约2600、约1200至约2500、约1200至约2400、约1200至约2200、约1200至约2000、约1200至约1800、约1200至约1600、约1200至约1500；例如约1500至约3000、约1500至约2800、约1500至约2600、约1500至约2500、约1500至约2400、约1500至约2200、约1500至约2000、约1500至约1800、约1500至约1600；例如约1600至约3000、约1600至约2800、约1600至约2600、约1600至约2500、约1600至约2400、约1600至约2200、约1600至约2000、约1600至约1800；例如约1800至约3000、约1800至约2800、约1800至约2600、约1800至约2500、约1800至约2400、约1800至约2200、约1800至约2000；例如约2000至约3000、约2000至约2800、约2000至约2600、约2000至约2500、约2000至约2400、约2000至约2200；例如约2200至约3000、约2200至约2800、约2200至约2600、约2200至约2500、约2200至约2400；例如约2400至约3000、约2400至约2800、约2400至约2600、约2400至约2500；例如约2500至约3000、约2500至约2800、约2500至约2600；例如约2600至约3000、约2600至约2800；或约2800至约3000mg医药活性成份。

在一些实施例中，剂量时间表由每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次或每三个月一次投与组成。举例而言，该方法可包括每次投与向个体投与约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1200、约1400、约1500、约1600、约1800、约2000、约2200、约2400、约2500或约3000mg医药活性成份。

在一些实施例中，投与是每次投与以单一剂量发生。在其他实施例中，医药组合物每次投与是以分开剂量投与，其中全部剂量分成两个剂量、三个剂量或甚至四个剂量，例如在一周、两周、一个月、两个月等内，具体而言在两周内。取决于所治疗病况、投与途径及个体的年龄、重量及状况而定，组合物也可连续或以任何有效范围或其中的值投与。

在一些实施例中，本公开内容的医药组合物适于鞘内或脑室内投与。在某些实施例中，医药组合物的鞘内投与是经由鞘内给药装置(port)。在某些这样的实施例中，给药装置是给药装置(b.braunmedical,france)。在某些实施例中，鞘内投与包括以鞘内缓慢浓注(1-2分钟，取决于所投与体积而定)形式实施腰穿刺注射(最大投与速率＝4.5ml/分钟)。在某些实施例中，腰穿刺的技术包括使用非切割针(例如whiteacre或sprotte针)、平行于硬膜纤维插入及在移除针之前更换管心针。在某些实施例中，在注射之前，移除等于欲投与之体积的体积的csf流体。

在另一阐释性实例中，脑室内投与可经由ommaya储存器。

对于本文所述npc的治疗，医药活性成份羟丙基β-环糊精混合物的有效剂量可在以下范围内：约0.001至约1000mg/kg，例如约0.1至约1000、约1至约1000、约10至约1000、约20至约1000、约50至约1000、约100至约1000、约200至约1000、约300至约1000、约400至约1000、约500至约1000、约600至约1000、约800至约1000；例如约0.1至约800、约1至约800、约10至约800、约20至约800、约50至约800、约100至约800、约200至约800、约300至约800、约400至约800、约500至约800、约600至约800；例如约0.1至约600、约1至约600、约10至约600、约20至约600、约50至约600、约100至约600、约200至约600、约300至约600、约400至约600、约500至约600；例如约0.1至约500、约1至约500、约10至约500、约20至约500、约50至约500、约100至约500、约200至约500、约300至约500、约400至约500；例如约0.1至约400、约1至约400、约10至约400、约20至约400、约50至约400、约100至约400、约200至约400、约300至约400；例如约0.1至约300、约1至约300、约10至约300、约20至约300、约50至约300、约100至约300、约200至约300；例如约0.1至约200、约1至约200、约10至约200、约20至约200、约50至约200、约100至约200；例如约0.1至约100、约1至约100、约10至约100、约20至约100、约50至约100；例如约0.1至约50、约1至约50、约10至约50、约20至约50；例如约0.1至约20、约1至约20、约10至约20；例如约0.1至约10、约1至约10；或约0.1至约1mg/kg。

在一些实施例中，该方法包括治疗期，其中投与是每周、每两周、每三周或每月发生以减少npc的症状。

在一些实施例中，该方法包括维持期，其中投与是每三周、每月、每两个月或每三个月发生，以维持疾病的稳定态。

在一些实施例中，医药组合物以浓注、之后连续维持剂量形式投与。

在某些实施例中，医药组合物经由鞘内或脑室内投与每月投与。在某些实施例中，医药组合物经由鞘内或脑室内投与连续投与。

在一些实施例中，该方法包括治疗期(其中900mg医药活性成份作为初始剂量投与患者)及维持期(其中小于900mg医药活性成份通过鞘内投与每隔一周投与)。

6.3.2.多种投与途径

在一些实施例中，该方法包括使用多种投与途径投与医药活性成份。在某些实施例中，该方法包括(i)鞘内或通过脑室内投与及(ii)静脉内投与医药活性成份。这些实施例有用地允许中枢神经系统及周边器官中胆固醇累积的减少。

在一些实施例中，静脉内投与包括在6至8小时内通过静脉内输注向患者投与约200mg/kg至约4000mg/kgβ-环糊精混合物。在一些实施例中，静脉内投与包括在6至8小时内通过静脉内输注向患者投与约500mg/kg至约4000mg/kgβ-环糊精混合物。

在典型实施例中，医药组合物包含约200mg/mlβ-环糊精混合物。在某些其他实施例中，医药组合物包含约250mg/mlβ-环糊精混合物。在一些实施例中，医药组合物是每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次或每三个月一次投与。在某些实施例中，静脉内投与是在出生后不久即开始。在某些其他实施例中，静脉内投与是在启动鞘内(或脑室内)投与之后开始。在一些实施例中，监测患者的肝体积、脾体积及/或肝酶活性以测定治疗的效能并用于调节剂量时间表。

6.3.3.组合治疗

下文阐述组合治疗方法，其中可任选地利用本公开内容的羟丙基β-环糊精医药组合物。在一些实施例中，本公开内容的组合方法涉及向个体投与至少两种药剂，第一种是本文所述羟丙基β-环糊精混合物(例如于本文所述医药组合物中)，其他药剂是组合治疗剂。羟丙基β-环糊精混合物及组合治疗剂可同时(例如，在如本文所述医药组合物中)、依序或分开投与。

本发明的组合治疗方法可产生过加和效应，即协同效应，例如提供大于羟丙基β-环糊精混合物及组合治疗剂在各自个别投与时的益处的预计和的治疗益处。

在一些实施例中，羟丙基β-环糊精混合物及组合治疗剂是并行、同时或接续投与。如本文所用，若羟丙基β-环糊精混合物及组合治疗剂是在同一天(例如在相同个体拜访期间)投与个体，则称其为接续投与。接续投与可间隔1、2、3、4、5、6、7、或8小时发生。相比之下，若羟丙基β-环糊精混合物及组合治疗剂是在不同天投与个体，例如羟丙基β-环糊精混合物及组合治疗剂可以1天、2天或3天、1周、2周或每月间隔投与，则称其为分开投与。在本发明的方法中，羟丙基β-环糊精混合物的投与可在组合治疗剂的投与之前或之后。

作为非限制性实例，羟丙基β-环糊精混合物及组合治疗剂可并行投与一段时间，之后交替投与羟丙基β-环糊精混合物及组合治疗剂的第二段时间。

由于投与羟丙基β-环糊精混合物及组合治疗剂的潜在协同效应，该药剂可以若该药剂中的一者或二者单独投与并不治疗有效的量以治疗有效组合形式投与。

在某些实施例中，组合治疗剂是维生素e或其衍生物、酶替代疗法、类固醇、葡萄糖基转移酶抑制剂、组织蛋白去乙酰酶(hdac)抑制剂或分子伴侣蛋白活化剂。

维生素e或维生素e衍生物包括(但不限于)α-生育酚、δ-生育酚及生育酚衍生物。在一些实施例中，维生素e衍生物包括酯化生育酚(例如乙酸生育酚)及化学相关生育酚衍生物，例如阐述于pct公开案第wo2014/078573号中的那些，该案件的全文以引用方式并入本文中。

酶替代疗法包括(但不限于)无半乳糖甘酶β伊米苷酶(imiglucerase)维拉苷酶α(verlaglucerasealfa)(vpriv^tm)、他利苷酶(taliglucerase)(elelyso^tm)、阿葡糖苷酶α(或)、拉罗尼酶(laronidase)静脉内依度硫酶(idursulfase)及加硫酶(naglazyme^tm)。

类固醇包括(但不限于)神经类固醇，例如异孕甾烷醇酮(allopregnanolone)及加奈索酮(ganaxolone)。

葡萄糖基转移酶抑制剂包括(但不限于)糖基化神经酰胺合酶抑制剂，例如麦格司他

hdac抑制剂包括(但不限于)伏立诺他(vironostat)、罗米地辛(romidepsin)、曲古抑菌素a(trichostatina)、丙戊酸盐、丁酸盐、曲泊欣(trapoxin)及阿匹西定(apicidin)。

分子伴侣蛋白活化剂包括(但不限于)阿瑞洛莫(arimoclomol)。

6.3.4.方法的生物效应

6.3.4.1.对生物标记的效应

在一些实施例中，治疗npc的方法包括维持或调节一或多个身体器官中(例如脑中)累积且导致疾病症状的一或多种脂质(例如未酯化胆固醇或神经节苷酯)的含量。在某些实施例中，调节一或多种脂质的含量包括降低一或多种脂质的含量。在一些实施例中，方法的效能通过测量在治疗开始之前(基线值)及之后一或多种脂质的储存的含量来测定。举例而言，在一些实施例中，目标方法将一或多种脂质的含量相对于基线值降低约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％。

在一些实施例中，目标方法将一或多种脂质的含量相对于基线值降低20％±5％、25％±5％、30％±5％、35％±5％、40％±5％、45％±5％、50％±5％、55％±5％、60％±5％、65％±5％、70％±5％、75％±5％、80％±5％、85％±5％、90％±5％或95％±5％。

在一些实施例中，目标方法将一或多种脂质的含量相对于基线值降低20％±3％、25％±3％、30％±3％、35％±3％、40％±3％、45％±3％、50％±3％、55％±3％、60％±3％、65％±3％、70％±3％、75％±3％、80％±3％、85％±3％、90％±3％、95％±3％或97％±3％。

在一些实施例中，目标方法将一或多种脂质的含量相对于基线值降低20％±2％、25％±2％、30％±2％、35％±2％、40％±2％、45％±2％、50％±2％、55％±2％、60％±2％、65％±2％、70％±2％、75％±2％、80％±2％、85％±2％、90％±2％、95％±2％或97％±2％。

在一些实施例中，目标方法将一或多种脂质的含量相对于基线值降低至少约20％、例如至少约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％。

