新颖的大环化合物的制作方法

发明领域

本发明涉及新颖的环孢菌素衍生物、包含其的组合物、用于其制备的方法、其合成中的中间体、及其作为治疗剂例如作为抗病毒剂的用途。

发明背景

环孢菌素a由于其免疫抑制活性和一系列治疗用途而被熟知，包括抗真菌、抗寄生虫和抗炎活性以及抗hiv活性。已经报道环孢菌素a和某些衍生物抑制乙型肝炎病毒dna的复制和体外hbsag产生，参见xie等人,actapharmacologicasinica,2007,第28卷，第975-984页；gallay等人,gastroenterology2015,第148(2)卷,第403-414页。已经提出此活性依赖于所述环孢菌素衍生物结合到并抑制亲环蛋白的能力，参见gallay等人。

乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒经由与膜转运蛋白牛磺胆酸钠共转运多肽(ntcp)的相互作用感染肝细胞，参见yan等人,elife2012,00049。已经报道环孢菌素a和某些衍生物抑制hbv和hdv与ntcp的相互作用来在体外阻断肝细胞的感染，参见urban等人,journalofhepatology2014,第60卷,第723-731页；watashi等人,hepatology2014,第59卷,第1726-1737页。环孢菌素a和某些衍生物的被描述为“进入抑制(entry-inhibition)”的此活性，被报道为独立于详细描述的环孢菌素衍生物抑制亲环蛋白的能力，参见watashi等人,hepatology2014,第59卷,第1726-1737页。

在1位(bmt)被修饰以引入四氢呋喃环的环孢菌素a(环孢菌素)衍生物在文献中是已知的。例如，6-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-(2-羟乙基)-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素a已经被描述为在施用环孢菌素a后在某些动物和人中产生的代谢物，参见maurer等人,drugmetab.dispos.,1984,12,120。此化合物的生物学活性由freed等人,transplantationproceed.1991,第23卷,第980-981页描述。6-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-(1-羟乙基)-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素a由liu等人,clinicalbiochemistry1998,31,173-180描述并由durette等人,transplantationproceed.1988,第2卷,第51-57页评价免疫抑制活性。6-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-(1-碘乙基)-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素a被petcher等人,helv.chim.acta.1976,59,1480-8和mahony等人,clinicalchemistry(washington,dc,usa)1985,31,459-462描述为用于亲环蛋白结合测定和结构研究的试剂。如freitag等人在wo2006066416中描述的，6-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-(1-羟基-2-丙烯基)-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素a由微生物转化产生。没有描述这些化合物的抗病毒活性。

发明概述

在一方面，本发明提供通式(i)的环孢菌素衍生物：

其中：

r¹代表氢；烷基，优选地c1-c6-烷基，任选地被独立地选自or⁴或卤素的1至3个取代基取代；和烯基，优选地c2-c6-烯基，任选地被独立地选自or⁴或卤素的1至3个取代基取代；

r²代表氢；烷基，优选地c1-c6-烷基；和xr⁵；

r³代表氢或羟基，条件是当r²和r³两者均是氢时，则r¹不能是-ch2ch2oh、-ch(oh)ch3、-ch(i)ch3或-ch(oh)ch＝ch2；

x代表硫或氧；

r⁴代表烷基，优选地c1-c3-烷基；

r⁵代表直链或支链烷基，优选地具有从1至6个碳原子，任选地被选自由以下组成的组的一个或更多个基团取代：卤素；羟基；烷氧基；和-nr⁶r⁷；

可以相同或不同的r⁶和r⁷各自代表：

氢；甲基；和乙基；

或r⁴和r⁵与它们被附接到的氮原子一起形成饱和的或不饱和的含有从4至6个环原子的杂环的环，所述环可以任选地含有选自由氮、氧和硫组成的组的另外的杂原子；

或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在某些情况中，取代基r¹和r²可以有助于光学异构化和/或立体异构化。所有这些形式都被本发明所包括。

在另一方面，提供了组合物，组合物包含本文提供的化合物和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

在另一方面，提供了本文提供的化合物的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例包括与碱金属例如钠、钾或锂的盐，或与碱土金属例如镁或钙的盐，铵盐或含氮碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三甲胺、三乙胺、甲胺、丙胺、二异丙胺、n,n-二甲基乙醇胺、苄胺、二环己基胺、n-苄基苯乙胺、n,n’-二苄基乙二胺、二亚苯基二胺、二苯甲胺、奎宁、胆碱、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸或二苄胺的盐。

在另一方面，提供了使用本文提供的化合物或组合物治疗或预防由乙型肝炎病毒或丁型肝炎病毒引起的感染的方法。方法通常包括向具有状况或疾病的受试者施用一定量的有效用于治疗或预防该疾病或状况的化合物或组合物。

详述

附图简述

图1示出了用于测试本发明的化合物作为hbv进入抑制剂的活性的代表性程序；

图2示出了使用hepg2-hntcp-c4细胞测试本发明的化合物抑制hbv进入的结果。通过测量分泌到上清液中的hbs蛋白的量来确定有效性，显示出化合物诱导hbs蛋白产生的显著抑制。

图3示出了使用原代人肝细胞测试本发明的化合物抑制hbv进入。通过测量分泌到上清液中的hbs蛋白的量以及通过产生的hbvdna的抑制来确定有效性，显示出化合物诱导两种标志物的显著抑制。

图4示出了使用被设计为评价依赖于病毒dna的病毒复制的测定系统，本发明的化合物对hbv的复制没有作用。

图5示出了测试本发明的化合物阻止pres1肽结合到人ntcp的能力的结果。

定义

当提及本发明的化合物或复合物时，以下术语具有以下含义，除非另有指明。

“环孢菌素”指的是本领域技术人员已知的任何环孢菌素化合物或其衍生物。参见例如ruegger等人,1976,helv.chim.acta.59:1075-92；borel等人,1977,immunology32:1017-25；其内容据此通过引用以其整体并入。本发明的示例性化合物是环孢菌素衍生物。除非另有说明，否则本文描述的环孢菌素是环孢菌素a，且本文描述的环孢菌素衍生物是环孢菌素a的衍生物。

下文使用的环孢菌素命名法和编号体系是由j.kallen等人,"cyclosporins:recentdevelopmentsinbiosynthesis,pharmacologyandbiology,andclinicalapplications",biotechnology,第二版,h.-j.rehm和g.reed编辑,1997,第535-591页所使用的那些，并且在以下示出：

这对应于如以下示出的式(i)的化合物中的饱和环碳原子：

“烷基”指的是特别地具有多达11个碳原子的单价的饱和脂肪族烃基基团，更特别地作为从1至8个碳原子的低级烷基，且仍更特别地从1至6个碳原子的低级烷基。烃链可以是直链或支链的。此术语通过基团例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正辛基、叔辛基及类似基团来示例。

“烯基”指的是单价的烯属不饱和烃基基团，在一种实施方案中，具有多达11个碳原子，在其他实施方案中，具有从2至8个碳原子，且在另一种实施方案中，具有从2至6个碳原子，烯基可以是直链的或支链的并且具有至少1个或从1至2个烯属不饱和位点。在一些实施方案中，烯基基团包括乙烯基(ethenyl)(-ch＝ch2)、正丙烯基(-ch2ch＝ch2)、异丙烯基(-c(ch3)＝ch2)、乙烯基(vinyl)和被取代的乙烯基及类似基团。

“环杂烷基”是指含有从4至6个环原子和从1至4个杂原子的环，所述杂原子可以是相同的或不同的，选自氮、氧和硫。

“含有从4至6个环原子的饱和的或不饱和的环”是指仅含有碳原子的环，或含有碳原子和非碳原子(例如n)的杂环的环。

当描述取代基时，“任选地被取代的”是指否则将存在于取代基上的氢原子的取代。当讨论环体系时，任选的取代通常是用1、2或3个取代基代替正常存在的h。然而，当讨论直链(包括支链)部分时，取代基的数目可以更多，在h通常存在的地方出现。取代基可以相同或不同。典型的取代基可以是例如硝基、-nr’r”、氰基、-nr’cor”’、烷基、-so2r”’、-nr’so2r”’、-so2nr’r”、-conr’r”、-conhc6h5、羟基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、巯基(-sh)、硫代烷基和卤素，其中相同或不同的r’和r”各自代表氢或烷基；或当r’和r”各自附接至氮原子时，它们可以形成含有从4至6个环原子的饱和的或不饱和的杂环的环，且其中r”’是烷基或卤代烷基。

