一种治疗方法与流程

申请日期

本申请与2015年6月12日提交的标题为“一种治疗方法”的澳大利亚临时专利申请no.2015902214以及于2016年4月12日提交的标题为“一种治疗方法”的澳大利亚临时专利申请no.2016901349相关并要求其优先权，其全部内容通过引用并入本文。

本公开一般涉及通过增强的基于细胞的治疗方法来治疗哺乳动物受试者从而促进组织和神经元修复(repair)、再生和/或修缮(repairation)的方法。本公开还涵盖了用于治疗哺乳动物受试者的药物和所述药物的生产方法。

背景技术：

本说明书中由作者引用的出版物的书目细节按字母顺序收集在说明书结尾处。

本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应该被认为是对这种现有技术构成任何国家的公知常识的一部分的认可或任何形式的暗示。

现代医学已经通过确定化学治疗剂和生物制剂如抗生素而得到了极大的进步。然而，许多药物具有多种功能，一些影响脱靶生理效应。基于细胞的治疗剂已经被提出作为现代医学的下一个支柱(fishback等人(2013)scitranslmed5：179ps7)。

基于细胞的疗法的一个限速因素是产品可能不一致。这在涉及干细胞的试验中有所强调。例如，虽然间充质干细胞(msc)在文献中很好地表征并且已经达到临床试验水平，但通常需要连续传代来使用。这会并经常对何时以及如何使用细胞产生不利影响。

解决这个问题的一个方法是使用库存的间充质祖细胞。这至少避免了收获和治疗之间的延误。然而，这引起了供体之间细胞效力的变化，并且没有解决连续传代的负面影响的问题。

解决这个问题的临时措施是拥有一个“主”细胞库。此外，这并没有克服如下不可避免的问题：在衰老和表观遗传/核型改变发生之前，细胞可以经历的传代次数有限(schellenberg等人(2011)aging(albanyny)3:873-888)。重复给药后也有免疫排斥的风险。

例如，随着产科监护和新生儿护理的显著改善，越来越多的早产儿存活，导致“早产疾病”的患病率升高。一种特别虚弱的病况是支气管肺发育不良(bpd)，它是非常早产儿的不可治愈的慢性肺病。它的特征是肺泡发育不良和停滞以及肺毛细血管结构破坏。bpd是新生儿发病和死亡的主要情况。bpd存活者在成年早期也处于阻塞性呼吸系统疾病(doyle等人，(2006)paediatrics118:108-113)以及一般慢性健康损害和认知衰退(lodha等人(2014)plosone:e90843)的严重风险。虽然间充质干细胞已经被提出作为可能用于bpd的基于细胞的疗法，但是由于以上概述的原因，可能存在具有广泛不同功能有效性的细胞批次，其除了引起情绪压力之外，还可能延误其他治疗选择。

肺毛细血管结构受损的问题不仅限于人类早产儿。动物竞速行业，特别是赛马行业面临着运动诱发肺出血(eiph)的问题。例如，在某些司法管辖区内，竞速后出现两次以上流鼻血的马被终生禁止参加另外的竞赛。这可能会造成灾难性的经济损失。就性能增强而言，预防或治疗eiph的化学治疗方法很可能引起伦理问题，并且在任何情况下这种方法都不可能再生爆裂的毛细血管。

已经证明了人类羊膜上皮细胞(haec)的有益作用(例如，hodges等人(2012)amjobstetgynerol206:448e8-448e15；murphy等人(2012)celltransplanti:1477-1492；vosdoganes等人(2013)cytotherapy15:1021-1029；yawno等人(2013)devneurosci35:272-282)。但是，有必要确定其作用机制。

因此，很明显，需要解决基于细胞的疗法的问题，并且需要一种替代的策略。

技术实现要素：

根据本发明，用于细胞通讯(cellularcommunication)的囊泡媒介被确定为从哺乳动物羊膜上皮细胞(aec)中释放。囊泡，在本文被称为“羊膜外泌体”，是源自晚期内涵体并从细胞表面释放的纳米大小的胞外囊泡(50-100nm)。

本文教导了基于哺乳动物羊膜上皮细胞的疗法的改进形式。改进包括使用由上皮细胞释放的纳米大小的羊膜外泌体，并通过激活内源性修复机制来发挥修复作用。本文显示，羊膜外泌体直接作用于免疫细胞从而尤其是降低t细胞增殖、增加巨噬细胞吞噬作用、激活干细胞以及抑制活化的成纤维细胞中的胶原蛋白产生。本文提出，羊膜外泌体以蛋白质(例如细胞因子)和遗传分子(例如mirna，mrna和非编码rna)的形式释放一组外泌体货物(cargo)。

外泌体的生物发生涉及通过晚期内涵体的限制性膜的内向芽生来形成管腔内囊泡。然后，晚期内涵体与质膜融合以释放外泌体。一旦分泌，外泌体可以被位于亲本细胞附近的靶细胞摄取或通过循环行进到远端位点。机械地，外泌体作为含有亲代细胞物质的复合载体起作用。它们可以含有蛋白质和遗传物质，然后这些将被转移到其靶细胞中。