在一些实施例中，目标方法将一或多种脂质的含量相对于基线值降低以下范围：约20％至约97％，例如约20％至约95％、约20％至约90％、约20％至约85％、约20％至约80％、约20％至约75％、约20％至约70％、约20％至约65％、约20％至约60％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、约20％至约40％、约20％至约35％、约20％至约30％、约20％至约25％；例如约25％至约97％、约25％至约95％、约25％至约90％、约25％至约85％、约25％至约80％、约25％至约75％、约25％至约70％、约25％至约65％、约25％至约60％、约25％至约55％、约25％至约50％、约25％至约45％、约25％至约40％、约25％至约35％、约25％至约30％；例如约30％至约97％、约30％至约95％、约30％至约90％、约30％至约85％、约30％至约80％、约30％至约75％、约30％至约70％、约30％至约65％、约30％至约60％、约30％至约55％、约30％至约50％、约30％至约45％、约30％至约40％、约30％至约35％；例如约35％至约97％、约35％至约95％、约35％至约90％、约35％至约85％、约35％至约80％、约35％至约75％、约35％至约70％、约35％至约65％、约35％至约60％、约35％至约55％、约35％至约50％、约35％至约45％、约35％至约40％；例如约40％至约97％、约40％至约95％、约40％至约90％、约40％至约85％、约40％至约80％、约40％至约75％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％、约40％至约55％、约40％至约50％、约40％至约45％；例如约45％至约97％、约45％至约95％、约45％至约90％、约45％至约85％、约45％至约80％、约45％至约75％、约45％至约70％、约45％至约65％、约45％至约60％、约45％至约55％、约45％至约50％；例如约50％至约97％、约50％至约95％、约50％至约90％、约50％至约85％、约50％至约80％、约50％至约75％、约50％至约70％、约50％至约65％、约50％至约60％、约50％至约55％；例如约55％至约97％、约55％至约95％、约55％至约90％、约55％至约85％、约55％至约80％、约55％至约75％、约55％至约70％、约55％至约65％、约55％至约60％；例如约60％至约97％、约60％至约95％、约60％至约90％、约60％至约85％、约60％至约80％、约60％至约75％、约60％至约70％、约60％至约65％；例如约65％至约97％、约65％至约95％、约65％至约90％、约65％至约85％、约65％至约80％、约65％至约75％、约65％至约70％；例如约70％至约97％、约70％至约95％、约70％至约90％、约70％至约85％、约70％至约80％、约70％至约75％；例如约75％至约97％、约75％至约95％、约75％至约90％、约75％至约85％、约75％至约80％；例如约80％至约97％、约80％至约95％、约80％至约90％、约80％至约85％；例如约85％至约97％、约85％至约95％、约85％至约90％；例如约90％至约97％、约90％至约95％或约95％至约97％。

在npc患者中，可通过监测脑脊髓液(csf)、血浆或尿液的试样中的一或多个生物标记测量一或多种脂质的储存的含量。在一些实施例中，使用csf以直接测定一或多种脂质的排泄程度。在一些实施例中，监测通过一或多种脂质的含量变化调节的下游蛋白质生物标记。在一些实施例中，该方法包括投与足以调节、例如相对于基线值降低脑脊髓液中以下中的一或多者的含量的量的医药活性成份：τ蛋白、类淀粉肽、神经丝微蛋白(nfl)、胶质原纤维酸性蛋白(gfap)、固醇、氧化固醇、几丁三糖酶活性、钙结合蛋白、溶酶体相关膜蛋白1(lamp-1)、gm2或gm3神经节苷酯、神经鞘胺醇及神经鞘胺醇-1-磷酸盐(s1p)。

在一些实施例中，使用血浆试样以测定在治疗之前及之后血液中存在的一或多种脂质(例如胆固醇或胆固醇代谢物)的含量。在一些实施例中，该方法包括投与足以调节、例如相对于基线值降低血浆中以下中的一或多者的含量的量的医药活性成份：7-酮胆固醇、7β-羟基胆固醇、24s-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇及胆甾烷-3β,5α,6β-三醇。

监测在npc1患者的尿液中报告的其他脂质(例如代谢物，例如3β-磺氧基-7β-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-ca)、甘氨酸结合的3β-磺氧基-7β-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-cg)及牛磺酸结合的3β-磺氧基-7β-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-ct))可提供有用生物标记(maekawa,m.等人“focusedmetabolomicsusingliquidchromatography/electrosprayionizationtandemmassspectrometryforanalysisofurinaryconjugatedcholesterolmetabolitesfrompatientswithniemann-pickdiseasetypecand3β-hydroxysteroiddehydrogenasedeficiency.”annalsofclinicalbiochemistryonlinefirst，2015年3月2日公开)。在一些实施例中，该方法包括投与足以调节、例如相对于基线值降低尿液中以下中的一或多者的含量的量的医药活性成份：3β-磺氧基-7β-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-ca)、甘氨酸结合的3β-磺氧基-7β-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-cg)及牛磺酸结合的3β-磺氧基-7β-n-乙酰基葡萄糖氨基-5-胆烯-24-酸(snag-δ⁵-ct)。

6.3.4.2.治疗效应

在一些实施例中，本公开内容的方法对npc的一或多种症状具有有益效应。

用以表征及量化npc疾病进展的一种测量方法是通过使用npc严重程度量表，其测定九个主要域(活动、认知、眼运动、精细动作技能、听力、记忆力、癫痫、言语及吞咽)及八个次要域(听性脑干反应、行为、痴笑性猝倒症、反射亢进、失禁、嗜睡病、精神病及呼吸问题)中的临床体征及症状(yanjanin等人，“linearclinicalprogression,independentofageofonset,inniemann-pickdisease,typec,”am.j.med.genet.partb153b:132-140(2010))(“yanjanin2010”)。整体临床严重程度评分(或“整体评分”)是主要及次要域中的每一者的所有评价的总计，且通过所有个别域评分之和来确定。参见下表1；亦参见图1。

*评分是这两个子部分内的相加

**pta＝纯音听阈均值-报告于听力图上

在一些实施例中，该方法包括维持或降低选自以下的npc严重程度量表的一或多个域评分：活动、精细动作技能、认知、言语、吞咽、眼运动、记忆力、听力、癫痫、听性脑干反应、行为、痴笑性猝倒症、反射亢进、失禁、嗜睡病、精神病及呼吸问题。在一些实施例中，该方法包括维持或降低选自以下的npc严重程度量表的一或多个域评分：活动、精细动作技能、认知、言语、吞咽、眼运动、记忆力、听力及癫痫。在一些实施例中，该方法包括维持或降低选自以下的npc严重程度量表的一或多个域评分：活动、精细动作技能、认知、言语、吞咽、记忆力及癫痫。在一些实施例中，该方法包括维持或降低选自以下的npc严重程度量表的一或多个域评分：活动、精细动作技能、认知及吞咽。

在一些实施例中，改良患者的病况的治疗包括降低与基线评分相比npc严重程度量表的一或多个域的评分。在一些实施例中，与基线评分相比，评分降低在以下范围内：约20％至约95％，例如约30％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约90％至约95％；例如约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％；例如约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、约60％至约80％、约70％至约80％；例如约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％、约50％至约70％、约60％至约70％；例如约20％至约60％、约30％至约60％、约40％至约60％、约50％至约60％；例如约20％至约50％、约30％至约50％、约40％至约50％；例如约20％至约40％、约30％至约40％；或约20％至约30％。举例而言，与基线评分相比，评分降低可为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。

在一些实施例中，目标方法将一或多个域的评分相对于基线值降低20％±5％、25％±5％、30％±5％、35％±5％、40％±5％、45％±5％、50％±5％、55％±5％、60％±5％、65％±5％、70％±5％、75％±5％、80％±5％、85％±5％、90％±5％或95％±5％。

在一些实施例中，目标方法将一或多个域的评分相对于基线值降低20％±3％、25％±3％、30％±3％、35％±3％、40％±3％、45％±3％、50％±3％、55％±3％、60％±3％、65％±3％、70％±3％、75％±3％、80％±3％、85％±3％、90％±3％、95％±3％或97％±3％。

在一些实施例中，目标方法将一或多个域的评分相对于基线值降低20％±2％、25％±2％、30％±2％、35％±2％、40％±2％、45％±2％、50％±2％、55％±2％、60％±2％、65％±2％、70％±2％、75％±2％、80％±2％、85％±2％、90％±2％、95％±2％或97％±2％。

在一些实施例中，改良患者的病况的治疗包括降低与基线整体评分相比npc严重程度量表的整体评分。在一些实施例中，与基线整体评分相比，整体评分降低在以下范围内：约20％至约97％，例如约25％至约97％、约30％至约97％、约35％至约97％、约40％至约97％、约45％至约97％、约50％至约97％、约55％至约97％、约60％至约97％、约65％至约97％、约70％至约97％、约75％至约97％、约80％至约97％、约85％至约97％、约90％至约97％；例如约20％至约95％、约25％至约95％、约30％至约95％、约35％至约95％、约40％至约95％、约45％至约95％、约50％至约95％、约55％至约95％、约60％至约95％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％；例如约20％至约90％、约25％至约90％、约30％至约90％、约35％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％、约50％至约90％、约55％至约90％、约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约85％至约90％；例如约20％至约85％、约25％至约85％、约30％至约85％、约35％至约85％、约40％至约85％、约45％至约85％、约50％至约85％、约55％至约85％、约60％至约85％、约65％至约85％、约70％至约85％、约75％至约85％、约80％至约85％；例如约20％至约80％、约25％至约80％、约30％至约80％、约35％至约80％、约40％至约80％、约45％至约80％、约50％至约80％、约55％至约80％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％；例如约20％至约75％、约25％至约75％、约30％至约75％、约35％至约75％、约40％至约75％、约45％至约75％、约50％至约75％、约55％至约75％、约60％至约75％、约65％至约75％、约70％至约75％；例如约20％至约70％、约25％至约70％、约30％至约70％、约35％至约70％、约40％至约70％、约45％至约70％、约50％至约70％、约55％至约70％、约60％至约70％、约65％至约70％；例如约20％至约65％、约25％至约65％、约30％至约65％、约35％至约65％、约40％至约65％、约45％至约65％、约50％至约65％、约55％至约65％、约60％至约65％；例如约20％至约60％、约25％至约60％、约30％至约60％、约35％至约60％、约40％至约60％、约45％至约60％、约50％至约60％、约55％至约60％；例如约20％至约55％、约25％至约55％、约30％至约55％、约35％至约55％、约40％至约55％、约45％至约55％、约50％至约55％；例如约20％至约50％、约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％、约40％至约50％、约45％至约50％；例如约20％至约45％、约25％至约45％、约30％至约45％、约35％至约45％、约40％至约45％；例如约20％至约40％、约25％至约40％、约30％至约40％、约35％至约40％；例如约20％至约35％、约25％至约35％、约30％至约35％；例如约20％至约30％、约25％至约30％；或例如约20％至约25％。举例而言，与基线整体评分相比，npc严重程度量表的整体评分的降低可为约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约97％。

在一些实施例中，目标方法将整体评分相对于基线整体值降低20％±5％、25％±5％、30％±5％、35％±5％、40％±5％、45％±5％、50％±5％、55％±5％、60％±5％、65％±5％、70％±5％、75％±5％、80％±5％、85％±5％、90％±5％或95％±5％。

在一些实施例中，目标方法将整体评分相对于基线整体值降低20％±3％、25％±3％、30％±3％、35％±3％、40％±3％、45％±3％、50％±3％、55％±3％、60％±3％、65％±3％、70％±3％、75％±3％、80％±3％、85％±3％、90％±3％、95％±3％或97％±3％。

在一些实施例中，目标方法将整体评分相对于基线整体值降低20％±2％、25％±2％、30％±2％、35％±2％、40％±2％、45％±2％、50％±2％、55％±2％、60％±2％、65％±2％、70％±2％、75％±2％、80％±2％、85％±2％、90％±2％、95％±2％或97％±2％。