“烷氧基”是指其中r是烷基的基团-or。烷基基团具有多达11个碳原子，更特别地作为从1至8个碳原子的低级烷基，且仍更特别地，从1至6个碳原子的低级烷基。特定的烷氧基基团包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1,2-二甲基丁氧基及类似基团。

“n-烷基氨基”是指基团h-nr’-，其中r’选自氢和烷基。烷基基团具有多达11个碳原子，更特别地作为从1至8个碳原子的低级烷基，且仍更特别地，从1至6个碳原子的低级烷基。

“烷氧基羰基”是指基团-c(＝o)-烷氧基，其中烷氧基如本文中定义。

“烯丙基”是指基团h2c＝c(h)-c(h2)-。

“氨基”是指基团-nh2。

“bmt”是指2(s)-氨基-3(r)-羟基-4(r)-甲基-6(e)-辛烯酸。

“cpd”是指化合物。

“羧基”是指基团-c(＝o)oh。

“n,n-二烷基氨基”意指基团-nrr’，其中r和r’独立地代表如本文中定义的烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、环烷基、被取代的环烷基、环杂烷基、被取代的环杂烷基、杂芳基或被取代的杂芳基基团。

“卤素(halogen)”或“卤素(halo)”是指氯、溴、氟或碘。

“羟基”是指基团-oh。

“硫代烷基”是指其中r是烷基的基团-sr。烷基基团具有多达11个碳原子，更特别地作为从1至8个碳原子的低级烷基，且仍更特别地，从1至6个碳原子的低级烷基。实例包括但不限于甲基硫代、乙基硫代、丙基硫代、丁基硫代及类似基团。

“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的任何盐，所述盐保留其生物学性质并且是无毒的或不以其他方式对于药学用途是不合意的。此类盐可以源自本领域熟知的各种有机抗衡离子和无机抗衡离子。此类盐包括：(1)与例如以下的有机酸或无机酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、酞酸、月桂酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、奎宁酸、粘康酸和类似的酸；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子(a)被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子或碱金属或碱土金属的氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化锌和氢氧化钡)、氨代替时形成的盐；或(b)与有机碱例如脂肪族的、脂环族的或芳香族的有机胺(例如氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、皮考啉、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、n-苄基苯乙胺、n-甲基葡萄糖胺、哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵等)配位时形成的盐。

仅以实例的方式，盐还包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等；并且当化合物含有碱性官能团时，还包括无毒的有机酸或无机酸诸如氢卤酸例如盐酸和氢溴酸的盐、硫酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、环戊基丙酸盐、乙醇酸盐、戊二酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、山梨酸盐、抗坏血酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸盐、苦味酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、酞酸盐、月桂酸盐、甲烷磺酸盐(甲磺酸盐(mesylate))、乙烷磺酸盐、1,2-乙烷-二磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)(苯磺酸盐(besylate))、4-氯苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、4-甲苯磺酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸盐、葡庚糖酸盐、3-苯基丙酸盐、三甲基乙酸盐、叔丁基乙酸盐、月桂基硫酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、羟基萘甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、环己基氨基磺酸盐、奎宁酸盐、粘康酸盐和类似物。

术语“生理学上可接受的阳离子”是指酸性官能团的无毒的、生理学上可接受的阳离子抗衡离子。此类阳离子通过钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵阳离子等来示例。

“溶剂化物”是指还包含化学计量的或非化学计量的量的由非共价分子间力结合的溶剂的本发明的化合物或其盐。当溶剂是水时，溶剂化物是水合物。

应理解，具有相同分子式但其原子的键合在性质或顺序方面或其原子在空间中的排列方面不同的化合物被称为“异构体”。其原子在空间中的排列方面不同的异构体被称为“立体异构体”。

将不是彼此镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，并且将是彼此不可重叠的镜像的立体异构体称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心(例如当其被键合至四种不同的基团)时，成对的对映异构体是可能的。对映异构体可以由它的不对称中心的绝对构型表征并且根据cahn和prelog规则被指定为(r)或(s)(cahn等人,1966,angew.chem.78:413-447,angew.chem.,int.ed.engl.5:385-414(勘误:angew.chem.,int.ed.engl.5:511)；prelog和helmchen,1982,angew.chem.94:614-631,angew.chem.internat.ed.eng.21:567-583；mata和lobo,1993,tetrahedron:asymmetry4:657-668)，或可以通过其中分子旋转偏振光的平面的方式来表征并且被指定为右旋的或左旋的(即，分别地指定为(+)-异构体或(-)-异构体)。手性化合物可以作为单独的对映异构体或作为其混合物存在。包含相等比例的对映异构体的混合物被称为“外消旋混合物”。

在某些实施方案中，本发明的化合物可以具有一个或更多个不对称中心；因此，此类化合物可以作为单独的(r)-或(s)-对映异构体或作为其混合物产生。除非另有指示，例如通过指定式的任何位置处的立体异构性，否则在本说明书和权利要求书中的特定化合物的描述或命名意图包括单独的对映异构体及其混合物(外消旋的或以其他方式的)两者。用于确定立体化学和分离立体异构体的方法是本领域熟知的。在特定实施方案中，当用碱处理后，本发明提供了本文描绘的化合物的立体异构体。

在某些实施方案中，本发明的化合物是“立体化学纯的”。立体化学纯的化合物具有将被本领域技术人员认为是“纯的”立体化学纯度水平。当然，此纯度水平将小于100％。在某些实施方案中，“立体化学纯的”指定大体上不含可选择的异构体的化合物。在特定实施方案中，化合物85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％不含其它异构体。

“肌氨酸”或“sar”是指具有结构-n(me)ch2c(＝o)-的本领域技术人员已知的氨基酸残基。本领域技术人员可能把肌氨酸认为是n-甲基甘氨酸。

如本文中使用的，术语“受试者”和“患者”在本文可互换地使用。术语“受试者(subject)”和“受试者(subjects)”是指动物，在一些实施方案中，是指哺乳动物，包括非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如猴诸如食蟹猴(cynomolgousmonkey)、黑猩猩和人)以及人类。在另一种实施方案中，受试者是农场动物(例如马、牛、猪等)或宠物(例如狗或猫)。在一种实施方案中，受试者是人。

如本文中使用的，术语“治疗剂(therapeuticagent)”和“治疗剂(therapeuticagents)”是指可以在治疗、管理或减轻紊乱或其一种或更多种症状中使用的任何的剂(anyagent(s))。在某些实施方案中，术语“治疗剂”是指本发明的化合物。在某些其他实施方案中，术语“治疗剂”不指本发明的化合物。在一种实施方案中，治疗剂是已知可用于、或已被用于或目前正被用于治疗、管理、预防或减轻紊乱或其一种或更多种症状的剂。

“治疗有效量”意指当被施用到受试者用于治疗疾病时足以实现用于疾病的此类治疗的化合物或复合物或组合物的量。“治疗有效量”可能尤其取决于化合物、疾病及其严重程度以及待被治疗的受试者的年龄、重量等而变化。

“thf”意指四氢呋喃。

在一种实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”任何疾病或紊乱是指减轻存在于受试者中的疾病或紊乱。在另一种实施方案中，“治疗”或“治疗”是指减轻至少一个身体参数，其可以是受试者不可识别的。在又另一种实施方案中，“治疗”或“治疗”是指在身体上调节疾病或紊乱(例如可识别症状的稳定)或在生理学上调节疾病或紊乱(例如，身体参数的稳定)或两者。在又另一种实施方案中，“治疗”或“治疗”是指延迟疾病或紊乱的发作。