因此，本发明是以对基于细胞的疗法的增强方法的发展为基础的。本公开教导了羊膜外泌体的用途，所述羊膜外泌体从哺乳动物羊膜上皮细胞释放并具有免疫调节、促再生和修复作用。羊膜外泌体通过释放有益的蛋白质组学和遗传学分子如mirna、mrna和非编码rna，来对免疫细胞起作用从而降低t细胞增殖、增加巨噬细胞吞噬作用以及激活内源性干细胞。在本文提出，羊膜外泌体促进组织修复、再生和修缮包括伤口愈合、促进细胞维持、诱导神经元保护包括改善神经变性和损伤的作用并促进修复和神经再生。羊膜外泌体还抑制活化的成纤维细胞中的胶原蛋白产生。还提出，外泌体在全身脉管系统疾病或不良事件如缺血再灌注损伤或器官损伤之后，促进修复和再生，包括改善肾、肝、胰、心脏和肺损伤，以及治疗这些器官的纤维化病况(如肝或肺纤维化)。外泌体也可用于促进髓鞘形成，因此被提出可用于治疗脱髓鞘疾病或病症如多发性硬化症。

羊膜外泌体不仅在人类中具有有益效果，而且在非人类哺乳动物中也具有有益效果。因此，本发明延伸到人类和兽医应用。来自人类受试者的aec在本文中被称为“haec”。

兽医应用的实例是治疗竞速动物包括马、竞速犬和骆驼的运动诱导的肺出血(eiph)。

可以通过在生物反应器中培养哺乳动物羊膜上皮细胞并从条件培养基中分离羊膜外泌体来大量生产羊膜外泌体。上皮细胞可以维持为永生化细胞系。羊膜外泌体可在需要时分离或以冻干状态保存。

本发明的一个创新特征是，没有必要为了使用羊膜外泌体而确定哺乳动物羊膜上皮细胞的兼容性供体。外泌体不会诱导不利的免疫反应。而是根据妊娠阶段和/或其他特征(例如新生儿或足月婴儿的健康)来选择供体。然而，在一个实施方案中，羊膜外泌体来源于妊娠末期患者的haec。羊膜上皮细胞产生羊膜外泌体，在促进不同生理病况的组织或神经元修复、再生和/或修缮方面，所述羊膜外泌体至少与羊膜上皮细胞一样好。然而，基于细胞的疗法没有任何缺点。因此，本发明的一方面是选择供体从而确定产生可用于治疗所需病况的羊膜外泌体的羊膜上皮细胞。这可能导致产生一个羊膜上皮细胞库。然后，基于待治疗的疾病或病况选择特定批次的细胞。

本公开的教导还涵盖了包括羊膜外泌体的药物组合物、包括羊膜外泌体的治疗性试剂盒和/或用于筛选合适的供体或羊膜上皮细胞系的试剂和生物反应器试剂盒。

本文教导了基于细胞的疗法的增强或修饰形式。因此，通过使用羊膜上皮细胞，本文能够实现用于治疗哺乳动物(包括人类)受试者的改进的基于细胞的治疗方案，所述改进包括从永生化羊膜上皮细胞系分离羊膜外泌体，以及全身或局部施用给需要组织或神经元修复、再生和/或修缮(包括促进髓鞘再生)的受试者。

附图说明

一些图含有颜色表示或实体。彩色照片可向专利权人请求获得或从适当的专利局获得。如果从专利局获得，可能收取费用。

图1是(a)羊膜外泌体的电子显微照片的照片表示，其显示典型的杯形形态和约100nm的直径；(b)外泌体生物发生标志物alix和tsg101的表达的照片表示。alix和tsg101是外泌体生物标志物。

图2是显示(a)羊膜外泌体抑制t细胞增殖的图形表示，类似于haec条件培养基；(b)羊膜外泌体增加巨噬细胞吞噬作用n＝3。

图3是显示在支气管肺发育不良(bpd)小鼠模型中羊膜外泌体提高了组织：空气比例的图形表示。

图4是实施例3中使用的实验时间的图解表示，其描绘了在e16时的羊膜内lps注射、在出生后第4天注射外泌体/细胞和采集点(cullpoint)(交叉)。

图5是显示(a)足月外泌体比早产外泌体更加免疫抑制；(b)足月外泌体能更好地增加巨噬细胞的吞噬作用的图形表示，如通过phrodo标记所示，每组n＝3个供体。

图6是显示羊膜外泌体在博来霉素诱导的肺纤维化的小鼠模型中逆转已建立的肺部炎症和纤维化的图形表示。(a)；(b)6-8个月大的雌性c57bi6小鼠。在博莱霉素挑战7天后鼻内施用10μg或50μg来自足月haec的外泌体。

图7是显示羊膜外泌体在体外逆转原代人类肺成纤维细胞的活化的图形表示。当在存在5mg/ml转化生长因子β的情况下培养时，外泌体在24小时内降低α-平滑肌肌动蛋白的蛋白质水平。

图8是显示羊膜外泌体含有靶向细胞因子-细胞因子受体信号传导通路的mirna的图解表示。黄色框表示一个或多个mirna的靶标。

图9是显示羊膜外泌体含有靶向wnt信号传导通路的mirna的图解表示。黄色框表示一个或多个mirna的靶标。

图10是显示羊膜外泌体含有靶向pi3k-akt信号传导通路的mirna的图解表示。黄色框表示一个或多个mirna的靶标。

图11是显示羊膜外泌体含有靶向tgfβ信号传导通路的mirna的图解表示。黄色框表示一个或多个mirna的靶标。

图12a是显示了羊膜外泌体的肺再生作用的图形表示，图12b、c和d是显示其的照片表示，包括健康对照haec、足月外泌体和早产外泌体之间的组织空隙比例(％)。“足月”外泌体是在妊娠结束时从haec分离的外泌体。“早产”外泌体是在妊娠足月之前分离的。

图13a至c是显示羊膜外泌体如haec一样触发肺中的再生的照片表示。深染色是弹性蛋白阳性末梢(tip)的证据。

图14是显示羊膜外泌体而非成纤维细胞外泌体触发肺中内源性干细胞应答的图形表示。该应答显著大于由haec诱导的应答。

图15a和b显示，使用肝组织切片ccl4+盐水与ccl4+外泌体的天狼星(sirius)红染色(a)和α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)免疫组织化学分析证实羊膜外泌体在肝中是抗纤维化的。