在一些实施例中，保持患者的病况恒定的维持期包括与基线评分相比将npc严重程度量表的域的评分保持在一定范围内。在一些实施例中，评分的维持是指在基线值下的评分的约15％内、例如约10％或约5％内的评分。

在一些实施例中，目标方法产生相对于基线评分在5％±3％、10％±3％或15％±3％内的评分。在一些实施例中，目标方法产生相对于基线评分在5％±2％、10％±2％或15％±2％内的评分。

在一些实施例中，保持患者的病况恒定的维持期包括与基线整体评分相比将npc严重程度量表的整体评分保持在一定范围内。在一些实施例中，整体评分的维持是指在基线值下的整体评分的约15％内、例如约10％或约5％内的整体评分。

在一些实施例中，目标方法产生相对于基线整体评分在5％±3％、10％±3％或15％±3％内的整体评分。在一些实施例中，目标方法产生相对于基线整体评分在5％±2％、10％±2％或15％±2％内的整体评分。

可用于表征本公开内容的方法的效能的其他量度包括整体域，其包括治疗后变化的盲化临床医师临床整体印象(cgi-临床医师)或变化的照护者临床整体印象(cgi-照护者)、计时起走(tug)测试、9孔柱测试(9-hpt)及生活质量量度(例如美国国立卫生研究院(unitedstatesnationalinstitutesofhealth)promis-pro(患者报告结果测量信息系统-患者报告结果)照护者生活质量分级)。

本公开内容的方法可通过临床安全性量度表征，该量度包括以下中的一或多者：临床不良事件的表征及严重程度；听力学测试，例如通过baer测试；临床实验室测试，例如血液学、临床化学、凝固、尿分析、csf分析；生命征象；身体及神经检查发现；及心电图。

6.3.5.其他溶酶体储存病症的治疗

如实例8中所展现(参见章节5.8.2.5)，本文所述羟丙基β-环糊精混合物对与自体吞噬有关的基因具有显著效应，表明本文所述医药活性成份及医药组合物将有效改善其他溶酶体储存病症中的缺陷的某些后果。

因此，在另一方面中，提供治疗除c型尼曼-匹克病(npc)外的溶酶体储存病症的方法，其包括向具有除npc外的溶酶体储存病症的个体投与治疗有效量的如本文所述医药组合物。

在各个实施例中，溶酶体储存病症选自天冬氨酰葡糖胺尿症、沃尔曼病(wolmandisease)、胱氨酸病、达农病(danondisease)、法布瑞氏病(fabrydisease)、法伯病(farberdisease)、岩藻糖苷贮积症、高雪氏病(gaucherdisease)、i/ii/iii型gm1-神经节苷脂贮积病、gm2-神经节苷脂贮积病、i/ii型α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、异染性脑白质营养不良、i/ii型唾液酸贮积症、iv型黏脂贮积病、施艾氏症候群(scheiesyndrome)、亨特氏症候群(huntersyndrome)、圣菲利波症候群a(sanfilipposyndromea)、圣菲利波症候群b、圣菲利波症候群c、圣菲利波症候群d、i/ii型半乳糖唾液酸苷贮积症、克拉贝病(krabbedisease)、桑德霍夫病(sandhoffdisease)、伏-施二氏病(vogt-spielmeyerdisease)、贺勒氏症候群(hurlersyndrome)、除c型尼曼-匹克病外的尼曼-匹克病、i细胞疾病(黏脂贮积病ii)、拟-贺勒氏多处营养不良、穆尔丘症候群(morquiosyndrome)、马罗托-拉米症候群(maroteaux-lamysyndrome)、斯莱症候群(slysyndrome)、ix型黏多糖贮积症、多发性硫酸脂酶缺乏症、巴登氏病(battendisease)、塔伊-萨克斯病(tay-sachsdisease)、庞贝氏病(pompedisease)、婴儿晚期北方癫痫(northernepilepsy)、致密成骨不全症、辛德勒病(schindlerdisease)、唾液酸尿症及扎拉病(salladisease)。

在某些实施例中，溶酶体储存病症是塔伊-萨克斯病、鞘脂类代谢障碍、高雪氏病、黏脂贮积病、半乳糖唾液酸苷贮积症、扎拉病症、胱氨酸病、达农病、法布瑞氏病、法伯病、脂褐质贮积症、庞贝氏病、神经节苷脂贮积病、issd、克拉贝病、除npc外的尼曼-匹克病、脑白质营养不良、贺勒氏病(hurlerdisease)、施艾氏病(scheiedisease)、亨特氏病(hunterdisease)、圣菲利波病(sanfilippodisease)、桑德霍夫病、辛德勒病、巴登氏病症或沃尔曼病。

在又一实施例中，溶酶体储存病症是除npc外的尼曼-匹克病、塔伊-萨克斯病、法布瑞氏病、法伯病、圣菲利波病、巴登氏病症或沃尔曼病。

7.实例

提供以下实例以进行示例和说明，而非予以限制。

7.1.实例1：c型尼曼-匹克病的i期临床试验

由nih使用市售非经肠级羟丙基β-环糊精混合物根据以下方案启动1期临床试验。

7.1.1.方案

在由nih执行的此1期非随机化、开放标记、单中心研究中，经由腰注射向3名患者的未用药队列各自以200mg的初始剂量、之后递增至300mg、400mg及900mg经鞘内投与羟丙基β-环糊精(hpb,roquette)。队列中的所有患者(每个队列3名患者)皆每月一次接受hp-β-cd达至少两个剂量，且剂量递增的决定是基于安全性及生物化学数据。随后剂量递增是以高达300mg的增量实施。通过不良事件(ae)、听力学评估、临床实验室测试、生命体征、体检、胸部x射线及心电图(ecg)评价安全性。通过血浆24(s)-hc自基线的变化测量生物化学效能。评价血浆hp-β-cd的pk。

7.1.2.药物产品(hpb)

此i期临床试验中所用的羟丙基β-环糊精产品是hpb(roquette,france)，dsa为约4.34±10％。

7.1.3.纳入准则

患者合格性纳入准则是：

1)在入选时年龄大于或等于2岁且小于或等于25岁，任一性别及任何族群。

2)基于以下中的一者的npc1的诊断：

a)两个npc1突变；

b)阳性非律平(filipin)染色及至少一个npc1突变；

c)垂直核上性凝视麻痹(vsngp)与以下中的任一者的组合：

i)一个npc1突变，或

ii)阳性非律平染色及无npc2突变。

3)具有npc1的至少一种神经表现的患者。举例而言但不限于，听力损失、垂直核上性凝视麻痹、共济失调、失智症、肌张力障碍、癫痫、发音困难或吞咽困难。

4)重复行进至nihcc进行评估及随访的能力。

5)若服用麦格司他，则患者必须在基线评估之前服用药剂的恒定剂量达不小于3个月并必须愿意在试验的持续时间内维持该剂量值。

6)愿意中断所有非处方补充物，适龄的多种维生素除外。

7)育龄女性必须愿意在试验的持续时间内使用有效避孕方法。

8)愿意参与试验设计的所有方面，包括连续血液及csf采集。

7.1.4.排除准则

患者合格性排除准则：

1)在入选试验时年龄低于2岁或高于25岁。

2)若个体的重量对于盐水或药物投药将产生将超过0.2eu/kg的内毒素含量，则排除该个体。

3)将干扰患者遵从此方案的需求的能力的npc1的严重表现。

4)神经学上无症状患者。

5)已接受任何形式的环糊精以试图治疗npc1的患者。利用含有环糊精作为赋形剂的另一药物制剂治疗另一医学适应症将不会排除患者。

6)对环糊精或调配物的组份有过敏性反应病史。

7)在研究期间的任何时间怀孕或母乳哺育。

8)怀疑cns感染或任何全身性感染的患者。

9)将影响实施腰穿刺的能力的脊柱畸形。

10)腰区中皮肤感染。

11)嗜中性球减少症，定义为绝对嗜中性球计数(anc)小于1,500。

12)血小板减少症(血小板计数小于75,000/立方毫米)。

13)csf循环紊乱的证据。

14)麻醉的禁忌。

15)先前使用抗凝剂或具有临床出血的增加风险或inr大于2的出血病症的病史/存在。

16)具有含黄疸或右上腹疼痛的症状的急性肝病的临床证据的患者。

17)存在贫血，定义为对于年龄及性别的两个标准偏差低于正常。

18)对于18岁及更大的个体，自动计算egfr且由nihcc实验室利用ckd-epi肌酸酐2009方程报告。若egfr小于或等于60ml/min/1.73m2，则排除大于或等于18岁的个体。对于<18岁的个体，利用nkdep计算器(http://www.nkdep.nih.gov/lab-evaluation/gfr-calculators/children-conventional-unit.shtml)。结果报告为>75ml/min/1.73m2或更低。若egfr小于或等于7515ml/min/1.73m2，则排除<18岁的个体。

19)单一尿分析时血尿，如由americanurologicalassociation(aua)定义为在显微镜评估自适当采集的尿分析样品的尿沉降时每个高倍视野五个或更多个红血球(或>25/microl)。若2个后续尿液样品如由aua定义呈血尿阴性，则将不排除患者。

20)蛋白尿(尿分析时1+蛋白质)，由患者的主要医疗提供者或nih肾脏病学会诊评估且分类为良性或在正常尿液蛋白肌酸酐比率的背景下及在不存在临床症状(水肿、高血压)下除外。

21)活动性肺病、氧需求或血氧饱和度降低的临床显著病史、肺疗法或需要主动抽吸。

22)不能完成行为听力学评估(包括纯音临限值评价(500hz至8000hz))以监测耳毒性及oae在基线处不能容易地获得的患者。

23)具有进行性癫痫、在入选之前2个月内频率、类型或持续时间不稳定、在入选之前2个月内需要改变抗癫痫医药的剂量(针对重量进行的调节除外)、或需要3个或更多个抗癫痫医药以控制癫痫的患者。

24)在研究者的观点下不能遵从方案或具有将潜在增加参与风险的特定健康问题的患者。

7.1.5.临床数据的初始分析

如下分析此研究的初始数据与亦使用hpb的鞘内投与的另一机构处的个别ind(“i-ind”)的额外数据：

7.1.5.1.初始数据的分析的概述

我们进行了分析以检查包括nih个体及另一机构处i-ind研究的三个个体的数据组中的npc临床严重程度评分及其主要域的变化率。下文列举主要发现：

在比较表2及表3(参见下文)时，药物剂量影响npc临床严重程度评分及其域的变化率，在听力中观察到最大变化。

环糊精通常降低npc临床严重程度评分及其组成部分的减少速率(表4)(下文)。这对于所有组成部分都适用，除了眼运动、听力及癫痫。

在将环糊精的比较限于对nih个体的nih自然史研究时(表5)，型式亦与以较慢速率减少的环糊精组一致，除了眼运动。

i期临床试验数据的初始分析的结果概述于图2-3中。

7.1.5.2.分析方法

以下分析的目标是了解12个nih1期研究个体(以“cda”开始鉴别)及3个来自另一地点的亦接受hpb的鞘内治疗的个体(以“i-ind”开始鉴别)中随时间的变化。以下结果是基于15个接受羟丙基β-环糊精的个体。以下分析中不包括个体cda113及cda114，因为他们尚未接受羟丙基β-环糊精的剂量。15个个体中的四(4)个具有基线及6个月时的可用数据(个体cda110、cda111、cda112及i-ind-3)；其余11个个体具有基线、6个月及12个月时的可用数据(cda101-cda109、i-ind-1)。