如本文中使用的，如所使用的术语“预防剂(prophylacticagent)”和“预防剂(prophylacticagents)”是指可以在紊乱或其一种或更多种症状的预防中使用的任何的剂。在某些实施方案中，术语“预防剂”是指本发明的化合物。在某些其他实施方案中，术语“预防剂”不指本发明的化合物。在一种实施方案中，预防剂是已知可用于、或已被用于或目前正在被用于防止或阻止紊乱的发作、发展、进展和/或严重程度的剂。

如本文中使用的，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指由施用疗法(例如预防剂或治疗剂)或施用疗法的组合(例如预防剂或治疗剂的组合)产生的对受试者中的紊乱的一种或更多种症状的复发、发作或发展的预防。

如本文中使用的，措辞“预防有效量”是指足以产生对与紊乱相关的一种或更多种症状的发展、复发或发作的预防的疗法(例如预防剂)的量，或足以提高或改善另一疗法(例如另一预防剂)的预防效果的疗法(例如预防剂)的量。

术语“标签”是指物品的直接容器上的书写的、印刷的或绘图的物质的显示，例如在含有药学活性剂的小瓶上显示的书写的材料。

术语“标签(labeling)”是指任何物品上或其容器或外包装的任一种上或随附此类物品的所有标签和其他书写的、印刷的或绘图的物质，例如与药学活性剂的容器随附的或相关的包装插页或使用说明录像带或dvd。

化合物

注意到，关于一种实施方案描述的任一个或更多个方面或特征可以并入不同的实施方案中，尽管没有具体地相对于其进行描述。即，所有实施方案和/或任一种实施方案的所有特征可以以任何方式和/或任何组合来组合。申请人保留改变任何原始递交的权利要求或相应地递交任何新权利要求的权利，包括能够修改任何原始递交的权利要求以依据和/或并入任何其他权利要求的任何特征(尽管不以该方式原始请求保护)的权利。本发明的这些和其他目的和/或方面在以下陈述的说明书中详细解释。

在一种实施方案中，r¹代表氢；c1-c6-烷基，其任选地被独立地选自or⁴或卤素的1至3个取代基取代；以及c2-c6-烯基，其任选地被独立地选自or⁴或卤素的1至3个取代基取代。在另外的实施方案中，r¹代表任选地被羟基取代的c1-c3烷基。在另外的实施方案中，r¹代表-ch2ch3和-ch2ch2oh。在另外的实施方案中，r¹代表c1-c3烯基。在另外的实施方案中，r¹代表-ch＝ch2。

在某种实施方案中，r²代表氢；c1-c6-烷基；和xr⁵。在某些实施方案中，r²代表c1-c3-烷基。在某些实施方案中，r²代表甲基。在某些实施方案中，r²代表x-(c1-c6-烷基)nr⁶r⁷，其中x代表硫。在另外的实施方案中，r²代表s-(ch2ch2)nr⁶r⁷，其中r⁶r⁷可以是相同或不同的，各自代表氢或具有从1至3个碳原子的直链或支链烷基。在另外的实施方案中，r²代表s-(ch2ch2)nme2。

r³代表氢或羟基，除了当r²和r³两者均是氢时，则r¹不能是-ch2ch2oh、-ch(oh)ch3、-ch(i)ch3或-ch(oh)ch＝ch2。在另外的实施方案中，r³是羟基。

在一种实施方案中，本文提供的化合物选自表1的以下化合物：

表1：

字母a至h在下文中用于表示以上化合物。

本发明的化合物可以通过对于本领域技术人员明显的任何方法制备、分离或获得。示例性的制备方法在以下实施例中详细描述。

根据本发明的特征，式(i)的化合物可以从通式ii的化合物通过选择性修饰基团x来制备。优选地，基团x是芳基硒(arse)、芳基硫代(ars)、卤素、羟基或汞。更优选地，基团x是苯基硒基(phse)或苯基硫代(phs)。

用还原剂处理通式ii的化合物将x基团转化成氢并产生其中r¹是乙基的式i的化合物。优选的还原剂包括但不限于钠/氨、汞齐(mercuryamalgam)、氢化三丁基锡等。

可选择地，用在适当溶剂中的选择性氧化剂处理其中x是苯基硒基或苯基硫代的通式ii的化合物，随后加热溶液，导致消除x基团同时引入碳-碳双键，并产生其中r¹是乙烯基的式i的化合物。优选的氧化剂包括高碘酸钠、间氯过氧苯甲酸等，并且中间体硒亚砜/亚砜优选地被加热至25℃-80℃之间。其中r¹是乙烯基的式i的化合物的进一步转化可以通过例如使所述化合物经受已知实现硼氢化反应的条件来获得。硼氢化的产物的氧化产生其中r¹是-(ch2ch2)oh的式i的化合物。优选的硼氢化试剂包括硼烷-thf、二环己基硼烷和9-bbn。

可选择地，用碱随后用烷化剂(诸如甲基碘)处理其中x是羟基的通式ii的化合物产生其中r¹是ch(or⁴)ch3且r⁴是甲基的通式i的化合物。此外，用已知将羟基转化为羰基基团的试剂氧化其中x是羟基的通式ii的化合物提供酮，酮可以使用已良好确立的方法被精心制作成(elaborate)其中r1是被取代的或未被取代的亚烷基和被取代的或未被取代的烷基的式i的化合物。用于实现此类转化的优选的试剂包括但不限于鏻叶立德盐(phosphoniumylidsalt)、膦酸盐(phosphonate)试剂、硅阴离子试剂等。

根据本发明的特征，式(ii)的化合物可以通过引起式(iii)的化合物的环化来制备：

所述环化可以通过用在适当溶剂中的亲电试剂处理式iii的化合物来便利地实现。亲电剂被选择使得x基团被引入到式ii的环化产物中。优选地，亲电剂是苯基氯化硒或苯基溴化硒(x＝phse)、苯次磺酰氯或苯次磺酰溴(x＝phs)、n-溴代琥珀酰亚胺(x＝br)、碘(x＝i)、过氧化氢(x＝oh)和乙酸汞ii(x＝hgoac)。

其中r²是c1-c6-烷基；和xr⁵的通式iii的化合物可以从环孢菌素a和4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a通过包括以下的顺序便利地：用惰性溶剂中的强碱处理环孢菌素a或4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a，以产生适当的烯醇化物并使所述烯醇化物与亲电体反应。使用c1-c6烷基卤化物作为亲电体产生其中r²是c1-c6烷基基团的式iii的化合物。使用被取代的二硫化物试剂诸如n,n,n’,n’-四甲基胱胺作为亲电体导致制备其中r²是xr⁵其中x是硫且r⁵是-(ch2ch2)nme2的通式iii的化合物。环孢菌素a和4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a向通式iii的化合物的转化已经在barriere等人,bioorganic&medicinalchemistryletters,2003,第13卷,第4415-4419页；seebach等人,helveticachimicaacta1993,第76卷,第1564-1590页中描述。

当本发明的化合物例如本发明的化合物被碱性部分取代时，可以形成酸加成盐。可以被用于制备酸加成盐的酸包括当与游离碱结合时产生药学上可接受的盐的酸，药学上可接受的盐即其阴离子在盐的药学剂量中对受试者无毒的盐。在本发明的范围内的药学上可接受的盐是源自以下酸的盐：矿物酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸和硝酸；以及有机酸诸如乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、酞酸、月桂酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、奎宁酸、粘康酸和类似的酸。

根据本发明的另外的特征，本发明的化合物的酸加成盐可以通过应用或调整已知方法通过游离碱与适当的酸的反应来制备。例如，本发明的化合物的酸加成盐可以通过以下来制备：将游离碱溶解于含有适当的酸的水溶液或水-醇溶液或其他合适的溶剂中并通过蒸发溶液分离盐；或通过在有机溶剂中使游离碱和酸反应，在该情况中盐直接分离或可以通过浓缩溶液获得。