图16是显示来自足月与早产haec的外泌体之间蛋白质组学水平的差异的图形表示。

图17是haec与总间充质干细胞(msc)之间的细胞组分比较的图形表示。

haec总外泌体(exo)

总msc外泌体(anderson等人(2016)stemcellshttp://doi.ory/10.1002/stem.2298)。

图18是haec和总msc(anderson等人(2016)同上)之间的生物学过程比较的图形表示。

haec总外泌体

总msc外泌体(anderson等人(2016)同上)。

具体实施方式

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”或变体如包括(comprises)或包括(comprising)将被理解为暗示包括所陈述的元素或整数或方法步骤，或元素或整数或方法步骤的组，而不是排除任何元素或整数或方法步骤，或元素或整数或方法步骤的组。

如在本说明书中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，提及“一种疾病或病况”包括单一疾病或病况以及两种或更多种疾病或病况；提及“一个外泌体”包括单个外泌体以及两个或更多个外泌体；提及“本公开”包括由本公开教导的单个和多个方面；等等。术语“发明”涵盖了本文所教导的和能实现的多个方面。“疾病”或“病况”也包括“病症”。在本发明的范围内，所有这些方面都是能实现的。本发明的“形式”涵盖了本文预期的(contemplated)任何变体和衍生物。

本公开教导了一种增强的基于细胞的疗法，以促进治疗哺乳动物受试者的、一系列疾病或病况，其通常属于修复、再生和修缮细胞、组织、神经通路和内分泌通路的情况。本公开教导，从用于培养哺乳动物羊膜上皮细胞(aec)的条件培养基中分离的羊膜外泌体具有有益的免疫调节生理和生物化学性质。实质上，哺乳动物羊膜外泌体通过释放蛋白质组学和遗传学分子如mirna、mrna和非编码rna，来对免疫细胞发挥作用以降低t细胞增殖、增加巨噬细胞吞噬作用以及激活内源性干细胞。它们还抑制活化的成纤维细胞中的胶原蛋白产生。重要的是，羊膜外泌体不具有免疫原性，因此可以使用同种异体的羊膜外泌体。

羊膜外泌体还逆转已建立的肺部炎症和肺纤维化，并逆向活化原代肺成纤维细胞。这也适用于其他器官如肝、胰腺、心脏和肾的纤维化。此外，它们含有靶向细胞因子-细胞因子受体信号传导通路、wnt信号传导通路、pi3k-akt信号传导通路和tgfβ信号传导通路以及参与各种各样的生理学和神经学过程的信号传导通路的mirna、mrna和非编码rna。

本说明书教导，哺乳动物羊膜外泌体诱导细胞、包括器官在内的组织、神经学通路、全身脉管系统的组分的修复、再生和修缮以及促进伤口愈合。本文提出，羊膜外泌体在创伤、疾病或药物滥用之后促进脑和脊髓的修复、再生和修缮，促进神经再生病况的修复，诱导器官损伤的修缮，在中风或对脑的其它损伤如创伤性脑损伤之后促进修复。提出，外泌体在治疗脱髓鞘疾病、病况或病症如多发性硬化症、视神经炎、德维克病、横贯性脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎和肾上腺脑白质营养不良和肾上腺脊髓神经病(adrenomyeloneuropathy)中促进髓鞘再生。一个实施方案中，羊膜外泌体促进肺损伤的修复。这在治疗人类婴儿的支气管肺发育不良(bpd)中很重要。它还在治疗竞速动物如马、竞速犬(如灵缇)和骆驼的运动诱发性肺出血(eiph)中具有兽医应用。

因此，本发明在本文能够实现的是一种治疗哺乳动物受试者的方法，所述方法包括全身或局部施用源自同种异体哺乳动物羊膜上皮细胞的哺乳动物羊膜外泌体，所述同种异体哺乳动物羊膜上皮细胞来自同一物种的供体哺乳动物。

提及的“哺乳动物受试者”包括需要治疗的任意哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物受试者是人类。术语“aec”指“羊膜上皮细胞”。当来自人类时，aec被称为“haec”。

因此，本说明书在教导治疗人类受试者的方法时，所述方法包括全身或局部施用源自人类供体的同种异体人类羊膜上皮细胞的人类羊膜外泌体。

在另一个实施方案中，哺乳动物受试者是非人类哺乳动物，例如但不限于马、牛、绵羊、山羊、猪、羊驼(alpaca)、美洲驼(llama)、狗、猫或骆驼。

在一个实施方案中，哺乳动物受试者需要治疗。术语“治疗”涵盖细胞、组织和生理通路(包括神经元和内分泌通路)的修复、再生或再生促进和/或修缮。实例包括但本发明不限于，在局部缺血-再灌注损伤或中风、内部和表面伤口、溃疡和疤痕、神经退行性病况以及脑和脊髓损伤(包括创伤性脑损伤和脊髓损伤)之后，器官的修复、再生和/或修缮，所述器官包括循环血管，例如包括这种血管的毛细血管、动脉和静脉。还提出，外泌体用于治疗器官纤维化，例如肺、肝、心脏、肾和胰腺的纤维化疾病、病况或病症。还预期外泌体用于治疗脱髓鞘疾病、病况或病症，或诸如多发性硬化症、视神经炎、德维克氏病、横贯性脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎和肾上腺脑白质营养不良和肾上腺脊髓神经病的疾病。羊膜外泌体可用于临床应用以治疗疾病或病况以及用作美容剂以促进皮肤再生或疤痕或伤口愈合。