我们使用了线性混合模型以获得随时间的变化的估计斜率。混合于“线性混合模型”中的词语用于表示模型包括“固定”及“随机”效应的事实。模型的“随机”部分解释关于每一个体的重复测量或数据的纵向性质。模型的“固定”部分提供随时间的平均变化、亦即变化的斜率的估计。此方法是有利的，因为其利用所有收集数据且相互作用项容许对组中的不同变化率进行研究。假设未结构化相关矩阵拟合此模型，这意味着关于多个测量之间的相关性未进行假设且估计每一相关性。在未来分析中，可向下文模型添加共变量以研究共变量(例如剂量)的效应。

我们计算了此分析中提供的每一模型的消退诊断且使用了cook’sd以鉴别潜在离群值/有影响的观察，从而重新拟合模型，其中鉴别出离群值/有影响的观察(注意：离群值/有影响的观察定义为cook’sd值为0.4或更大的观察)。我们选择cook’sd作为目标诊断，因为其包括结果及任何共变量以鉴别潜在离群值。在鉴别离群值时，提供两组模型；所提供的第一模型是基于全数据组，而第二组模型是基于去除离群值的数据。对于此分析，我们去除了所有i-ind-1个体的值而非仅基线值。这些值存于表2及表3的最后两栏中。注意，自该两个分析获得的结果可极为不同，因为模型中包括1期研究中的15个个体的相对较小样本大小及总计41个观察(在包括全数据组时)。

我们还使用相同方法以比较1期个体与nih自然史数据组。nih自然史数据组描述于yanjanin等人，“linearclinicalprogression,independentofageofonset,inniemann-pickdisease,typec,”am.j.med.genet.partb153b:132-140(2010)中。

对于本文提供的分析，我们将基本模型拟合至接受环糊精的个体(提供于表2中)。对于此分析，我们提供在一年的时段内相应npc结果的估计变化。在表3中，我们提供在控制时对于所接收剂量随时间的平均变化的结果。表4及表5提供比较环糊精个体与nih自然史研究中相当年龄范围内的个体的模型。所提供结果是两组中的每一者的估计斜率及用于测试两组之间的斜率的相等性的p值。

7.1.5.3.接受环糊精的个体随时间的变化

表2提供15个接受至少一个剂量的环糊精的个体的整体npc评分及其组成部分中的每一者的平均斜率。这些结果提供关于一年内结果的变化率的信息。这些比率小于先前分析中提供的全自然史群体中观察到的那些。注意：我们去除了1个具有31的总评分、去除听力的31的总评分、4的活动、3的吞咽、4的精细动作及4的认知的i-ind个体的基线数据。总之，此个体随时间改良。另外，1个nih个体是眼运动分析中的离群值，由于其在此域中5的高值。全数据组的分析提供于第2及3栏中且在去除离群值时获得的结果提供于第4及5栏中。

表3含有包括剂量作为模型的部分的分析结果。这些模型提供关于药物的剂量的效应的信息。在检查听力时注意该效应。在模型中包括剂量时，随时间的变化的斜率不再显著。

7.1.5.4.1期及i-ind个体与自然史研究中相应个体的比较

为更好地了解环糊精的效应，我们比较了1期及i-ind研究中的个体与nih自然史研究中年龄相当的个体。对于此比较，我们将数据组限于具有超过数据的单一时间点且年龄在6岁与26岁之间的个体。我们用模型中的时间、治疗组及时间乘以治疗组的相互作用项拟合混合模型。下表4提供此分析的结果。

表4中提供的结果与和与自然史群体相比环糊精组的较慢变化率一致，只是眼运动及听力亚域除外。

7.1.5.5.1期个体与自然史研究中的相应个体的比较

为更好地了解环糊精在nih群体内的效应，我们比较了1期研究中的个体与自然史研究中年龄相当的个体。对于此比较，我们将数据组限于具有超过数据的一个时间点且年龄在6岁与26岁之间的个体。我们将混合模型与模型中的时间、治疗组及时间乘以治疗组的相互作用项拟合。下表提供这些分析的结果，其类似于表4中的那些。注意，癫痫结果稍微不稳定且具有若干离群值。仅提供全数据组结果。除了眼运动之外，环糊精组中的所有比率皆小于自然史研究中观察的那些。

7.1.5.6.仅比较曾经使用麦格司他的个体的分析

下文提供的结果包括在时间段期间使用麦格司他的个体。此包括自然史研究的8个个体及1期研究的14个个体。我们随后对于此群体重新运行表4中提供的分析。这些结果提供于下表6中。

下表7提供仅包括nih个体的结果。对于此比较去除i-ind的三个个体。此处提供的结果类似于上表5中提供的那些。两个群体之间的差异在于自群体中去除自然史研究中的5个nih个体及1期研究中的1个nih个体，因为这些个体在任何时间点皆没有报告麦格司他的使用。

7.1.6.临床数据的其他分析

对相同nih临床试验数据组进行其他分析，其中上述分析中不包括的对照数据组中包括4个数据点。这些分析概述于图4、5、6及8中。

7.2.实例2：药物产品的标准分析

实例i中所述的i期临床试验中所用的羟丙基β-环糊精产品是hpb(roquette,france)，且dsa为约4.34±10％。如由制造者进行的hpb的两个示例性批次的标准分析示于以下4页上。

hpb亲代级(示例性批次1)第1/2页

定义：

羟丙基β环糊精(hydroxypropylbetadex)是β环糊精(betadex)的部分取代聚(羟丙基)醚。

cas编号：128446-35-5

einecs：420-920-1

inci：羟丙基环糊精

规范：

a)特征

外观白色或几乎白色，非晶形或结晶粉末。

溶解性易溶于水及丙二醇中。

b)鉴别

鉴别-测试aep-usp/nf参见测试

鉴别-测试bep-usp/nf参见测试c)测试

红外ep-usp/nf一致

溶液中的外观ep-usp/nf澄清，无色

电导率ep-usp/nf200μs/cmmax.

相关物质

*顺从性数据-未进行测试

**监测计划

hpb亲代级(示例性批次2)第2/2页

-微生物污染：

典型值：

摩尔取代标称值0.62

摩尔取代(ms)0.58-0.68

粒径：筛

-315mic上的残余物。20％max

-100mic上的残余物。50％max注释：

由roquette使用的方法可为ep或usp或内部验证方法，已将其与药典专论进行比较。

此物质适用于制造非经肠制剂。

一致性：

当前药典：e.p.(1804)及u.s.p/n.f。

储存：

-保藏在充分密封的容器中。

-吸湿性产品：在控制室条件下操作。

重新测试日期：

-在其初始包装中3年。

*顺从性数据-未进行测试

**监测计划

7.3.实例3：羟丙基β-环糊精混合物的hplc分离

使用各种层析方法以评价市售非经肠级羟丙基β-环糊精医药组合物hpb(其多个批次用于i期临床试验中)中的环糊精混合物的复杂性。

7.3.1.cd-筛选管柱

使用欧洲药典专论第1804号(hydroxypropylbetadex)(于2009年1月1日修订)的hplc方法以分离市售kleptose(roquette)中的组份。

hplc条件：固定相：cd-筛选，粒径5μm(chiroquest)，管柱：l＝250mm，温度：30℃。移动相：移动相a：水；移动相b：水:甲醇(10:90v/v)。流速：1.0ml/min；检测：alltech3300蒸发性光散射检测器；载体气体：氮；流速：1.5l/min；蒸发器温度：70℃；注射：20μl。

梯度程序(欧洲药典方法)：

图9绘示cd-筛选hplc方法中hbp(dsa＝4.2)羟丙基β-环糊精的结果。物质以增加ds的次序洗脱。未经取代的β-环糊精于约5min时洗脱，且经单取代的羟丙基β-环糊精于约6min时洗脱。图10绘示使用具有甲醇及乙腈溶剂梯度的cd-筛选管柱的羟丙基β-环糊精的比较层析图(利用甲醇的梯度：0min30％b，40min100％b；利用乙腈的梯度：0-5min18％b，25min40％b。其他方法参数保持不变)。滞留时间根据溶剂强度及移动相的极性变化。

质谱检测方法：利用6460三相四极柱质谱仪的agilent1260hplc。agilentjetstream电喷雾离子化(esi)来源，负性模式，m/z500-3000；碎裂器电压：35v，来源参数：气体温度：300℃，气体流速：13l/min，雾化器：60psi，鞘层气体流速：11l/min，鞘层气体温度(加热器)：400℃，毛细管电压：3500v。施加甲酸铵缓冲液(0.1m，ph＝6.0)代替移动相中的水用于hplc-ms测量。

图11显示hplc-ms分析的试样的萃取离子层析图。bcd＝未经取代的β-环糊精；dsx＝ds为x的羟丙基β-环糊精。举例而言，“ds3”是指具有ds＝3的羟丙基β-环糊精。

7.3.2.反相c18层析

分析hbp(roquette)(与章节5.3.1中所用相同的批次)。向分析管柱(4mm×250mm)填充lichropreprp18硅胶。一组测试条件包括以下：固定相：lichropreprp18硅胶，粒径25-40μm(merck)，管柱：l＝250mm，温度：30℃。移动相：移动相a：水；移动相b：水:甲醇r(10:90v/v)。梯度程序使用以下条件：0min以10％移动相b梯度至20min以100％移动相b。流速：1.0ml/min；检测：alltech3300蒸发性光散射检测器；载体气体：氮；流速：1.5l/min；蒸发器温度：70℃。

图12显示c18固定相上hpb(dsa＝4.2)的典型hplc层析图。图13显示使用利用甲醇及乙腈溶剂梯度的lichrospherec18管柱的羟丙基β-环糊精的比较层析图。(利用甲醇的梯度：0min10％b，15min30％b，40min80％b。利用乙腈的梯度：0min5％b，40min80％b。方法的其他参数不变)。

使用如章节5.3.1中所述的质谱条件。图14显示来自hplc-ms分析的具有不同ds的羟丙基β-环糊精的萃取离子层析图。

7.3.3.亲水相互作用液相层析(hilic)

亲水相互作用液相层析(hilic)使用亲水固定相与通常用于反相层析的洗脱液。该方法使用液-液分配层析原理，使得分析物可以增加极性的次序洗脱。本文所述方法使用含有键合至硅胶表面的氨基丙基的氨基管柱。

分析hbp(roquette)(与章节5.3.1中所用相同的批次)。hplc条件：固定相：nucleosilnh2，粒径5μm(machereynagel)，管柱：l＝250mm，温度：30℃。移动相：移动相a：乙腈-水(80:20v/v)；移动相b：水。流速：1.0ml/min；检测：agilent385蒸发性光散射检测器；载体气体：氮；流速：1.2l/min；蒸发器温度：50℃；雾化器温度：30℃。

图15显示在nucleosilnh2管柱上使用hilic方法的羟丙基β-环糊精的分离。

质谱条件与章节5.3.1中所述那些相同。图16显示来自hplc-ms分析的具有不同ds的羟丙基β-环糊精的萃取离子层析图。bcd＝未经取代的β-环糊精；dsx＝ds为x的羟丙基β-环糊精。举例而言，“ds3”是指具有ds＝3的羟丙基β-环糊精。在此hplc方法中，首先洗脱出较高ds取代的羟丙基β-环糊精。