当本发明的化合物被酸部分取代时，可以形成碱加成盐。本发明的范围内的药学上可接受的盐，包括例如碱金属盐和碱土金属盐，是源自以下碱的盐：氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化锌、氢氧化钡和有机胺，诸如脂肪族有机胺、脂环族有机胺或芳香族有机胺，诸如氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、皮考啉、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、n-苄基苯乙胺、n-甲基葡萄糖胺、哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵等。

药物组合物及施用方法

在本发明的方法中使用的环孢菌素化合物可以在某些实施方案中使用药物组合物来施用，所述药物组合物包含至少一种通式(i)的化合物，在适当的情况下呈盐形式，单独使用或以与一种或更多种相容且药学上可接受的载体诸如稀释剂或佐剂组合的形式使用。在临床实践中，本发明的环孢菌素化合物可以通过任何常规途径施用，特别地口服地、肠胃外地、经直肠地或通过吸入(例如以气溶胶的形式)。在一种实施方案中，本发明的环孢菌素化合物被口服地施用。

除了可用于药物组合物和疾病的治疗方法以及可用作抗病毒剂的本文描述的化合物之外，在本发明的另外的实施方案中，提供了通式(i)的环孢菌素衍生物：

其中：

r¹代表氢；烷基，优选地c1-c6-烷基，任选地被独立地选自or⁴或卤素的1至3个取代基取代；和烯基，优选地c2-c6-烯基，任选地被独立地选自or⁴或卤素的1至3个取代基取代；

r²代表氢；烷基，优选地c1-c6-烷基；和xr⁵；

r³代表氢或羟基；

x代表硫或氧；

r⁴代表烷基，优选地c1-c3-烷基；

r⁵代表直链或支链烷基，优选地具有从1至6个碳原子，任选地被选自由以下组成的组的一个或更多个基团取代：卤素；羟基；烷氧基；和-nr⁶r⁷；

可以相同或不同的r⁶和r⁷各自代表：

氢；甲基；和乙基；

或r⁴和r⁵与它们被附接到的氮原子一起形成饱和的或不饱和的含有从4至6个环原子的杂环的环，所述环可以任选地含有选自由氮、氧和硫组成的组的另外的杂原子；

或其药学上可接受的盐或溶剂化物，用于在药物组合物中使用和/或用于作为抗病毒剂使用和/或用于疾病(诸如hbv和hdv)的治疗。

作为用于口服施用的固体组合物，可以利用片剂、丸剂、硬明胶胶囊、粉末或粒剂。在这些组合物中，根据本发明的活性产品与一种或更多种惰性稀释剂或佐剂诸如蔗糖、乳糖或淀粉混合。

这些组合物可以包含除稀释剂以外的物质，例如润滑剂诸如硬脂酸镁或意图用于控制释放的包衣。

作为用于口服施用的液体组合物，可以利用包含惰性稀释剂诸如水或液体石蜡的药学上可接受的溶液、悬浮液、乳液、糖浆和酏剂。这些组合物还可以包含除稀释剂以外的物质，例如润湿剂、甜味剂或调味产品。

用于肠胃外施用的组合物可以是乳液或无菌溶液。作为溶剂或媒介物，可以利用丙二醇、聚乙二醇、植物油特别是橄榄油、或可注射有机酯例如油酸乙酯。这些组合物还可以包含佐剂，特别是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。灭菌可以以若干种方式进行，例如使用细菌学过滤器、通过辐射或通过加热。它们还可以以无菌固体组合物的形式被制备，所述无菌固体组合物可以在使用时溶解在无菌水或任何其他可注射的无菌介质中。

用于直肠施用的组合物是栓剂或直肠胶囊，其除了有效成分(activeprinciple)以外还包含赋形剂诸如可可油、半合成甘油酯或聚乙二醇。

组合物还可以是气溶胶。对于以液体气溶胶形式的使用，组合物可以是稳定的无菌溶液或在使用时溶解于无热原的无菌水、盐水或任何其他药学上可接受的媒介物中的固体组合物。对于以意图被直接吸入的干燥气溶胶形式的使用，有效成分被精细地划分并与水溶性固体稀释剂或媒介物例如右旋糖酐、甘露醇或乳糖组合。

在一种实施方案中，本发明的组合物是药物组合物或单一单位剂型。本发明的药物组合物和单一单位剂型包括预防有效量或治疗有效量的一种或更多种预防剂或治疗剂(例如本发明的化合物，或其他预防剂或治疗剂)和通常一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂。在具体的实施方案中和在此上下文中，术语“药学上可接受的”意指被联邦政府或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他通常认可的药典中被列举用于动物、并且更特别地用于人类。术语“载体”是指稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(freund’sadjuvant)(完全的和不完全的))、赋形剂或媒介物，它们与治疗剂一起施用。此类药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油来源、动物来源、植物来源或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在某些实施方案中，当药物组合物被静脉内地施用时，水是载体。盐水溶液以及含水的右旋糖溶液和甘油溶液还可以被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体的实例在e.w.martin的“remington’spharmaceuticalsciences”中描述。

典型的药物组合物和剂型包含一种或更多种赋形剂。合适的赋形剂对于药学领域的技术人员是熟知的，并且合适的赋形剂的非限制性实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。特定赋形剂是否适合用于并入到药物组合物或剂型中取决于本领域熟知的多种因素，包括但不限于其中剂型将被施用至受试者的方式和剂型中的具体活性成分。如果需要，组合物或单一单位剂型还可以包含少量润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。

本发明的无乳糖组合物可以包含本领域熟知的且在例如美国药典(usp)sp(xxi)/nf(xvi)中列举的赋形剂。通常，无乳糖组合物包含药学上相容的和药学上可接受的量的活性成分、粘合剂/填充剂和润滑剂。示例性的无乳糖剂型包含活性成分、微晶纤维素、预胶化淀粉和硬脂酸镁。

本发明还包括包含活性成分的无水的药物组合物和剂型，因为水可以有助于一些化合物的降解。例如，水的添加(例如5％)在药学领域中被广泛地接受为模拟长期储存的手段，以便确定诸如保存期限(shelflife)或制剂随时间的稳定性的特性。参见例如jenst.carstensen,drugstability:principles&practice,2d.ed.,marceldekker,ny,ny,1995,第37980页。实际上，水和热加速一些化合物的分解。因此，水对制剂的作用可以是极其重要的，因为在制剂的制造、操作、包装、储存、运输和使用期间通常遭遇水分(moisture)和/或湿度(humidity)。

本发明的无水药物组合物和剂型可以使用无水成分或含低水分的成分以及低水分条件或低湿度条件来制备。在某些实施方案中，如果预期在制造、包装和/或储存期间与水分和/或湿度大量接触，则包含乳糖和至少一种活性成分(所述至少一种活性成分包含伯胺或仲胺)的药物组合物和剂型是无水的。

无水药物组合物应被制备和储存使得其无水性质被保持。因此，使用已知防止暴露于水的材料来包装无水组合物，使得它们可以被包括于合适的制剂药盒(formularykit)中。合适的包装的实例包括但不限于气密密封箔、塑料、单位剂量容器(例如小瓶)、泡罩包装和条带包装(strippack)。

本发明还包括包含一种或更多种化合物的药物组合物和剂型，该化合物降低活性成分将分解的速率。此类化合物，在本文中被称为“稳定剂”，包括但不限于抗氧化剂诸如抗坏血酸、ph缓冲剂或盐缓冲剂。

药物组合物和单一单位剂型可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等的形式。口服制剂可以包括标准载体诸如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在一种实施方案中，此类组合物和剂型将含有预防有效量的或治疗有效量的呈纯化形式的预防剂或治疗剂以及合适量的载体，以提供用于适当施用至受试者的形式。制剂应该适于施用模式。在一种实施方案中，药物组合物或单一单位剂型是无菌的且呈适合用于施用至受试者(诸如动物受试者，在一种实施方案中哺乳动物受试者诸如人受试者)的形式。