尽管不意图将本发明限制为任何一种理论或作用模式，但在此提出，哺乳动物羊膜外泌体表示来自羊膜上皮细胞的用于通讯的囊泡媒介，并释放蛋白质组学和遗传学分子，其提供了有益的分子混合物以促进修复、再生和修缮。还提出，根据获得羊膜上皮细胞的供体的妊娠阶段，蛋白质组学和遗传学分子的图谱(profile)将有所不同。因此，本说明书教导了从处于不同妊娠阶段的不同供体产生永生化的哺乳动物羊膜上皮细胞库。然后基于待治疗受试者的疾病或病况，并基于羊膜外泌体产生的蛋白质组学和遗传学分子的图谱，从所述库中选择上皮细胞。本说明书教导，取决于待治疗的疾病或病况，具有特定蛋白质组学和/或遗传学图谱的羊膜外泌体可能是优选的。

因此，本文教导的另一个方面是一种治疗哺乳动物受试者的方法，所述方法包括：

i.任选地鉴定供体；

ii.基于培养的上皮细胞所产生的羊膜外泌体的蛋白质组学和/或遗传学图谱，从所述或一个供体选择永生化的羊膜上皮细胞；

iii.由所选择的永生化的羊膜上皮细胞产生条件培养基；

iv.从条件培养基中分离羊膜外泌体；以及

v.向哺乳动物受试者全身或局部施用所述羊膜外泌体。

在一个实施方案中，哺乳动物受试者是人类受试者。因此，本文教导的另一方面是一种治疗人类受试者的方法，所述方法包括：

i.任选地鉴定供体；

ii.基于培养的上皮细胞所产生的羊膜外泌体的蛋白质组学和/或遗传学图谱，从所述或一个供体选择永生化的羊膜上皮细胞；

iii.由所选择的永生化的羊膜上皮细胞产生条件培养基；

iv.从条件培养基中分离羊膜外泌体；以及

v.向人类受试者全身或局部施用所述羊膜外泌体。

在另一个实施方案中，分离哺乳动物羊膜外泌体，并且预先确定其蛋白质组学和遗传学图谱，并基于所述图谱产生选择的哺乳动物羊膜外泌体库。然后选择特定的羊膜外泌体用于治疗。

因此，本说明书是一种治疗哺乳动物受试者的方法的教导，所述方法包括：

i.任选地鉴定供体；

ii.基于由外泌体释放的试剂的蛋白质组学和/或遗传学图谱，从所述或一个供体选择羊膜外泌体；

iii.向哺乳动物受试者全身或局部施用所述羊膜外泌体。

在一个实施方案中，哺乳动物受试者是人类。

因此，本文教导了一种治疗人类受试者的方法，所述方法包括：

i.任选地鉴定供体；

ii.基于由外泌体释放的试剂的蛋白质组学和/或遗传学图谱，从所述或一个供体选择羊膜外泌体；

iii.向人类受试者全身或局部施用所述羊膜外泌体。

当用于疗法时，羊膜外泌体也可以被称为药物、试剂、治疗剂、细胞疗法衍生剂、活性成分等。提及“疗法”包括临床和美容疗法。

本文还教导了一种诱导哺乳动物受试者中细胞或神经元修复、再生和/或修缮的方法，所述方法包括在足以诱导细胞或神经元修复的时间或条件下，向哺乳动物受试者全身或局部施用同种异体羊膜外泌体。

在一个实施方案中，本文能够实现诱导人类受试者中细胞或神经元修复、再生和/或修缮的方法，所述方法包括在足以诱导细胞或神经元修复的时间或条件下，向人类受试者全身或局部施用同种异体羊膜外泌体。

在另一个实施方案中，本文预期哺乳动物羊膜外泌体在制造用于哺乳动物受试者的细胞或神经元修复、再生和/或修缮的药物中的用途。

在一个实施方案中，哺乳动物是人类。

因此，本说明书还教导了人类羊膜外泌体在制造用于人类受试者的细胞或神经元修复的药物中的用途。本说明书还教导了人类羊膜外泌体在制造用于治疗脱髓鞘疾病、病况或病症(例如但不限于多发性硬化症)的药物中的用途。

本文教导了一种源自羊膜上皮细胞的羊膜外泌体的分离的样品。这包括来自人类羊膜外泌体羊膜上皮细胞的人类羊膜外泌体的分离的样品。提出在改进的基于细胞的治疗方案中使用这些羊膜外泌体。因此，本发明延伸至一种包括为用于治疗哺乳动物受试者而选择的同种异体哺乳动物羊膜外泌体的药物组合物，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

在一个实施方案中，哺乳动物受试者是人类受试者。

因此，本发明教导了一种用于治疗人类受试者的包括人类同种异体羊膜外泌体的药物组合物，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

另外，所述组合物可以是用于治疗人类受试者的包括人类同种异体羊膜外泌体的化妆品组合物，所述化妆品组合物还包括一种或多种化妆品可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

药学上可接受的载体可以含有生理上可接受的化合物，其例如起到稳定羊膜外泌体的作用。生理上可接受的化合物可以包括例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质或赋形剂包括水或盐水或其它稳定剂和/或缓冲剂。还可以使用洗涤剂来稳定或增加或降低羊膜外泌体(包括脂质体载体)的吸收。药学上可接受的载体和制剂是本领域技术人员已知的，并且在科学和专利文献中有详细描述，例如参见remington'spharmaceuticalsciences(1990)，第18版，mackpublishingcompany，easton(“remington's”)。