7.3.4.硅胶层析

分析kleptose(roquette)(与章节5.3.1中所用者相同的批次)。hplc方法：固定相：lichrospheresi-60，粒径5μm(merck)，管柱：l＝250mm，温度：30℃。移动相：移动相a：乙腈-0.1m甲酸铵ph＝7.5(80:20v/v)；移动相b：0.1m甲酸铵ph＝7.5。流速：1.0ml/min；检测：agilent385蒸发性光散射检测器；载体气体：氮；流速：1.2l/min；蒸发器温度：50℃；雾化器温度：30℃。

图17显示使用lichrospheresi60管柱的羟丙基β-环糊精的组份的分离。在此情况下，将β-环糊精掺入试样中以有利于检测。

质谱条件与章节5.3.1中所述那些相同。图18显示具有不同ds的羟丙基β-环糊精的萃取离子层析图。bcd＝未经取代的β-环糊精；dsx＝ds为x的羟丙基β-环糊精。举例而言，“ds3”是指具有ds＝3的羟丙基β-环糊精。在此hplc方法中，首先洗脱出较高ds取代的羟丙基β-环糊精。

7.4.实例4：改良的分析方法

7.4.1.气相层析

用于测定羟丙基β环糊精中的丙二醇(pg)含量的官方欧洲药典专论方法具有相对于hpbcd仅约0.5％的量化极限。因此，需要更灵敏的分析方法，且研发具有经修改试样制备的改良方法(与欧洲药典羟丙基β环糊精分析(专论号：1804，于2009年1月1日修订)相比)。此方法用于量化0.01％水平(相对于hpbcd)下的pg，这是远大于欧洲药典方法中的检测极限的灵敏性。

方法的条件如下：装置：气相层析仪：shimadzugc-17a；检测器：火焰离子化检测器(fid)；注射器：shimadzuaoc-5000自动注射器；软件：shimadzuclass-vp7.4版；气体：载体气体：氦(99.999％)，其他气体：氮(99.999％)，合成空气(99.999％)，氢(来自whatman氢生成器)。

管柱：supelcosupercowax-10(30m×0.32mm×1.0μm)

丙二醇滞留时间约6.35min；内标准品乙二醇滞留时间约7.15min。

5个校正点：在0.1mg/ml与2mg/ml之间，对应于0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％与hpbcd相关的pg。

自约200mg丙二醇的溶液制备校正原液，将其精确称重至10ml有刻度的玻璃烧瓶中并用纯化水填充至标记(表14)。为获得下表中所列举的浓度，进行适当稀释。一旦达到目标浓度(参见下表14)，将1ml此溶液、100μl内标准品溶液(ist)、500mgnacl及1ml水添加于螺旋盖小瓶中并将溶液用1ml二氯甲烷(dcm)萃取。自有机相收获试样并直接注射。

使用校正溶液kal2以通过实施五个平行测量来测定系统适合性(需求：rsd<5％-pg及eg的面积比的rsd)。

萃取空白试样：将1mldcm添加至0.1mlist溶液、500mgnacl及2ml蒸馏水中，随后剧烈搅拌0.5min，并静置。在分离各相后，向小瓶中放入约0.2mldcm相。

试样分离：将1mldcm添加至螺旋盖小瓶中的1.0ghpbcd试样、0.1mlist溶液、500mgnacl及2ml蒸馏水中并剧烈搅拌0.5min，并静置。在分离各相后，向小瓶中放入约0.2mldcm相。含有约0.18％pg的kleptose(roquette)试样的代表性层析图绘示于图25中。

通过绘制校正曲线计算hpbcd试样的丙二醇(pg)含量，该校正曲线展示随pg/eg峰面积变化的丙二醇/乙二醇(pg/eg)重量浓度比(weigh-inconcentrationratio，mg/ml)。在hpbcd试样中，未知参数是自其他三个因子及校正曲线的方程推出的pg含量。

用以分离单丙二醇与其二-及三取代的衍生物的方法的适合性示于图26中。过取代的二醇显示若干峰且由于较高沸点稍后洗脱出。在起始材料及最终试样中测试二-及三丙二醇含量。

通过测试如表14中所述pg浓度的5个试样(在0.1mg/ml与2mg/ml之间，对应于0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％与hpbcd相关的pg)证明方法的线性。一式三份地分析每一试样以评价方法的精确度。表15概述精确度及线性分析的实验数据。校正组的线性曲线绘示于图27中。

pg＝丙二醇；eg＝乙二醇；rsd＝相对标准偏差。

表15中的数据显示方法在0.01-0.2％pg含量范围内是线性的。

7.4.2.分析型hplc

利用欧洲药典7.8(羟丙基β环糊精，专论号：1804，于2009年1月1日修订)中的hplc方法且如章节5.3.1中所述测定残余bcd(未经取代的β-环糊精)含量、取代度为1的hpbcd分数及除bcd外的环糊精(cd)相关杂质的总和。亦利用相同方法记录物质的分布指纹。

7.4.3.nmr

自¹h-nmr谱自羟丙基中的甲基的三个质子的信号与附接至脱水葡萄糖单元的c1碳的质子(变旋异构质子)的信号的比率计算平均取代度(dsa)。

自¹hnmr测量约1.2ppm(a)处甲基的双峰及+5ppm与+5.4ppm(b)之间的变旋异构质子的信号的峰面积。示例性谱示于图28中。作为参照，将变旋异构质子的峰面积设定为7.0，因为7个质子提供β-环糊精衍生物中的此峰。遵循参照峰的分配，使用以下表达计算平均取代度：dsa＝a/3。

7.4.4.胆固醇溶解分析

如下进行活体外胆固醇溶解分析。于室温下搅拌蒸馏水中的羟丙基β-环糊精混合物测试溶液，随后添加过量未酯化胆固醇，使得一定量的胆固醇保持未溶解。24小时后，过滤出固体，且通过hplc方法测量溶液中存在的胆固醇。

hplc条件：分析管柱：nucleosil120，c8，5μm，100mm×4.0mm(machereynagel)；管柱温度：40℃；移动相：乙腈:水＝78:22；流速：1.5ml/min；注射体积：20μl；检测器：uv210nm；停止时间：5min。

通过将10mg胆固醇称重并转移至10ml乙腈/异丙醇(75:25)中制备胆固醇的原液。通过将原液用hplc移动相稀释10倍(以产生0.1mg/ml的浓度)制备胆固醇的参照溶液。

在过滤后，将用于溶解性实验的试样用乙腈稀释两倍，且若需要，使用额外hplc移动相用于进一步稀释。

利用以下方程测定溶解胆固醇的浓度：

胆固醇浓度(mg/ml)＝(面积s/面积r)×concr

面积s＝来自试样溶液的层析图的胆固醇的峰面积

面积r＝来自参照溶液的层析图的胆固醇的峰面积

concr＝校正标准溶液中的sbecd-ws的浓度(mg/ml)。7.5.实例5：电喷雾ms分析

如上文实例2中所论述，hpb的平均摩尔取代为0.58-0.68(dsa4.06-4.76)，其中两个代表性批次的平均摩尔取代为0.62(dsa4.34)。cyclo^tm(一种自不同制造商购得的羟丙基β-环糊精组合物)具有约0.91的较高的报告平均摩尔取代(dsa6.37)。

由两个实验室对hpb及cyclo^tm(ctdholdings,inc.)的市售试样进行电喷雾质谱分析。

由第一实验室使用的方法如下。将约50μg羟丙基β-环糊精(“hpbcd”)试样溶解于1ml80％甲醇水溶液中的1％甲酸中。将此hpbcd溶液输注至api-4000质谱仪(appliedbiosystems)中。自m/z1100至2000对ms扫描施加正离子电喷雾模式。记录ms谱(10-15次平均扫描)。测量β-环糊精的环氧丙烷加成产物的每一信号高度且自个别信号高度的总和计算hpbcd的环氧丙烷加合物群体。使用analyst1.51软件(appliedbiosystems)进行ms操作。如图29中所示，第一实验室的电喷雾ms数据表明，平均摩尔取代差异是由hpb(图29a)及(图29b)中的羟丙基取代的显著不同程度及分布引起。向谱添加数字以鉴别每一峰中的羟丙基部分的数目。

由第二实验室使用的方法如下。将试样在水中以1mg/ml制备且在1:1水:乙腈中稀释至约5μm用于电喷雾。使用agilentnanospray来源利用600nl/min的直接输注速率(于150℃下的鞘层气体且流速为5l/min且vcap电位为1500v)形成离子。针对最佳信号强度调节esi来源与离子迁移漂移管之间的界面的电位。将谱于单一电位下跨越漂移管累积3min，且明确显示电喷雾烟流中多种种类的离子之间的离子迁移分离。所用分析仪是agilent6560(一种线性低场离子迁移质谱仪)，且可将其视为agilentq-tof的经实质性修改的形式，其在ms取样孔口处容纳im漂移管且采用离子漏斗技术。图30中所示的第二实验室的电喷雾ms数据确认取代指纹的差异(比较图30a(hpb)与30b该数据也确认电喷雾ms是足够稳健的分析工具，其可由不同实验室常规使用以可重现地采取羟丙基β-环糊精组合物的指纹。

图31比较由两个不同实验室(图31a及31b，第二实验室；图31c，第一实验室)实施的三个不同批次的hpb的电喷雾ms数据，且表明了取代指纹在批次间几乎相同。取代指纹的低批次间变化与以下观察一致：平均摩尔取代在hpb的两个示例性批次之间相同，如上文实例2中所论述。图32提供由两个不同实验室(图32a，第一实验室；图32b，第二实验室)使用与用于产生图31a及31b中所示的kleptose数据相同的条件进行的的两个不同批次的电喷雾ms谱，且表明取代指纹存在显著批次间变化。

图33显示来自第二实验室的电喷雾ms谱，其中与图29-32相比，y轴扩展以显示1090m/z与1230m/z之间的峰。图33a是自获得的谱。图33b是自hpb获得的谱。这些谱图显示在(丙二醇峰标记于图33a中)中而非hpb中存在大量丙二醇。hpb具有较小但可检测量的未经取代的环糊精，由图33b中标记的峰显示。

图34显示hpb与试样之间的其他差异：1)ds在两个试样之间显著不同。显示必须包括轴向及赤道型羟基的缩合反应；2)两个试样的主要离子是自固体中存在的氨的nh4⁺加合物。对于每一ds亦存在mh⁺离子；3)主要离子中的每一者的同位素簇显示铵加合物的双倍带电均-二聚体。在的情形下，亦观察到质子化离子的双倍带电二聚体；4)两种材料皆显示来自质子及铵的加合的双倍带电均-二聚体；5)在两种材料中形成针对m/z1530下的ds6-ds7记录的双倍带电杂-二聚体，但在中与在hpb中要强烈得多；6)在80％acn中于2.5μm浓度下维持所有这些差异。这表明二聚体具有强的分子间缔合。