将本发明的药物组合物配制成与其预期的施用途径是相容的。施用途径的实例包括但不限于肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、肌肉内、皮下、口服、含服、舌下、吸入、鼻内、经皮、局部、经黏膜、肿瘤内、滑膜内和直肠施用。在具体实施方案中，组合物根据常规程序被配制为适于静脉内、皮下、肌肉内、口服、鼻内或局部施用至人类的药物组合物。在实施方案中，药物组合物根据常规程序被配制为用于皮下施用至人类。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液中的溶液。在必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利诺卡因，以缓解注射部位的疼痛。

剂型的实例包括但不限于：片剂；囊片；胶囊，诸如软弹性明胶胶囊；扁囊剂；锭剂(troche)；锭剂(lozenge)；分散剂；栓剂；软膏剂；泥罨剂(泥敷剂(poultice))；糊剂；粉末；敷料；霜剂；硬膏剂；溶液；贴剂；气溶胶(例如喷鼻剂或吸入剂)；凝胶；适用于口服或经黏膜施用至受试者的液体剂型，包括悬浮液(例如含水或非含水液体悬浮液、水包油乳液或油包水液体乳液)、溶液和酏剂；适用于肠胃外施用至受试者的液体剂型；以及可以被重构以提供适用于肠胃外施用至受试者的液体剂型的无菌固体(例如结晶固体或无定形固体)。

本发明的组合物、形状和剂型类型将通常根据它们的用途变化。例如，在病毒感染的初始治疗中使用的剂型可以包含比在相同感染的维持治疗中使用的剂型所包含的更大的量的一种或更多种活性成分。类似地，肠胃外剂型可以包含比用于治疗相同疾病或紊乱的口服剂型所包含的更少的量的一种或更多种活性成分。其中本发明所涵盖的具体剂型将彼此不同的这些和其他的方式对于本领域技术人员将是容易明白的。参见例如remington’spharmaceuticalsciences,第20版,mackpublishing,eastonpa(2000)。

通常，本发明的组合物的成分被单独地供应或以单位剂型混合在一起供应，例如作为在指示活性剂的量的气密密封容器诸如安瓿或小袋中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当组合物将要通过输注施用时，它可以用含有无菌的药物级水或盐水的输注瓶分配。当组合物通过注射施用时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以便可以在施用之前混合各成分。

本发明的典型剂型包括处于从约0.1mg/天至约1000mg/天的范围内的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，在早晨作为单一每日一次剂量给予，或在一个方面作为细分剂量(divideddose)在一整天中与食物一起给予。在某些实施方案中，本发明的剂型具有约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、1.0mg、2.0mg、2.5mg、5.0mg、10.0mg、15.0mg、20.0mg、25.0mg、50.0mg、100mg、200mg、250mg、500mg或1000mg的活性环孢菌素。

口服剂型

适合用于口服施用的本发明的药物组合物可以呈现为离散剂型，诸如但不限于片剂(例如咀嚼片)、囊片、胶囊和液体(例如调味糖浆)。此类剂型包含预定量的活性成分，并且可以通过本领域技术人员熟知的药学方法制备。通常参见remington’spharmaceuticalsciences,第20版,mackpublishing,eastonpa(2000)。

在某些实施方案中，口服剂型是固体并且在无水条件下用无水成分制备，如在以上部分中详细描述的。然而，本发明的范围延伸超越无水、固体口服剂型。因此，本文描述了另外的形式。

本发明的典型的口服剂型通过根据常规药物复配(compounding)技术将紧密掺合物(intimateadmixture)中的活性成分与至少一种赋形剂组合来制备。赋形剂可以采取多种形式，这取决于期望用于施用的制品的形式。例如，适合用于口服液体剂型或气溶胶剂型的赋形剂包括但不限于水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂和着色剂。适合用于固体口服剂型(例如粉末、片剂、胶囊和囊片)的赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖类、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。

由于它们易于施用，所以片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，在该情况中采用固体赋形剂。如果需要，片剂可以通过标准含水或非含水技术来包衣。此类剂型可以通过任何药学方法来制备。通常，药物组合物和剂型通过以下来制备：将活性成分与液体载体、精细划分的固体载体或二者均匀地且紧密地掺合，并且如果必要然后将产品成形为期望的外观(presentation)。

例如，片剂可以通过压缩或模制制备。压缩的片剂可以通过在合适的机器中压缩任选地与赋形剂混合的活性成分来制备，活性成分呈自由流动形式诸如粉末或粒剂。模制的片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制成。

可以用于本发明的口服剂型的赋形剂的实例包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适合用于药物组合物和剂型的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、天然和合成的树胶诸如阿拉伯树胶、海藻酸钠、海藻酸、其他海藻酸盐、粉末状黄蓍胶、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如乙基纤维素、乙酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素(例如第2208、2906、2910号)、微晶纤维素及其混合物。

适合用于本文公开的药物组合物和剂型的填充剂的实例包括但不限于滑石、碳酸钙(例如粒剂或粉末)、微晶纤维素、粉末状纤维素、葡萄糖结合剂(dextrates)、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预胶化淀粉及其混合物。本发明的药物组合物中的粘合剂或填充剂通常以从药物组合物或剂型的约50重量百分比至约99重量百分比存在。

微晶纤维素的合适的形式包括但不限于作为avicelph101、avicelph103、avicelrc581、avicelph105(从fmccorporation,americanviscosedivision,avicelsales,marcushook,pa可获得)及其混合物销售的材料。具体粘合剂是微晶纤维素和作为avicelrc581销售的羧甲基纤维素钠的混合物。合适的无水或低水分的赋形剂或添加剂包括avicelph103和淀粉1500lm。

在本发明的组合物中使用崩解剂来提供当暴露于含水环境时崩解的片剂。含有太多崩解剂的片剂可能在储存时崩解，而含有太少崩解剂的片剂可以不以期望的速率或不在期望的条件下崩解。因此，既不太多也不太少以致有害地改变活性成分的释放的崩解剂的足够的量应被用于形成本发明的固体口服剂型。使用的崩解剂的量基于制剂的类型变化，并且对于本领域普通技术人员是容易可识别的。典型的药物组合物包含从约0.5重量％至约15重量％的崩解剂，特别是从约1重量％至约5重量％的崩解剂。

可以用于本发明的药物组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂琼脂、海藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾(polacrilinpotassium)、淀粉乙醇酸钠、马铃薯淀粉或木薯淀粉、预胶化淀粉、其它淀粉、黏土、其它藻胶、其他纤维素、树胶及其混合物。

可以用于本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。另外的润滑剂包括例如syloid硅胶(由baltimore,md的w.r.graceco.制造的aerosil200)、合成的二氧化硅的凝聚的气溶胶(由plano,tx的degussaco.市售)、cabosil(由boston,ma的cabotco.销售的热原性二氧化硅产品)及其混合物。如果完全使用，润滑剂通常以它们被并入其中的药物组合物或剂型的少于约1重量％的量使用。

延迟释放剂型

活性成分诸如本发明的化合物可以通过控制释放手段或通过本领域普通技术人员熟知的递送装置来施用。实例包括但不限于在以下美国专利号中描述的那些：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；和4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,639,480；5,733,566；5,739,108；5,891,474；5,922,356；5,972,891；5,980,945；5,993,855；6,045,830；6,087,324；6,113,943；6,197,350；6,248,363；6,264,970；6,267,981；6,376,461；6,419,961；6,589,548；6,613,358；6,699,500，其各自通过引用并入本文。此类剂型可以被用于使用例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球或其组合提供一种或更多种活性成分的缓慢释放或控制释放，以提供不同比例的期望的释放概况。本领域普通技术人员已知的合适的控制释放制剂，包括本文中描述的控制释放制剂，可以被容易地选择用于与本发明的活性成分一起使用。因此，本发明涵盖适合用于口服施用的单一单位剂型，诸如但不限于适于控制释放的片剂、胶囊、囊形片(gelcap)和囊片。

所有控制释放的药物产品具有共同的目标：相对于通过其非控制对应物实现的药物疗法改进药物疗法。理想地，在医学治疗中使用最佳设计的控制释放制品的特征在于采用最少的药物物质以在最少量的时间内治愈或控制状况。控制释放制剂的优势包括延长的药物活性、降低的给药频率和增加的受试者依从性。此外，控制释放制剂可以被用于影响作用的发作时间或其它特性诸如药物的血液水平，并且可以因此影响副作用(例如不利作用)的发生。