其它生理上可接受的化合物包括可用于防止羊膜外泌体制剂中微生物的生长或作用的防腐剂。各种防腐剂是众所周知的，包括例如抗坏血酸。本领域技术人类员将理解，药学上可接受的载体(包括生理上可接受的化合物)的选择取决于例如本发明羊膜外泌体的施用途径以及由外泌体所产生的蛋白质和核酸的特定生理学或生物化学特征。

药物组合物形式的羊膜外泌体的施用可以通过本领域技术人员已知的任意方便的手段并根据疾病或病况或损伤部位来进行。施用途径包括但不限于：呼吸(respiratorally)、气管内、鼻咽(nasopharyngeally)、静脉内、腹腔内、胸腔内、皮下、颅内、皮内、肌内、眼内(intraoccularly)、鞘内、脑内、鼻内、直肠、局部、贴剂、绷带和植入。在一个实施方案中，可以将羊膜外泌体喷到例如严重烧伤的受试者上。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体。

通常通过将各种无菌活性成分掺入到含有羊膜外泌体的无菌载体中，来制备分散体形式的无菌注射溶液。

对于肠胃外施用，可以用药物载体配制羊膜外泌体，并以悬浮液的形式施用。说明性的合适的载体是水、盐水、右旋糖溶液、果糖溶液、乙醇或动物油、植物油或合成来源的油。载体还可以含有其他成分，例如防腐剂、缓冲剂等。当鞘内注射施用羊膜外泌体时，也可以将它们配制在脑脊液中。

对于经粘膜或经皮施用，适合渗透屏障的渗透剂可用于递送药剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的，例如用于经粘膜施用的胆汁盐和夫西地酸衍生物。另外，可以使用洗涤剂来促进渗透。经粘膜施用可以通过鼻腔喷雾剂或使用栓剂，例如sayani和chien(1996)critrevtherdrugcarriersyst13:85-184。

本发明的羊膜外泌体也可以以持续递送或持续释放的机制施用，其可以在一段时间内在内部递送外泌体。例如，本发明的制剂可以包括可生物降解的微球体或胶囊或能够持续递送羊膜外泌体的其它可生物降解的聚合物构型(例如putney和burke(1998)natbiotech16:153-157)。

在制备本发明的药物组合物时，可以使用和操作各种制剂技术来改变生物分布。许多用于改变生物分布的方法是一个本领域普通技术人员已知的。这种方法的实例包括将外泌体保护在由例如蛋白质、脂质(例如脂质体)、碳水化合物或合成聚合物等物质组成的囊泡中。对于药代动力学的一般性讨论，参见例如remington's。

取决于施用方法，本发明的药物组合物可以以各种单位剂量形式施用。这种剂量通常是忠告性质的，并根据特定的治疗情况进行调整。将足以实现这一点的羊膜外泌体的量定义为“有效量”。用于这个用途的剂量方案和有效量，即“给药方案”将取决于各种因素，包括疾病或病况的阶段，疾病或病况的严重程度，患者健康的一般状态，患者的身体状况、年龄，药物制剂以及羊膜外泌体的浓度或选择。在计算患者的给药方案时，也将施用方式考虑在内。给药方案还必须考虑药物组合物的清除速率等。参见例如，remington’s；egleton和davis(1997)，peptides18:1431-1439；langer(1990)，science249:1527-1533。在一个实施方案中，施用从0.05μg至100μg的羊膜外泌体。在这其中包括从0.1μg至50μg和0.1μg至20μg以及其间的任意量。

根据这些方法，羊膜外泌体或包括其的药物组合物可以与一种或多种其他药剂联合共同施用。本文中提及的“共同施用”是指通过相同或不同路径以相同制剂或两种不同制剂同时施用，或者通过相同或不同路径相继施用。本文提及的“相继”施用是指在羊膜外泌体与另一种药剂的施用之间的秒、分、小时或天的时间差异。共同施用可能以任意顺序发生。可以共同施用的药剂的实例包括细胞因子。通常，另一种药剂的选择是以待治疗的疾病或病况为基础的。

或者，靶向疗法可用于通过使用靶向系统，如抗体或细胞特异性配体，将羊膜外泌体递送至体内一些类型的细胞或位置。由于各种原因，靶向可能是被期望的，例如以促进需要治疗的部位的局部治疗。

本文还教导了羊膜外泌体的产生。方便地，这可以在生物反应器中完成，所述生物反应器可以是分批培养反应器或连续流动培养反应器的形式。通常，羊膜上皮细胞被永生化并被用于在生物反应器中接种生长培养基。然后收集得到的条件培养基，分离羊膜外泌体，并配制以便立即使用或储存，例如通过冷冻干燥供以后使用。

本文还预期试剂盒。试剂盒可能是治疗性的或诊断性的。治疗性试剂盒可以包括所选择批次的冻干羊膜外泌体和一种或多种其他药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂和/或另一种活性剂。诊断性试剂盒可以包括用于确定一批羊膜外泌体的蛋白质组学或遗传学图谱的试剂。

实施例

现在通过以下非限制性实施例进一步描述本文所教导的各方面。

实施例1

羊膜外泌体的产生

开发了一种分离羊膜外泌体的方案(图1)。这是羊膜外泌体的首次描述以及它们的生物学活性的验证。将haec的原代分离物在无血清培养基(ultraculturemedia，lonza)中培养96小时，然后通过110,000g连续超速离心来去除细胞并处理条件培养基用于外泌体分离。无论胎龄如何，每一百万haec始终纯化出大约1.5-2μg纯化的外泌体。这可以在生物反应器式培养中放大而不被凋亡小体污染。