图35显示hpb与试样之间的额外差异是呈同来源及异来源的三倍带电二聚体的形式。这些显示在中的更大强度且在hpb中实质上不存在。

概言之，电喷雾ms分析表明与市售的不同羟丙基β-环糊精组合物cyclo^tm的取代指纹相比，实例1中所述i期临床试验中所用的羟丙基β-环糊精组合物hpb的取代指纹的显著差异。hpb具有取代指纹的低批次间变化及低含量的杂质(尤其丙二醇)。相比之下，表明其取代指纹的高批次间变化及显著较高含量的丙二醇(一种假定耳毒素)。亦表明同来源及异来源的三倍带电环糊精二聚体，其在hpb中不存在。

7.6.实例6：羟丙基β-环糊精组合物的纯化

研究三种纯化方法(复合、沉淀及吸附)进一步减少hbp中丙二醇(pg)及未经取代的β-环糊精(ds＝0)杂质的能力。

7.6.1.与有机化合物复合/缔合

实验5.6.1a：将1.0ghpbcd(kleptose(roquette))溶解于水(10ml)中。向溶液中添加对二甲苯(试验编号5.6.1.1)或甲苯(试验编号5.6.1.2)(1.0ml)并将混合物于室温下搅拌24hr并于5℃至7℃下搅拌1hr。经由0.45μm乙酸纤维素膜过滤器过滤乳白色溶液并将滤液于40℃下蒸发至干燥。

试验编号5.6.1.1：0.7g；产率：70％。

试验编号5.6.1.2：0.8g；产率：80％。

实验5.6.1b：将2.0ghpbcd(kleptose(roquette))溶解于水(4ml)中。向溶液中添加d-柠檬烯(试验编号5.6.1.3，0.04ml，约10当量)或l-薄荷醇(试验编号5.6.1.4，0.04g，约10当量)或苄醇(试验编号5.6.1.5，0.03ml，约10当量)或胆固醇(试验编号5.6.1.6，0.1g，约10当量)并将混合物于室温下搅拌72hr。将溶液于5℃下保持4hr。

试验编号5.6.1.4及试验编号5.6.1.5保持澄清溶液，未形成沉淀。

试验编号5.6.1.3及试验编号5.6.1.6形成沉淀。经由0.45μm乙酸纤维素膜过滤器各自过滤试验编号5.6.1.3及试验编号5.6.1.6的溶液并将滤液于40℃下蒸发直至干燥。

试验编号5.6.1.3：2.1g；产率：105％。

试验编号5.6.1.6：1.4g；产率：70％。

源自与小分子的选择性复合物形成或缔合的试样的结果概述于表9中。

nd＝未测定。

试验编号5.6.1.1、编号5.6.1.2及编号5.6.1.3显示与市售hbp相比，未经取代的β-环糊精含量减少。另外，试验编号5.6.1.3中的d-柠檬烯显示经单取代的羟丙基β-环糊精(“hpbcdds＝1”)及其他环糊精相关杂质的含量减少(参见图19)。图19显示杂质：滞留时间约5min时的未经取代的β-环糊精(bcd)、滞留时间约6min时的经单取代的羟丙基β-环糊精(ds-1)及滞留时间约7.4min时的ds＝2的羟丙基β-环糊精(ds-2)。

7.6.2.沉淀

一般方法：将1.0ghpbcd(kleptose(roquette))溶解于5ml或2ml溶剂(s)中，并在50ml或20ml沉淀剂(pa)中沉淀。将经过滤固体物质用3mlpa冲洗3次。试验编号5.6.2.11例外：将1.0ghpbcd溶解于水(2ml)中并用氯仿(3×10ml)萃取。合并有机相，在na2so4上干燥，倾析，并于40℃下蒸发直至干燥。每一试验的制剂总结于表10中。

nd＝未测定。

溶剂沉淀实验的分析结果概述于表11中。

nd＝未测定。

如表11中所示，沉淀减少羟丙基β-环糊精试样中丙二醇的含量。使用甲醇分别与丙酮、乙腈或氯仿的组合作为沉淀剂的试验编号5.6.2.10、5.6.2.2及5.6.2.3分别能够将丙二醇含量减少92％、81％及22％。使用水分别与丙酮或乙腈的组合作为沉淀剂的试验编号5.6.2.7.2及5.6.2.8.2将丙二醇含量减少>95％(参见图20，比较试验编号5.6.2.7.2vs.kleptose)。相比之下，与市售kleptose相比，使用水及氯仿的试验编号5.6.2.11不显著改变丙二醇含量。

7.6.3.吸附

7.6.3.1.利用氧化铝的澄清

将2.0ghpbcd(kleptose(roquette))溶解于甲醇(8ml，试验编号5.6.3.1.1)或乙醇(8ml，试验编号5.6.3.1.2)中，并于室温下与氧化铝(2.0g，标准化氧化铝90，merck)一起搅拌半小时。过滤出氧化铝，用甲醇或乙醇(3×2ml)及水(3×2ml)洗涤。于40℃下蒸发滤液(sz)及第一冲洗溶剂(m1[甲醇]或e1[乙醇])直至干燥。

试验编号5.6.3.1.1：试样5.6.3.1.1-sz：1.6g；产率：80％。

试验编号5.6.3.1.1：试样5.6.3.1.1-m1：0.2g；产率：10％。

试验编号5.6.3.1.2：试样5.6.3.1.2-sz：1.5g；产率：75％。

试验编号5.6.3.1.2：试样5.6.3.1.2-e1：0.2g；产率：10％。7.6.3.2.氧化铝上层析

试验编号5.6.3.2.1：将2.0ghpbcd(kleptose(roquette))溶解于甲醇(2ml)中，并经由具有甲醇的氧化铝(10g，标准化氧化铝90，merck)层析，流速：3ml/min，1min/级分，30个级分。将管柱用水洗涤，流速：10ml/min，20min(w)。组合以下级分并将其于40℃下蒸发直至干燥。

试样5.6.3.2.1a：第2级分：0.5g，产率：25％。

试样5.6.3.2.1b：第3-8级分：1.1g，产率：55％。

试样5.6.3.2.1c：第9-14级分：0.2g，产率：10％。

试样5.6.3.2.1d：第15-w级分：0.2g，产率：10％。

试验编号5.6.3.2.2：将5.0ghpbcd(kleptose(roquette))溶解于甲醇(10ml)中，并经由氧化铝(200g，标准化氧化铝90，merck)利用以下溶剂梯度层析：100％甲醇，流速：5ml/min，3min/级分，第1-30级分；80％甲醇，20％水，5ml/min，3min/级分，第31-43级分；50％甲醇-水，5ml/min，3min/级分，第44-60级分；100％水，5ml/min，3min/级分，第61-70级分；洗涤(w)：100％水，10ml/min，30min。

组合以下级分并将其于40℃下蒸发直至干燥。

试样5.6.3.2.2a：第0-5级分：0.1g，产率：2％。

试样5.6.3.2.2b：第6-10级分：0.6g，产率：12％。

试样5.6.3.2.2c：第11-16级分：0.5g，产率：10％。

试样5.6.3.2.2d：第17-45级分：1.1g，产率：22％。

试样5.6.3.2.2e：第46-51级分：0.5g，产率：10％。

试样5.6.3.2.2f：第52-56级分：0.9g，产率：18％。

试样5.6.3.2.2g：第57-66级分：0.5g，产率：10％。

试样5.6.3.2.2h：第67-w级分：1.3g，产率：26％。

7.6.4.阴离子交换树脂

试验编号5.6.3.3：将1.0ghpbcd溶解于水(10ml)中，且利用0.1nnaoh将ph设定在10-12之间(通过万能ph纸测量，merckph1-14)。将溶液与5.0g阴离子交换树脂(purolite，产品码：47111)一起搅拌14hr。过滤出树脂，将滤液用阳离子交换树脂(purolite，产品码：15131)中和并用木炭处理。通过于40℃下蒸发直至干燥分离固体试样，以产生试样5.6.3.3，产率：0.9g，90％。

来自吸附的试样的表征

nd＝未测定。

表12及13中的数据的图形表示绘示于图21-24中。级分a至h分别对应于试样5.6.3.2.2a至5.6.3.2.2h。尽管阴离子交换树脂、之后木炭处理用于减少一些杂质(试验编号5.6.3.3，图21)，但发现氧化铝吸附有效减少cd相关杂质含量(试验编号5.6.3.1，图22)，甚至在应用于层析时减少更多(图23)。图21-23显示杂质：滞留时间约5min时的未经取代的β-环糊精(bcd)、以及滞留时间约6min时的经单取代的羟丙基β-环糊精(ds-1)及滞留时间约7.4min时的ds＝2的羟丙基β-环糊精(ds-2)。试验编号5.6.3.2.2中收集的8个级分(a至h)绘示于图24中。级分b-d含有极低浓度的靶标杂质、丙二醇及bcd。bcd降低低于级分a-g的量化限值。同时，级分a-f中的ds-1hpbcd含量低于0.15％(96％或更大减少)；且级分b-d中的cd相关其他杂质显著减少。基于这些发现，认为基于al2o3的层析适于有效自hpbcd去除cd相关杂质。

7.7.实例7：较大规模的纯化

为准备ii期临床试验，研究三种纯化方法(沉淀、氧化铝上吸附及沉淀与氧化铝吸附的组合)以较大规模减少hbp中丙二醇(pg)及未经取代的β-环糊精(ds＝0)杂质的能力。对10ghpbcd(hbp(roquette))的批次进行纯化；亦对30g批次进行沉淀。自10g批次获得的结果阐述于表16、17及18中。自30g批次获得的结果阐述于表19中。

7.7.1.溶剂沉淀

在制备10ghpbcd期间，由水与丙酮进行沉淀。将hpbcd溶解于半当量水(20ghpbcd，于10ml水中)中，倒入五倍体积(100ml)的丙酮中并在倾析后用双倍体积(40ml)的丙酮洗涤三次。使用超音波及搅拌，溶解耗时30-60分钟。通过在过滤之前用丙酮洗涤三次降低沉淀的胶质性质。产率是87-93％。

于30g规模下，使用甲醇代替水用于溶解hpbcd。将43ghpbcd溶解于43ml甲醇中，且随后倒入430ml丙酮中。在用丙酮(43ml)洗涤三次后，沉淀易于过滤。产率为99％。基于gc结果，在纯化期间使用甲醇较使用水快且产生更好产率。

7.7.2.氧化铝上层析

将hpbcd溶解于甲醇中以获得约1mg/ml溶液。举例而言，将10.0ghpbcd溶解于甲醇(10ml)中，并经由具有甲醇的氧化铝(220g氧化铝填料的180cm³管柱)层析，流速为5ml/min，每10分钟收集各级分，总计8-20个级分。洗脱液是100％甲醇。为制造10g纯化hpbcd，对于纯产物以70-75％产率使用20-22g起始材料。

7.7.3.氧化铝上层析与溶剂沉淀的组合

对于组合方案，对于10.0ghpbcd批次，如上文所述溶剂沉淀之后是上述氧化铝上层析。

表20比较3种纯化方法的结果。

7.7.4.纯化对取代指纹的效应

基本上如实例5(第二实验室)中所述在批次cyl-4063(该批次通过氧化铝上吸附层析与溶剂沉淀(水-丙酮)的组合纯化)的等份试样及hpb的母批的等份试样上进行电喷雾ms分析。在图36中比较这些谱图，其中图36a显示起始材料的谱且图36b显示纯化批次的谱。如可见，纯化消除未经取代的β-环糊精分子(“ds-0”)、几乎所有具有单一羟丙基取代的环糊精分子(“ds-1”)，并降低具有2个羟丙基取代的环糊精分子(“ds-2”)的浓度。这些谱图也表明相对比例变化极小且因此更高度取代的羟丙基β-环糊精物质ds3、ds4、ds5、ds6及ds7的分布变化极小。