多数控制释放制剂被设计为初始释放迅速产生期望的治疗效果的一定量的药物(活性成分)，并且逐渐且持续地释放其它量的药物以在延长的时间段内保持此水平的治疗或预防效果。为了在体内保持该恒定的药物水平，药物必须以一定速率从剂型中释放，该速率将代替从身体代谢和排泄的药物的量。活性成分的控制释放可以通过各种条件刺激，包括但不限于ph、温度、酶、水或其它生理学条件或化合物。

在某些实施方案中，可以使用静脉输注、可植入渗透泵、经皮贴剂、脂质体或其他施用模式来施用药物。在一种实施方案中，可以使用泵(参见sefton,crccrit.ref.biomed.eng.14:201(1987)；buchwald等人,surgery88:507(1980)；saudek等人,n.engl.j.med.321:574(1989))。在另一种实施方案中，可以使用聚合物材料。在又另一种实施方案中，控制释放系统可以在由技术实践者确定的适当部位放置于受试者中，即从而仅需要全身性剂量的一部分(参见例如goodson,medicalapplicationsofcontrolledrelease,第2卷,第115-138页(1984))。其他控制释放系统在langer的综述中讨论(science249:1527-1533(1990))。活性成分可以分散于固体内部基质(solidinnermatrix)中，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑的或未增塑的聚氯乙烯、增塑尼龙、增塑聚对苯二甲酸乙二酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、有机硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、有机硅碳酸酯共聚物(siliconecarbonatecopolymer)、亲水性聚合物诸如丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的水凝胶、胶原、交联的聚乙烯醇和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯，固体内部基质被不溶于体液的外部聚合物膜包围，所述外部聚合物膜为例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、有机硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯，氯乙烯与乙酸乙烯酯、偏氯乙烯、乙烯和丙烯的共聚物，离聚物聚对苯二甲酸乙二酯、丁基橡胶、氯醚橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物以及乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。然后，活性成分在释放速率控制步骤中扩散穿过外部聚合物膜。活性成分在此类肠胃外组合物中的百分比高度依赖于其特定性质以及受试者的需求。

肠胃外剂型

尽管可以使用固体、无水口服剂型，但本发明还提供了肠胃外剂型。肠胃外剂型可以通过多种途径向受试者施用，包括但不限于，皮下、静脉内(弹丸注射(bolusinjection))、肌肉内和动脉内。由于其施用通常绕过受试者针对污染物的天然防御，所以在一种实施方案中，肠胃外剂型为无菌的或在向受试者施用之前能够被灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备好用于注射的溶液、准备好被溶解或悬浮于用于注射的药学上可接受的媒介物中的干产品、准备好用于注射的悬浮液和乳液。

可以用于提供本发明的肠胃外剂型的合适的媒介物是本领域技术人员熟知的。实例包括但不限于：注射用水usp；含水媒介物例如但不限于氯化钠注射液、ringer’s注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸盐化的ringer’s注射液(lactatedringer’sinjection)；水可混溶的媒介物诸如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及非含水媒介物诸如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

增大本文公开的一种或更多种活性成分的溶解度的化合物也可以被并入到本发明的肠胃外剂型中。

经皮剂型、局部剂型&黏膜剂型

在一种实施方案中，可以使用固体、无水口服剂型。在另一方面，本文提供了经皮剂型、局部剂型和黏膜剂型。本发明的经皮剂型、局部剂型和黏膜剂型包括但不限于眼用溶液、喷雾剂、气溶胶、霜剂、洗剂、软膏、凝胶、溶液、乳液、悬浮液或本领域技术人员已知的其它形式。参见例如remington’spharmaceuticalsciences,第16版和第18版,mackpublishing,eastonpa(1980,1990&2000)；和introductiontopharmaceuticaldosageforms,第4版,lea&febiger,philadelphia(1985)。适合用于治疗口腔内的黏膜组织的剂型可以被配制为漱口剂或被配制为口服凝胶(oralgel)。此外，经皮剂型包括“储器型”或“基质型”贴剂，其可以应用至皮肤并携带持续特定的时间段以允许期望量的活性成分渗透。

可以被用于提供本发明所涵盖的经皮剂型、局部剂型和黏膜剂型的合适的赋形剂(例如载体和稀释剂)以及其他材料是药学领域技术人员熟知的，并且取决于给定的药物组合物或剂型将被应用的特定组织。考虑到这一事实，典型的赋形剂包括但不限于水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1,3-二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油及其混合物，以形成无毒且药学上可接受的洗剂、酊剂、霜剂、乳液、凝胶或软膏。如果需要，保湿剂或湿润剂也可以被添加至药物组合物和剂型中。此类另外的成分的实例是本领域熟知的。参见例如remington’spharmaceuticalsciences,第16版和第18版,mackpublishing,eastonpa(1980,1990&2000)。

取决于待被治疗的特定组织，可以在用本发明的活性成分治疗前、与之一起或治疗后使用另外的组分。例如，可以使用渗透增强剂来辅助将活性成分递送到组织。合适的渗透增强剂包括但不限于：丙酮；各种醇诸如乙醇、油烯基(oleyl)和四氢呋喃基(tetrahydrofuryl)；烷基亚砜诸如二甲基亚砜；二甲基乙酰胺；二甲基甲酰胺；聚乙二醇；吡咯烷酮诸如聚乙烯吡咯烷酮；kollidon级(聚乙烯吡咯酮、聚维酮)；脲；和多种水溶性或水不溶性糖脂诸如tween80(聚山梨醇酯80)和span60(脱水山梨醇单硬脂酸酯)。

还可以调节药物组合物或剂型的ph或药物组合物或剂型被应用到的组织的ph来改善一种或更多种活性成分的递送。类似地，可以调节溶剂载体的极性、其离子强度或张力来改善递送。还可以向药物组合物或剂型添加化合物诸如硬脂酸盐/酯，以有利地改变一种或更多种活性成分的亲水性或亲脂性，从而改善递送。在此方面，硬脂酸盐/酯可以充当制剂的脂质媒介物，如乳化剂或表面活性剂，以及充当递送增强剂或渗透增强剂。活性成分的不同的盐、水合物或溶剂化物可以被用于进一步调节所得到的组合物的性质。

治疗或预防受试者的疾病的方法

本发明的化合物通过干扰牛磺胆酸钠共转运肽受体起抑制乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒进入细胞的作用。抗hbv作用和抗hdv作用独立于结合到亲环蛋白或钙调磷酸酶，使得本发明的化合物将被预期不具有与环孢菌素a自身相关的免疫抑制活性。本发明的一些化合物显示针对多种不同的hbv基因型(包括a、b和c)的抗hbv进入活性。此外，本发明的化合物显示针对hbv的核苷耐受形式(nucleosideresistantform)、特别是针对恩替卡韦耐受hbv的抗hbv进入活性。

剂量和单位剂型

在人的治疗中，医生将根据预防性或治愈性治疗并根据年龄、重量、感染的阶段和对待被治疗的受试者特定的其他因素确定他认为最适当的剂量学。通常，剂量对于成人是从约1mg/天至约1500mg/天，或对于成人是从约50mg/天至约1300mg/天或从约100mg/天至1100mg/天。在一种实施方案中，剂量率是从约250mg/天至约1000mg/天。

在另外的方面中，本发明提供了通过向需要其的受试者施用有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐而治疗或预防受试者的hbv感染或hbv/hdv感染的方法。

在预防或治疗紊乱或其一种或更多种症状中将是有效的本发明的化合物或组合物的量将随着疾病或状况的性质和严重程度以及施用活性成分的途径而变化。频率和剂量还将根据每个受试者特定的因素而变化，取决于施用的特定疗法(例如治疗剂或预防剂)、紊乱、疾病或状况的严重程度、施用途径以及受试者的年龄、体重、响应以及过去的医疗史。有效剂量可以根据源自体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线推断出来。