测试了羊膜外泌体发挥类似作用的能力。羊膜外泌体以与haec条件培养基类似的程度抑制t细胞增殖，具有明显的剂量效应(0.1μg对1μg)。从haec条件培养基耗尽外泌体(exdcm)则消除了这种效应(图2a)，表明羊膜外泌体是t细胞抑制的主要介导因子(mediator)。羊膜外泌体能够直接增加巨噬细胞的吞噬活性(图2b)。这些发现表明，haec条件培养基的免疫调节作用主要归因于外泌体。

实施例2

羊膜外泌体的活性

确定羊膜外泌体在体内是否有功能。在出生后第4天，将1μg羊膜外泌体等分试样静脉内注射到bpd小鼠中，并在出生后第14天评估组织：空气比例。羊膜外泌体有效地逆转肺泡发育简单化(alveolarsimplification)(图3)。羊膜外泌体起着主要作用，它们由此阻止或逆转肺结构的有害改变——通过降低肺泡发育简单化和募集内源干细胞，同时解决bpd小鼠中的炎症。

总之，数据表明，羊膜外泌体以与其亲代细胞类似的方式调节宿主免疫事件和肺修复。据提出，羊膜外泌体可以重演(recapitulate)体内haec的再生能力。通过揭示羊膜外泌体货物的性质，它们可用于发挥深远的免疫调节和促修复作用。

使用bpd小鼠模型来确定新生儿施用羊膜外泌体可以恢复肺结构、激活肺干细胞生态位以及调节bpd小鼠炎症至与haec治疗的动物相当的水平。进一步确定这将导致长期生理结果(例如肺动脉高压和肺功能)的改善。对羊膜外泌体的蛋白质组学和mrna/mirna含量进行分析以确定与haec介导的修复相关的具体通路。

实施例3

羊膜外泌体在bpd小鼠中的修复作用

数据表明，羊膜外泌体在体外和体内发挥免疫调节和促再生作用。为了理解羊膜外泌体在修复期间如何影响细胞交互作用(crosstalk)并确定单独的羊膜外泌体是否足以重演haec在bpd动物模型中的修复作用，比较了两种剂量的羊膜外泌体(1μg和10μg)与优化剂量的haec的作用。使用成纤维细胞和成纤维细胞外泌体作为对照。

使用bpd小鼠模型来评估足月和早产羊膜外泌体对肺修复的影响，所述bpd小鼠模型组合了人类bpd的两个主要促成因素——围产期炎症和出生后高氧。尽管使用啮齿动物建立复杂疾病如bpd模型存在局限性，但这个模型本身适用于详细的分子分析。啮齿动物研究对于剂量效应的评估具有相对可承受性，长期研究调查青春期和成年期结果。简而言之，使用微型玻璃针(内径：70-80μm)和显微注射器(im-300，narashige)，将5μl生理盐水中的0.2μg脂多糖(lps)注射入e16小鼠胚胎的每个羊膜囊中。一旦出生，则将新生的小鼠幼崽和他们的哺乳大鼠(nursingdam)置于高氧室(65％的氧气)或室内空气中。哺乳大鼠每48小时旋转一次以防止氧气中毒。产前炎症和产后高氧症的这种组合导致类似于人类bpd的肺损伤(vosdoganes等人(2013)cytotherapy15:1021-1029；nold等人proc.natlacad.sciusa110:14384-14389)。在出生后第4天施用所述疗法。描绘了在e16时羊膜内注射lps、在出生后第4天注射外泌体/细胞以及采集点(交叉)的实验时间线显示于图4中。

使用与羊膜内注射所描述的相同的设备和更宽的玻璃针(内径100-120μm)，通过颞浅静脉静脉内施用外泌体或细胞。最终的注射体积为10μl，这被4日龄小鼠很好地耐受。在出生后的第7天和第14天，捕获鼠幼崽用于评估免疫学变化以及肺干细胞募集和肺修复。然后将两组动物在断奶后转移至室内空气中，并在4周龄和10周龄时进行测试以评估新生儿疗法对长期结果(例如，青春期和成年早期的肺动脉高压、心血管和呼吸功能)的作用。

从足月(37-40周)人类妊娠中分离haec。将初级分离物用于实验。来自6位供体的haec被同等地混合，为所有动物实验提供统一的群体。接受haec的动物在出生后第4天接受100,000haec的单次注射。对于羊膜外泌体，将一部分混合的haec置于培养基(1000万个每25mlultraculture培养基，lonza)中96小时。然后从条件培养基中分离外泌体。通过对外泌体标志物(tsg101和alix)进行蛋白质印迹确定了分离的沉淀物的外泌体性质以及通过电子显微镜观察大小和进行辨别。将外泌体重悬于盐水中，并在出生后第4天以1μg或10μg的剂量施用。

人类肺成纤维细胞不支持肺修复并且适合作为对照细胞类型(moodley等(2010)amjrespircritcaremedi:643-651)。施用了人类肺成纤维细胞或使用与上述相同的培养方案而获得的成纤维细胞外泌体。以与haec相同的剂量施用成纤维细胞，并以较高剂量(10μg)施用成纤维细胞外泌体。实验组描述于表1中。

表1

实验组

免疫学变化

如前所述收集肺并处理用于流式细胞术(nold等人(2013)同上；tan等人(2015)stemcellres.ther.6:8)。分选cd45+馏分，并且使用表面标志物和细胞内细胞因子染色的组合来评估t细胞(cd3、cd4、cd25、ifnγ、il-4、il17a、foxp3)、巨噬细胞(cd11b、f4/80、cd86、mhcii)、嗜中性粒细胞(cd11c、ly6g)、b细胞(b220)和nk细胞(nk1.1)的数量、表型和活化状态的变化。收集支气管肺泡灌洗液从而如前所述使用proteomeprofiler(r&dsystems)来测量细胞因子的变化(nold等人，(2013)同上)。