我们量化了14批hpb(“eoxxx”)及纯化批次cyl-4063的峰分布。每一峰的信号及对总信号的每一峰贡献的百分比概述于表21中。

7.8.实例8：纯化对基因表达图谱的效应

如实例7中所论述，大规模的纯化努力成功减少以下物质：丙二醇，其是假定耳毒素；无羟丙基取代的β-环糊精分子(ds-0)，已知其形成沉淀；及细菌内毒素，其具有高度发炎性。然而，我们观察到利用氧化铝的吸附层析不管单独使用或与溶剂沉淀组合使用亦实现组成特性或指纹的显著改变，实质上降低ds-1羟丙基β-环糊精的量，以及——在通过电喷雾ms分析的批次(其已通过利用氧化铝的吸附层析与溶剂沉淀的组合来纯化)中——降低ds-2羟丙基β-环糊精的量，且对hpb中存在的更高度取代的物质(ds3、ds4、ds5、ds6、ds7)的存在及比率的效应极不明显。

为评价该组成指纹的实质改变的潜在药理学效应，我们进行了基因表达剖析。

7.8.1.材料及方法

7.8.1.1.细胞

自coriellmedicalinstitute获得gm18453细胞(针对npc1突变是纯合的)及野生型gm05659细胞。将细胞系在10％fbs、dmem及100单位/ml的青霉素及链霉素中培养。在环糊精处理之前，使500,000个细胞/孔与10ug/ml丝裂霉素同步。以研究中所用的范围的浓度(0.1mm至10mm)将羟丙基环糊精(hpcd)溶解于pbs中。

7.8.1.2.rna制备及全转录体分析

溶解npc1(gm18453)及野生型细胞(gm05659)并使用试剂(invitrogen)萃取rna。随后使细胞经受dnasei(qiagen)处理。利用qubit分光光度计及nanodropnd-1000检查试样的纯度及浓度且使用agilent2100bioanalyzer评估rna完整性(rin)。根据制造商的说明使用ribominus^tm真核生物套组富集萃取的mrna。rna的最终量是10μg/反应。使用clontechsmarterstrandedrna-seqkit生成的cdna文库经选择大小在150-250bp范围内且根据由illumina提供的方案测序。使用hiseq2000平台利用75bp正向引子及35反向引子对试样进行测序。

7.8.1.3.rna-seq数据分析

cdna文库的测序导致每个试样产生20941134至42375128个成对读数。对于较大定位质量，将碱基读数修整至50个碱基对。使用利用bowtie1.0.0版的tophatv2.1.0将所有色彩间隔读数与人类参照基因体(ensembl，发行号73)比对。利用cufflinksv2.0.2计算用于评价基因表达水平的rpkm(读数/转录的千碱基/百万定位读数)的值且利用illuminabasespacecoreapps使用自ensembl(发行号73)下载的蛋白质编码基因的基因注释撷取粗计数。利用edger在粗计数上估计差异表达/变化倍数。所有程序皆以其缺省参数使用，且tophat设定为不寻找新接点。

使用tibcospotfire(6.5版)可视化每一基因的变化倍数。使用树图与条形图的组合以展示差异基因表达变化。为观察10mmhpcd处理的全转录体变化，发现条形图视图最佳。

7.8.1.4.rnaseq分析验证分析

使粗rnaseq碱基读数经受胆固醇稳态基因的所选择组的定向计算分析以确立对hpb处理的反应。所选择基因列示于下表22中。

7.8.1.5.代谢路径分析

分析所有环糊精细胞处理以测定18453npc1细胞系中实施的关键代谢路径。使用ingenuitypathway分析软件，使用基因id、每基因的变化倍数及p值以生成volcano散布图。这些图揭示各种处理的上调及下调基因。随后针对多组基因干扰特定代谢路径的能力(-log10(paccc))相对于其差异表达程度(-dlog10(pora)对其进行概率加权。可能干扰路径的基因成员的概率定位不必排除干扰其他路径中的其他基因成员的参与。

在以下情况下分析这些数据：自thekyotoencyclopediaofgenesandgenomes(kegg)数据库(发行号73.0+/03-16，3月15日)(kanehisa等人，2000；kanehisa等人，2002)获得的路径，来自geneontologyconsortium数据库(2014年9月19日)(ashburner等人，2000；geneontologyconsortium,2001)的基因存在论，来自mirbase(发行号21)及targetscan(targetscanrelease6.2(2015年3月更新))数据库(griffiths-jones等人，2008；kozomara及griffiths-jones，2014；friedman等人，2009；grimson等人，2007)的mirna，及来自kegg数据库(发行号73.0+/03-16，3月15日)(kanehisa等人，2000；kanehisa等人，2002)的疾病。

ingenuity路径分析(qiagen)使用由(draghici等人，2007；tarca等人，2009,khatri等人，2007)提出的影响分析对路径进行评分。影响分析使用两类证据：i)给定路径中差异表达(de)基因的过度呈现及ii)通过传播横跨路径拓扑结构的所测量表达变化计算的该路径的干扰。这些方面是由两个独立概率值pora及pacc捕获，其随后组合于独特整体p值中。包括基因及其相互作用的路径拓扑结构自kegg数据库(kanehisa等人，2000；kanehisa等人，2010；kanehisa等人，2012；kanehisa等人，2014)获得。

第一概率pora代表在给定路径上获得大于或等于仅偶然观察的数目的de基因的概率(draghici等人，2003；draghici2011)。让我们考虑实验中存在测量的n个基因，其中这些中的m个在给定路径上。基于de基因的优先权选择，发现m个基因中的k个差异表达。在给定路径上精确观察x个差异表达基因的概率基于超几何分布计算：由于超几何是离散分布，故在给定路径上仅偶然观察少于x个基因的概率可通过对在路径上具有1或2或...或x-1个基因的概率进行加和来计算：

(1)

为计算过度呈现，在给定路径上获得大于或等于ingenuity路径工具上观察的数目的de基因的p值计算pora＝p(x)＝1-p(x-1)：

(2)

第二概率pacc是基于每一路径中测量的干扰的量来计算。使用以下计算路径上的每一基因的干扰因子：

(3)

在所示方程中，δe(g)项代表基因g的标记标准化测量的表达变化，且α(g)是基于基因的类型的优先权重。第二项是所有紧邻靶基因g上游的基因u的干扰因子的总和，其通过每一该基因的下游基因数n(u)标准化。β的值量化基因g与u之间的相互作用强度。β的符号代表相互作用的类型：对于活化类信号为加，且对于抑制类信号为减。随后，ingenuity路径分析计算每一基因的含量下的净干扰累积acc(g)作为干扰因子pf(g)与观察的log变化倍数之间的差：

(4)

(5)acc(gi)＝pf(gi)-δe(gi)

通过对线性方程系统求解同时计算所有干扰累积，该方程系统通过组合上文路径上的所有基因的方程(参见上文)获得。一旦计算所有基因干扰累积，ingenuity路径计算路径的总累积作为基因的所有绝对累积之和。经由自举评价仅偶然获得较大总累积(pacc)的显著性。

使用fisher方法将两类证据pora及pacc组合成一个最终p值。随后使用fdr及bonferroni针对多重比较校正此p值。bonferroni是两者中的最简单且更保守者(bonferroni,1935；bonferroni,1936)。其通过对由总比较次数加权的每一比较施加更严格临限值来降低错误发现率。fdr在发现更多伪阳性的程度下更有力(benjamini及hochberg,1995；benjamini及yekutieli,2001)。其确保伪阳性的整体百分比低于所选临限值。

7.8.2.结果

7.8.2.1.分析验证

在进行完全转录体分析之前，将gm18453及gm05659细胞用一系列hpb浓度(0.1mm至10mm)处理并评价对所选胆固醇稳态相关基因的效应。

将结果在下表23中制表，且在图37中制图。结果表示为变化倍数(log(fc))。

结果表明hpb对纯合npc1细胞的剂量依赖效应，且进一步表明在三个测试浓度中，1.0mmhpb适于提供有意义的数据。

7.8.2.2.纯化组合物的分析

7.8.2.2.1.对预选择的胆固醇稳态基因的表达的影响

如实例7中所论述，我们发现包括吸附至氧化铝的纯化方案显著改变羟丙基β-环糊精混合物的取代指纹。为评价这些变化如何改变组合物的药理学效应，我们比较了对以下的胆固醇稳态基因的表达的影响：(i)不同纯化组合物及(ii)针对npc1突变为纯合的gm18453细胞中的hpb。

令人惊奇地，我们未发现差异。

图38显示胆固醇稳态基因的亚组中针对npc1突变为纯合的gm18453细胞中的表达的变化倍数，其中对于以下四种不同组合物在处理后表达在统计学上显著不同(p<0.001)：std(hpb“标准品”)；ac(通过氧化铝层析纯化的hpb)；sp(通过溶剂沉淀纯化的hpb)；及ap(通过氧化铝层析及溶剂沉淀纯化的hpb)。关于纯化方案及各别组合物的详情，参见实例7。

尽管去除了氧化铝纯化组合物中的低ds物质，但是在任一测试浓度下所有纯化组合物在效果上均与母体组合物hpb(“std”)无不同。因此，组合物的相关药理学活性(其对胆固醇稳态的影响)似乎存在于hpb中存在的更高度取代的物质中，因为未经取代的β-环糊精分子(ds-0)、经单取代的羟丙基β-环糊精(ds-1)的去除及二取代的羟丙基β-环糊精(ds-2)的大量减少对组合物改变npc1细胞中的胆固醇稳态基因的表达的能力没有可辨别的影响。

7.8.2.2.2.全基因体分析

在上述分析中，我们评价了针对与由npc1突变引起的主要缺陷的相关性预选择的基因的表达变化，并比较了仅对以下预选择基因的亚组的表达的影响：所述基因的表达在用羟丙基β-环糊精处理时在统计学上显著不同。为确认低ds物质的去除对相关药理学活性无可观影响的观察，且进一步探索组合物之间的可能差异，我们进行了全基因体分析以鉴别在统计基础上受处理影响最大的生物路径。

我们进行了经1.0mmhpb及1.0mm纯化批次cyl-4063处理的npc1细胞的全基因体路径分析。如实例7中详细阐述，cyl-4063通过氧化铝上吸附层析与溶剂沉淀的组合自hpb制备。如实例7中的表21中所示，纯化显著降低低ds物质的盛行率，其中与hpb中16.2％的ds-0、ds-1及ds-2的平均总含量相比，cyl-4063中总共仅具有3.2％的环糊精物质具有0、1及2个取代。

如图39中所示，在鉴别为统计学上受1.0mmhpb的处理影响最显著的4个路径中，以下3个路径亦在统计学上受1.0mmcyl-4063的处理影响最大：erbb信号传导路径、mapk信号传导路径及gnrh信号传导路径。这些结果确认尽管自cyl-4063去除低ds物质，gm18453细胞上的羟丙基β-环糊精混合物的整体活性存在较小干扰。

此外，我们还观察到类固醇生物合成路径(直接受由这些细胞中的npc1突变引起的主要缺陷影响的路径)是在用1.0mmcyl-4063处理时第二最显著影响的路径，但仅六个路径在统计学上受1.0mmhpb的处理影响最显著。这些结果与以下假说一致：组合物对胆固醇稳态的效应存在于更高度取代的环糊精物质中，其以更大浓度存于纯化组合物中。