组合物的示例性剂量包括毫克或微克量的活性化合物/千克受试者或样品重量(例如约10微克/千克至约50毫克/千克、约100微克/千克至约25毫克/千克、或约100微克/千克至约10毫克/千克)。对于本发明的组合物，施用至受试者的剂量通常为基于活性化合物的重量的0.140mg/kg至3mg/kg受试者的体重。在某些方面中，施用至受试者的剂量在0.20mg/kg与2.00mg/kg受试者体重之间、或在0.30mg/kg与1.50mg/kg受试者体重之间。

通常，用于本文描述的状况的本发明的组合物的推荐日剂量范围处于从约0.1mg/天至约1500mg/天的范围内，作为单一每日一次剂量或作为一整天内的细分剂量给予。在一种实施方案中，日剂量以等分剂量每日施用两次。特别地，日剂量范围应从约50mg/天至约1300mg/天，更特别地在约100mg/天与约1100mg/天之间，或甚至更特别地在约250mg/天与约1000mg/天之间。在一些情况中，可能必需使用本文公开的范围之外的活性成分的剂量，如将对本领域普通技术人员是明显的。此外，应注意，临床医师或治疗医师将结合受试者响应知晓如何和何时中止、调节或终止疗法。

不同的治疗有效量可以可适用于不同的疾病和状况，如将由本领域普通技术人员容易地知晓的。类似地，足以预防、管理、治疗或减轻此类紊乱但不足以引起与本发明的组合物相关的不良反应的量或足以减少与本发明的组合物相关的不良反应的量也由上文描述的剂量和给药频率方案所涵盖。此外，当受试者被施用本发明的组合物的多个剂量时，不是所有的剂量需要是相同的。例如，向受试者施用的剂量可以被增加以改善组合物的预防效果或治疗效果，或者该剂量可以被降低以减少特定受试者正经历的一种或更多种副作用。

在特定实施方案中，被施用以预防、治疗、管理或减轻受试者的紊乱或其一种或更多种症状的本发明的组合物的剂量或本发明的组合物，基于活性化合物的重量，是0.1mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、10mg/kg、或15mg/kg的受试者的体重或更多。在另一种实施方案中，被施用以预防、治疗、管理或减轻受试者的紊乱或其一种或更多种症状的本发明的组合物的剂量或本发明的组合物是0.1mg至200mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至10mg、0.1mg至7.5mg、0.1mg至5mg、0.1mg至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25mg至15mg、0.25mg至12mg、0.25mg至10mg、0.25mg至7.5mg、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至7.5mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg的单位剂量。

在某些实施方案中，治疗或预防可以由本发明的化合物或组合物的一个或更多个加载剂量、随后的一个或更多个维持剂量引发。在此类实施方案中，加载剂量可以为例如约60mg/天至约400mg/天、或约100mg/天至约200mg/天持续一天至四十八周或从一天至五周。在加载剂量之后的可以是一个或更多个维持剂量。每个维持剂量可以独立地是从约5mg/天至约1500mg/天、或从约10mg/天至约200mg/天，更具体地在约25mg/天与约150mg/天之间，或甚至更具体地在约25mg/天与约80mg/天之间。在某种实施方案中，维持剂量被每日施用并且可以作为单一剂量或作为细分剂量来施用。

在某些实施方案中，本发明的化合物或组合物的剂量可以被施用以实现活性成分在受试者的血液或血清中的稳态浓度。稳态浓度可以根据技术人员可获得的技术通过测量来确定，或可以基于受试者的身体特性诸如高度、重量和年龄。在某些实施方案中，足够量的本发明的化合物或组合物被施用以在受试者的血液或血清中实现从约300ng/ml至约4000ng/ml、从约400ng/ml至约1600ng/ml、或从约600ng/ml至约1200ng/ml的稳态浓度。可以施用加载剂量以实现约1200ng/ml至约8000ng/ml、或约2000ng/ml至约4000ng/ml的稳态血液或血清浓度持续一天至五天。可以施用维持剂量以在受试者的血液或血清中实现从约300ng/ml至约4000ng/ml、从约400ng/ml至约1600ng/ml、或从约600ng/ml至约1200ng/ml的稳态浓度。

在某些实施方案中，施用本发明的相同的组合物可以被重复，并且施用可以分开至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在其他实施方案中，施用相同的预防剂或治疗剂可以被重复，并且施用可以分开至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。

在某些方面，本发明提供呈适合用于施用的形式的包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐的单位剂量。此类形式在上文中详细描述。在某些实施方案中，单位剂量包含1mg至1500mg、5mg至250mg或10mg至50mg的活性成分。在特定实施方案中，单位剂量包含约1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、125mg、250mg、500mg或1000mg的活性成分。此类单位剂量可以根据本领域技术人员熟悉的技术来制备。

组合疗法

本发明提供了治疗或预防的方法，所述方法包括施用有效用于治疗或预防需要其的受试者的hbv感染或hbv/hdv感染的第二剂。第二剂可以是本领域技术人员已知有效用于治疗或预防hbv感染或hbv/hdv感染的任何剂。第二剂可以是本领域技术人员目前已知的第二剂，或第二剂可以是后来开发用于治疗或预防hbv或hbv/hdv的第二剂。

在某些实施方案中，本发明的化合物与一种第二剂组合施用。在另外的实施方案中，第二剂与两种第二剂组合施用。在还另外的实施方案中，第二剂与两种或更多种第二剂组合施用。

合适的第二剂包括可注射蛋白治疗剂或hbv的小分子、口服生物可利用抑制剂。示例性的第二剂包括introna(干扰素α-2b)、pegasys(聚乙二醇化干扰素α-2a)、epivir-hbv(拉米夫定)、hepsera(阿德福韦酯)、baraclude(恩替卡韦)、tyzeka(替比夫定)、viread(特洛福韦)。

在某些实施方案中，本发明的第二剂可以与本发明的环孢菌素衍生物一起配制或包装。当然，当根据本领域技术人员的判断，此类共配制应当不干扰任一种剂的活性或施用方法时，第二剂将仅与本发明的环孢菌素衍生物一起配制。在某种实施方案中，本发明的环孢菌素衍生物和第二剂被单独地配制。它们可以一起包装或单独包装，以方便本领域的实践者。

第二剂的剂量将要在本发明的组合疗法中使用。在某些实施方案中，在本发明的组合疗法中使用低于已经被用于或目前正被用于预防或治疗hbv感染或hbv/hdv感染的剂量的剂量。第二剂的推荐剂量可以获自技术人员的知识。对于批准用于临床使用的那些第二剂，推荐剂量在例如hardman等人编辑,1996,goodman&gilman’sthepharmacologicalbasisofbasisoftherapeutics第9版,mc-graw-hill,newyork；physician’sdeskreference(pdr)第57版,2003,medicaleconomicsco.,inc.,montvale,nj中描述，其通过引用以其整体并入本文。

在各种实施方案中，疗法(例如本发明的环孢菌素衍生物和第二剂)间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1小时至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时或间隔96小时至120小时施用。在某些实施方案中，在同一次患者访问中施用两种或更多种疗法。

在某些实施方案中，本发明的环孢菌素衍生物和第二剂被周期地施用。周期疗法包括施用第一疗法(例如第一预防剂或第一治疗剂)持续一段时间，随后施用第二疗法(例如第二预防剂或第二治疗剂)持续一段时间，随后施用第三疗法(例如第三预防剂或第三治疗剂)持续一段时间等等，并重复此顺序施用即周期，以便降低对剂中的一种的耐受性的形成，以避免或减少剂中的一种的副作用和/或改善治疗的功效。

在某些实施方案中，相同的剂的施用可以重复，并且施用可以分开至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在其他实施方案中，相同的剂的施用可以重复，并且施用可以分开至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。