肺干细胞/祖细胞募集

基于标准cd45-/cd31-/sca-1+/epcam+通过流式分选来确定basc群体的变化(lee等(2014)cell156:440-455)。这使用来自以上免疫细胞研究的细胞的cd45+馏分。基于cd31-/sca-1-/自荧光^高的流式分选来分选at2。使用单细胞数字pcr(fluidigm，qdpcr37k)确定转录谱的差异。将流式分选的单细胞捕获在96孔微流控板(c1singlecellautoprepsystem，fluidigm)上，在其中将发生细胞裂解、rna分离、预扩增和cdna转化。然后将样品加载到微流控芯片卡上用于数字pcr。使用singularv2.0分析工具组分析数据。由于对basc和at2的生态位激活通路描述较少，所以采用了定制的48:48deltagene测定，其涵盖干细胞多能性、激活、募集和分化，包括最近描述的bmp1/nfatc1/血小板反应蛋白-1轴(bmp1/nfatc1/thrombospondin-1axis)(lee等人(2014))同上)。

肺泡发育简单化

进行组织：空气比例的定量图像分析测量以确定在所有实验组中肺泡发育简单化的程度。

宿主干细胞生态位的激活

对末端细支气管处的basc进行免疫组织化学染色(spc+cc10+)以确定肺干细胞生态位的活化状态(lee等人(2014)同上)。

目的是要知道肺结构的改变和内源性肺干细胞的募集是否延伸至肺功能的长期改善以及降低继发性并发症。

生理学研究

对恢复的青春期(4周龄)和年轻成年(10周龄)小鼠进行肺功能测试和超声心动描记术。

超声心动描记术

将小鼠用3％异氟烷麻醉并以1-2％继续以达到350-450bpm的心率。使用vevo2100超声波(monashbioimaging)和40mhz线性传感器(transducer)来沿着向前成角的左胸骨旁长轴切面进行肺动脉加速时间的pw多普勒测量。通过沿右胸骨旁长轴切面应用m模式来测量右心室壁厚度。使用同组小鼠来进行侵入性肺功能测试。用一个18g插管对他们进行气管造口，所述18g插管连接到联机超声波雾化器、呼吸机和附加的压力传感器(flexivent，scireq，蒙特利尔，加拿大)。通过将小鼠暴露于渐增浓度的乙酰甲胆碱(1-30mg/ml，每周期3分钟)来评估气道阻力和顺应性。获得用力呼气量(forcedexpiredvolume)、肺活量和深吸气量(inspiratorycapacity)。与无限制的全身体积描记法不同，这不需要训练动物，并且能够短时间暂停机械通气以执行测量操作，在此期间测量预定的压力或体积波形。这克服了体积描记法面临的传统挑战，如死腔过大和测量不准确。

据提出，羊膜外泌体在他们引发bpd小鼠的巨噬细胞极化、诱导treg扩增以及降低嗜中性粒细胞和树突状细胞活化的能力方面具有有益效果。据提出，与1μg的对照haec相比，10μg剂量的羊膜外泌体的免疫学变化更巨大。因此，在接受较高剂量的羊膜外泌体的动物中，肺泡发育简单化的逆转更大。这意味着长期生理结果有所改善，使得将存在剂量依赖性的右心室壁增厚降低、肺动脉高压减轻和正常肺功能恢复。当向健康小鼠给予haec或羊膜外泌体时，预期没有变化。成纤维细胞或成纤维细胞外泌体未被提出对免疫细胞、肺修复或长期生理结果有作用。

实施例4

羊膜外泌体中的独特介导因子

haec供体的胎龄对其修复能力具有显著的影响(lim等人(2013)placenta34:486-492)。在从足月和早产haec收集的外泌体货物之间进行了比较。在制备中，施用来自足月和早产供体的羊膜外泌体，并且显示仅在接受了来自足月供体的羊膜外泌体的动物中肺泡发育简单化才被逆转，从而表明在早产羊膜外泌体中，激活免疫调节和再生通路的能力显著受损。当对外泌体货物进行初始存在/不存在蛋白质组学分析时，分别鉴定了足月和早产供体中的242和21个独特蛋白质。使用基因本体论分析，确定足月羊膜外泌体含有与伤口愈合、细胞凋亡、血管发育、急性炎症和上皮细胞发育相关的细胞信号传导的介导因子。

对于蛋白质组学分析，进行羊膜外泌体(足月和早产，每组n＝10)的溶液中胰蛋白酶消化，然后进行液相色谱和质谱来绝对定量(wehi蛋白质组学实验室，墨尔本，澳大利亚)。使用q-exactive组合型四极杆-轨道阱质谱仪获取数据，所述q-exactive组合型四极杆-轨道阱质谱仪与nano-esi源(proxeon)适配，所述nano-esi源(proxeon)与nanoacquityuplc系统(waters)耦合。将每个lc-ms/ms运行的峰列表合并到单个mascot文件中，并针对人类ref-seq蛋白质数据库(1％错误发现率)进行搜索。使用pipelinepilot(accelrys)和spotfire(tibco)分析定量蛋白质组学数据。使用wilcoxon符号秩检验(wilcoxonsigned-ranktest)评估丰度差异。uniprot数据库根据功能、亚细胞定位对蛋白质进行分类，并指定参与伤口愈合、细胞存活和免疫调节的基因。