7.8.2.3.具有不同取代度的级分的活性

为直接评价具有不同羟丙基取代度的环糊精物质的差异贡献，我们将一批hpb分级分离成三个分别具有低、中等及高羟丙基取代度的汇集物，且测试这些汇集级分对npc1细胞中的基因表达的效应。

7.8.2.3.1.方法

(a)分级分离

由hpb批次e0245制备级分。e0245起始材料中的β-环糊精物质的分布示于表21(实例7)中，摘录于下表24中的相关部分中。

基本上如上文实例5.3.1中所述在cd-筛选管柱上分离15ghpb(批次e0245)的试样且收集各级分。图40显示自制备型cd-筛选层析分离获得的各个级分的层析图，注释示出层析分离的羟丙基β-环糊精物质的取代度。

选择级分2作为具有低取代度的级分，即“l”(cyl-4103)。具有中等取代度物质的部分(即部分“m”(cyl-4104))是级分4-15的汇集。具有高取代度的部分(即部分“h”(cyl-4105))是级分16-24的汇集。图41显示以下的电喷雾ms谱：(a)hpb批次e0245，其经注释以通过羟丙基取代度鉴别信号；(b)“l”汇集部分；(c)“m”汇集部分；及(d)“h”汇集部分。

(b)表达剖析

用1.0mm“l”、“m”及“h”部分平行处理npc细胞系gm18453(500,000个细胞/孔)。自每一处理分离rna，之后根据先前方法生成cdna文库。cdna文库的测序导致每个试样产生28891287至50245721个成对读数。对于较大定位质量，将碱基读数修整至50个碱基对。使用利用bowtie1.0.0版的tophatv2.1.0将所有色彩间隔读数与人类参照基因体(ensembl，发行号73)比对。利用cufflinksv2.0.2计算基因表达程度的rpkm(读数/转录的千碱基/百万定位读数)值且利用illuminabasespacecoreapps使用自ensembl(发行号73)下载的蛋白质编码基因的基因注释撷取粗计数。利用edger在粗计数上估计差异表达/变化倍数。所有程序皆以其缺省参数使用，且tophat设定为不寻找新接点。使用tibcospotfire(7.0版)可视化每一基因的变化倍数。使用树图与条形图的组合以展示差异基因表达变化。

对于比较，使用hpb及未分级分离的纯化批次cyl-4077(参见实例7)进行类似分析。

7.8.2.3.2.结果

我们进行了全基因体转录体分析以鉴别在统计基础上受“l”、“m”及“h”部分的处理影响最大的10个生物路径。

图42显示以统计显著性递降的次序分级的10个受用1.0mm“l”、“m”及“h”部分处理npc细胞影响最大的生物路径。与我们的先前观察一致，“l”部分不引起类固醇生物合成路径中基因的表达在统计学上显著变化。形成鲜明对比的是，类固醇生物合成路径是在用“m”部分处理npc1细胞时受影响最显著的生物路径。“m”部分主要由具有3、4、5及6个羟丙基取代(ds3、ds4、ds5及ds6)的β-环糊精物质组成。主要包括ds5、ds6及ds7的“h”部分亦引起胆固醇生物合成路径的基因表达的变化，其中胆固醇生物合成路径似乎作为第二最显著路径。

这些结果提供以下的直接证据：恢复胆固醇稳态的能力存在于在具有较高羟丙基取代度的hpb中存在的环糊精物质中。

7.8.2.4.级分与未分级分离组合物的比较

我们关于具有不同羟丙基取代度的环糊精物质差异影响npc细胞中的基因表达的观察的推论是总体组合物的整体药理学活性必须取决于组成指纹，亦即取决于组合物中存在的差异羟丙基化物质的相对比例。

我们通过逐个特定基因(即按geneid)比较在用1.0mm以下物质中的任一者处理npc细胞后的基因表达变化来确认此假说：(i)未分级分离的hpb，(ii)未分级分离的cyl-4077，其通过氧化铝上吸附层析及选择性溶剂沉淀自hpb纯化，(iii)“l”部分，(iv)“m”部分，或(v)“h”部分。

我们观察到表达显著受1.0mmhpb影响的64％基因亦显著受1.0mm纯化批次(批次cyl-4077)的处理影响。

此共有百分比显著高于表达显著受1.0mmhpb及1.0mm“l”、“m”及“h”部分中的任一者(分别37％、43％及48％)的处理影响的基因的百分比。

类似地，受hpb及cyl-4077二者影响的基因的64％共有一致性显著高于表达显著受1.0mmcyl-4077及1.0mm“l”、“m”及“h”部分(分别41％、38％及44％)中的任一者的处理影响的基因的百分比。

7.8.2.5.参与自体吞噬的基因

已表明羟丙基β-环糊精可增强在npc疾病中累积的蛋白脂质聚集物的自体吞噬清除。(song等人，2014,j.biol.chem.第289卷(14)，第10211-10222页)。因此，我们分析了gm18453npc细胞中用1.0mm及10.0mmhpb、cyl-4077及“h”、“m”及“l”部分中的每一者的处理对自体吞噬相关基因的表达的效应。

表25显示在处理时表达变化在统计学上显著(p<0.05)的所有自体吞噬基因，且表明1.0mm浓度对自体吞噬相关基因的影响极小。

表26显示在于10.0mm浓度下处理后表达变化在统计学上显著(p<0.05)的所有自体吞噬基因。

使用10.0mm的结果表明hpb及cyl-4077对参与自体吞噬的基因的表达具有类似效应，且进一步表明这些效应是由具有较高取代度的物质贡献，其中与“h”部分及“m”部分相比，“l”部分对参与自体吞噬的基因的表达具有最小的影响。

7.8.3.讨论

使用基因表达图谱实验，我们已经论证了非经肠级羟丙基β-环糊精组合物hpb能恢复针对npc1突变为纯合的细胞中的胆固醇稳态基因的表达程度并增加自体吞噬相关基因的表达。这些数据与i期人类临床试验的数据一致，表明hpb的鞘内投与有效稳定具有npc疾病的患者的症状或减缓其进展。与临床数据的相关性表明基因表达分析可提供功效的活体外量度。

电喷雾ms表明hpb是以可重现比例含有具有不同羟丙基化程度的β-环糊精分子的复杂混合物。

我们研发来去除hpb中的方法相关及其他杂质的纯化方法碰巧去除具有低取代度的β-环糊精物质，从而改变组成指纹。基因表达图谱实验表明，尽管组成指纹的这种变化，组合物使针对npc突变为纯合的细胞中的胆固醇生物合成路径中的基因的表达标准化的能力无显著变化。

这些数据表明，相关药理学活性主要是由较在纯化期间消除的那些具有更大的取代度的物质贡献。

我们通过将复杂混合物分级分离成具有含低(“l”)、中等(“m”)及高(“h”)羟丙基取代度的β-环糊精物质的汇集并评价对npc细胞中的基因表达的效应确认此推断。结果表明“l”部分对胆固醇生物合成路径或自体吞噬中的基因的表达无明显效应，而“m”及“h”部分显著影响胆固醇生物合成及自体吞噬基因的表达。这些实验进一步表明总体组合物的药理学活性是由具有不同羟丙基取代度的β-环糊精物质单独贡献的活性的复合物；整体药理学活性取决于组成指纹，亦即取决于组合物中存在的差异羟丙基化物质的相对比例。

尽管总体组合物的药理学活性是由具有不同羟丙基取代度的β-环糊精物质单独贡献的活性的复合物，但意外地，通过我们的纯化方法去除的物质(具有低羟丙基取代度的那些)对与npc疾病的治疗药理学相关的混合物的特定活性贡献极小(倘若有)。此发现将容许我们所研发的新颖、更高度纯化且组成不同的hpbcd组合物通过鞘内或脑室内途径投与具有npc疾病的患者的csf达较长时段，具有治疗效果以及增加的安全性。

7.9.实例9：替代的制备级分方法

如实例8中所论述，使用cd-筛选管柱进行层析分离制备三个具有不同平均取代度的级分用于基因表达剖析实验。

作为替代，我们也基本上如上文实例5.7.2中所述使用氧化铝管柱制备了hpb(批次e0245)的级分。将试样施加至氧化铝管柱并用100％甲醇等度洗脱。图43显示各个级分的层析图，注释示出经汇集产生部分“a”-“f”及“k”的用数字表示的级分，且进一步注释示出层析分离的羟丙基β-环糊精物质的取代度。

将实验参数进一步优化以尽可能多地自hpb去除未经取代的bcd及ds1hpbcd，其中ds2及ds3hpbcd的损失最少。如下文阐述纯化方法的详情：

每一测试方法(方法ii-xi)的相同参数：

210g氧化铝管柱；

30ml/min流速；

100sec/级分；

60sec延迟时间。

仅meoh作为洗脱液：

方法ii.21gkleptose，30个级分，洗脱液：100％meoh等度洗脱，产率：79.4％

方法iii.10.5gkleptose，30个级分，洗脱液：100％meoh等度洗脱，产率：72.3％

方法iv.15gkleptose，30个级分，洗脱液：100％meoh等度洗脱，产率：77.7％

meoh+水作为洗脱液：

方法v.10.4gkleptose，30个级分，洗脱液：100％meoh等度洗脱(产率：73.8％)+30个级分，100％meoh等度洗脱(60个级分的总产率：75.9％)+30个级分，在各步骤之间具有短(100sec)过渡梯度洗脱的3步等度洗脱(90％、80％、70％meoh，各自15min)，90个级分的总产率：83.1％

方法vi.10.5gkleptose，洗脱液：meoh+水，75个级分，20min100->80％meoh梯度洗脱，106min80％meoh等度洗脱，产率：82.8％

方法vii.与方法vi.相同，但70％meoh而非80％，产率：91.2％

方法viii.10.5gkleptose，洗脱液：meoh+水，75％meoh等度洗脱，30个级分，产率：86.4％

方法ix.10.6gkleptose，洗脱液：meoh+水，70％meoh等度洗脱，30个级分，产率：89.2％

etoh(96％纯度)+水作为洗脱液：

方法x.10.5gkleptose，30个级分，洗脱液：100％etoh等度洗脱(产率：27.6％)+30个级分，70％etoh等度洗脱，60个级分的总产率：82.1％

方法xi.10.5gkleptose，60个级分，洗脱液：80％etoh等度洗脱，产率：82.3％

图44显示在不同纯化方法后hpbcd混合物的层析图。纯化后混合物中的ds2/ds1比率概述于表27中。

7.10.实例10：于18个月时npc的i期临床试验

对c型尼曼-匹克病的i期临床试验的数据(包括18个月时的效能结果)执行进一步分析。结果示于图45-50中。如图45中所概述，使用年斜率、自基线的变化及反应者分析以分析18个月i期临床试验数据。自年变化率，18个月治疗结果揭示hpbcd混合物是疾病调修疗法(图46)。hpbcd混合物显示npc患者中自基线的疾病的一致改良或稳定(图47)。hpbcd混合物治疗亦显示较大百分比的显示稳定或改良疾病的反应者(图48)。治疗对听力的影响主要在高频范围内，且影响可利用助听器校正(图49)。图50概述关于治疗对听力的影响的数据的推论。

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