对于核酸分析，使用cdna末端的massiveanalysis(mace，genxprogmbh)进行数字基因表达谱分析。这使得能够以比rnaseq(1-20个拷贝每一百万转录本)深约20倍捕获和定量少量的转录本，例如通常在微阵列中丢失的受体和转录因子。对mace进行优化以测序来自外泌体的小rna和mirna，并通过标记每个cdna分子而结合了qpcr阵列和rnaseq的优点。它确定了影响mrna-mirna相互作用并从而决定转录本的稳定性和生物学相关性的可变聚腺苷酸化(alternativepolyadenylation)。进行了成对比较的基因本体论富集和基因集富集分析。

在足月和早产羊膜外泌体之间将存在独特的分子特征，这涉及它们的促修复和再生作用。

实施例5

促再生作用

证实了羊膜外泌体在支气管肺发育不良的新生小鼠模型中的促再生作用。在施用来自足月或早产羊膜组织的外泌体后观察到肺泡修剪(alveolarpruning)(图12a至d)。术语“bpd”是指支气管肺发育不良小鼠模型动物。

实施例6

外泌体的作用机制

测试了源自足月的人类外泌体与人类羊膜上皮细胞(haec)的诱导肺再生的能力。结果显示在图13a至图13c中。足月外泌体恢复了次级间隔嵴(secondaryseptalcrest)，如图13中深染色(弹性蛋白阳性)的末梢所示。

另外，图14显示，羊膜外泌体在肺中触发内源性干细胞应答。实际上，羊膜外泌体比haec有效两倍以上。

还观察到，羊膜外泌体可以直接刺激外源性肺干细胞生长的增强。相对于对照，这发生在暴露于外泌体的肺泡、细支气管和混合肺组织中。

实施例7

外泌体在肝脏中抗纤维化

通过为期12周的每周三次腹膜内注射四氯化碳，来诱导8-12周龄的成年小鼠肝纤维化。在第8周，每周两次注射外泌体(1μg)。结果显示在图15a和b中。使用天狼星红测定法和α-平滑肌肌动蛋白(sma)表达测定法来确定成纤维细胞化的细胞(fibrobioticcell)。α-sma在成纤维细胞收缩中起作用。使用标准测定法来确定α-sma表达，并测定每个区域的天狼星红或α-sma阳性面积。使用了炎性巨噬细胞蛋白ccl14。与ccl14+盐水对照相比，ccl14+外泌体导致每个区域纤维化的细胞显著更少(图15a和b)。

实施例8

蛋白质组货物

图16显示，足月外泌体和早产haec之间的蛋白质组货物大致相同。足月与早产haec的蛋白质组学货物之间有更多的差异。所测试的蛋白质列于表2a和2b中。图17显示了haec和总msc之间有用的细胞组分比较。图18还比较了haec和总msc之间的生物学过程。

表2a

羊膜外泌体中的蛋白质组货物：msc常见的蛋白质

表2b

羊膜外泌体中的蛋白质组货物：hace独特的蛋白质

实施例9

外泌体促进髓鞘形成

在多发性硬化的动物模型中测试羊膜外泌体。预期外泌体将促进髓鞘再生，并且可用于治疗多发性硬化症以及其他病况，如视神经炎、德维克氏病、横贯性脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎和肾上腺脑白质营养不良和肾上腺脊髓神经病。

实施例10

外泌体活性

从人类羊膜上皮细胞的条件培养基中分离的外泌体具有免疫调节和促再生作用。羊膜外泌体含有(在其他因子当中)高水平的hla-g。

羊膜外泌体的免疫抑制效应对应于供体的胎龄。这对应于与胎龄相关的供体效力，我们先前在(lim等人类(2013)同上)中已经公开这一点。

在支气管肺发育不良的新生小鼠模型中，羊膜外泌体逆转肺损伤。与盐水相比，静脉内注射的外泌体显著改善组织：空气比例，并且与我们的以下结果相一致：在体外，足月羊膜外泌体在其缓解bpd相关的肺损伤的能力方面优于早产外泌体。这与肺的内源性干细胞生态位即细支气管肺泡导管连接处的激活有关。结果如图5所示。提出，羊膜外泌体将可用于治疗肺纤维化和其他器官的纤维化。

在博来霉素诱导的肺纤维化的小鼠模型中，羊膜外泌体逆转建立的肺部炎症和纤维化。博来霉素挑战7天后鼻内施用羊膜外泌体显著降低肺中活化的肌成纤维细胞(α-平滑肌肌动蛋白阳性)的百分比。这与肺中胶原蛋白沉积的降低是一致的。结果显示在图6中。

羊膜外泌体在体外直接逆转原代人类肺成纤维细胞的活化。当在存在5ng/ml转化生长因子β的情况下培养时，羊膜外泌体在24小时内降低了α-平滑肌肌动蛋白的蛋白质水平。结果显示在图7中。

羊膜外泌体含有靶向细胞因子-细胞因子受体信号传导通路的mirna，如图8所示，其中黄色框表示一个或多个mirna的靶标。

羊膜外泌体含有靶向wnt信号传导通路的mirna，如图9所示，其中黄色框表示一个或多个mirna的靶标。

羊膜外泌体含有靶向pi3k-akt信号传导通路的mirna，如图10所示，其中黄色框表示一个或多个mirna的靶标。

羊膜外泌体含有靶向tgfβ信号传导通路的mirna，如图11所示，其中黄色框表示一个或多个mirna的靶标。

很明显，就算羊膜外泌体不比aec(如haec)更有效，起码与aec(如haec)同效，并且在多种范围的生理和神经过程中具有诱导细胞和分子修复机制的巨大能力。

本领域的技术人员将会理解，除了具体描述的那些以外，本文所描述的公开内容可以进行变化和修改。应该理解的是，本公开意欲保护所有这些变化和修改。本公开还能够单独地或共同地实现本说明书中提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，并且能够实现任意两个或更多个所述步骤或特征或组合物或化合物的任意和所有组合。

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