在某些实施方案中，本发明的环孢菌素衍生物和第二剂按顺序地且在一时间间隔内被施用至患者，例如哺乳动物诸如人，使得环孢菌素衍生物可以与其它剂一起起作用以提供相比于如果它们以其他方式施用增加的益处。例如，第二活性剂可以同时或在不同的时间点以任何顺序依次地施用；然而，如果不同时施用，则它们应当在时间上足够接近地施用以提供期望的治疗效果或预防效果。在一种实施方案中，环孢菌素衍生物和第二活性剂在重叠的时间发挥它们的作用。每种第二活性剂可以被单独地施用，以任何适当的形式和通过任何合适的途径。在其他实施方案中，环孢菌素衍生物在第二活性剂的施用之前、同时或之后施用。

在各种实施方案中，环孢菌素衍生物和第二剂间隔小于约1小时、间隔约1小时、间隔约1小时至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔不超过24小时或间隔不超过48小时被施用。在其他实施方案中，环孢菌素衍生物和第二剂被同时施用。

在其他实施方案中，环孢菌素衍生物和第二剂以间隔约2至4天、以间隔约4至6天、以间隔约1周、以间隔约1周至2周或间隔超过2周被施用。

在某些实施方案中，环孢菌素衍生物和第二剂被周期地施用至患者。周期疗法包括施用第一剂持续一段时间，然后施用第二剂和/或第三剂持续一段时间，并重复此顺序施用。周期疗法可以降低对一种或更多种疗法的耐受性的形成、避免或减少疗法中的一种的副作用和/或改善治疗的功效。

在某些实施方案中，环孢菌素衍生物和第二活性剂以少于约3周、约每两周一次、约每10天一次或约每周一次的周期施用。一个周期可以包括经过约90分钟每周期、约1小时每周期、约45分钟每周期通过输注施用环孢菌素衍生物和第二剂。每个周期可以包括至少1周休息、至少2周休息、至少3周休息。施用的周期数是从约1个至约12个周期，更通常地从约2个至约10个周期，且更通常地从约2个至约8个周期。

在其它实施方案中，向患者同时施用治疗疗程，即在一定时间间隔内还单独地施用单独剂量的第二剂，使得环孢菌素衍生物可以与第二活性剂一起起作用。例如，一种组分可以每周一次地与可以每两周一次或每三周一次施用的其他组分组合施用。换言之，即使治疗剂不被同时施用或不在同一天期间施用，给药方案也同时地进行。

第二剂可以累加地或协同地与环孢菌素衍生物一起起作用。在一种实施方案中，环孢菌素衍生物与一种或更多种第二剂在相同药物组合物中同时地施用。在另一种实施方案中，环孢菌素衍生物与一种或更多种第二剂在单独的药物组合物中同时地施用。在还另一种实施方案中，环孢菌素衍生物在施用第二剂之前或之后被施用。本发明预期了通过相同或不同施用途径例如口服或肠胃外施用环孢菌素衍生物和第二剂。在某些实施方案中，当环孢菌素衍生物与潜在地产生不良副反应(包括但不限于毒性)的第二剂同时施用时，第二活性剂可以有利地以在引发不良副反应的阈值以下的剂量施用。

以下实施例阐释了在本发明中使用的代表性环孢菌素化合物的合成，并且以下参考实施例阐释了它们的制备中的中间体的合成。这些实施例不意图，它们也不应被理解为限制本发明的范围。将清楚的是，本发明可以除如本文具体描述之外地以其他方式进行实践。鉴于本文的教导，本发明的许多修改和变型是可能的，并且因此在本发明的范围内。

实施例a.1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素a

a)1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-[1-(苯基硒代)乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素

向环孢菌素a(2.00g,1.66mmol)在ch2cl2(50ml)中的溶液添加苯基氯化硒(0.319g,1.66mmol)，并且允许所得到的溶液在室温搅拌持续16h。然后将反应在减压下浓缩并通过色谱法在40giscoredisep柱体上使用从100％ch2cl2至9:1ch2cl2:ch3oh的梯度纯化，以得到作为非对映异构体的混合物的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-[1-(苯基硒代)乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素：1.84g(81％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm2.68(s,1.5h),2.69(bs,3h),2.70(s,1.5h),3.08(s,1.5h),3.09(s,1.5h),3.17(s,1.5h),3.18(s,1.5h),3.25(bs,3h),3.36(s,1.5h),3.38(s,1.5h),3.42(s,1.5h),3.50(s,1.5h),7.22–7.33(m,3h),7.34-7.45(m,1.5h),7.52–7.60(m,2h),7.65(d,j＝9.03hz,0.5h),8.00(d,j＝7.27hz,0.5h),8.04(d,j＝6.88hz,0.5h),8.27(d,j＝9.86hz,0.5h),8.37(d,j＝9.52hz,0.5h).ms(esi)680.0[(m+2h)/2]⁺.

b)将1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-[1-(苯基硒代)乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素(0.088g,0.065mmol)在苯(10ml)中的溶液装载有α,α-偶氮异丁腈(0.021g,0.13mmol)和氢化三丁基锡(0.064g,0.22mmol)，并加热至85℃持续16h。然后将反应在减压下浓缩并在12giscoredisep柱体上使用从100％ch2cl2至9:1ch2cl2:ch3oh的梯度进行色谱法。随后从～8ml1:1ch3cn:h2o中冷冻干燥得到作为非对映异构体的混合物的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素a：0.070g(89％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm¹hnmr2.66(bs,3h),2.71(bs,3h),3.08(s,1.5h),3.09(s,1.5h),3.18(s,1.5h),3.19(s,1.5h),3.25(s,1.5h),3.26(s,1.5h)3.38(s,1.5h),3.39(s,1.5h),3.49(s,1.5h),3.51(s,1.5h),7.40(d,j＝8.10hz,0.5h),7.44(d,j＝8.10hz,0.5h),7.48(d,j＝9.08hz,0.5h),7.62(d,j＝8.98hz,0.5h),8.02(d,j＝7.03hz,0.5h),8.05(d,j＝6.88hz,0.5h),8.31(d,j＝9.91hz,0.5h),8.36(d,j＝9.66hz,0.5h).ms(esi)602.0[(m+2h)/2]⁺.

实施例b.1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙烯基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素a

用nahco3(0.015g,0.19mmol)和高碘酸钠(0.053g,0.25mmol)处理1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-[1-(苯基硒代)乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素(0.167g,0.123mmol)在4:1meoh:h2o中的溶液，并将混合物在室温搅拌持续69h。然后将反应混合物用ch2cl2稀释、用饱和nahco3水溶液洗涤、经na2so4干燥、过滤并在减压下浓缩。然后将粗产物在40giscoredisep柱体上使用从100％ch2cl2至9:1ch2cl2:ch3oh的梯度进行色谱法。随后从～8ml1:1ch3cn:h2o中冷冻干燥得到作为非对映异构体的混合物的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙烯基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-环孢菌素a：0.121g(82％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm2.69(s,1.5h),2.70(s,1.5h),2.71(bs,3h),3.08(s,1.5h),3.09(s,1.5h),3.18(s,1.5h),3.19(s,1.5h),3.25(bs,3h),3.38(s,1.5h),3.39(s,1.5h),3.50(s,1.5h),3.51(s,1.5h),7.40(d,j＝8.00hz,0.5h),7.44–7.51(m,1h),7.62(d,j＝9.18hz,0.5h),7.99(d,j＝7.08hz,0.5h),8.06(d,j＝6.83hz,0.5h),8.31(d,j＝9.76hz,0.5h),8.38(d,j＝9.66hz,0.5h).ms(esi)601.0[(m+2h)/2]⁺.

实施例c.1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a

a)1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-[1-(苯基硒代)乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素

以如实施例a中描述的类似方式，使用4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a(0.500g,0.410mmol)和苯基氯化硒(0.079g,0.410mmol)得到作为非对映异构体的混合物的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-[1-(苯基硒代)乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a，0.514g(91％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm1h2.68(s,1.5h),2.69(bs,3h),2.71(s,1.5h),3.12(s,1.5h),3.13(s,1.5h),3.17(s,1.5h),3.18(s,1.5h),3.22(s,1.5h),3.24(s,1.5h),3.37(s,1.5h),3.39(s,1.5h),3.42(s,1.5h),3.49(s,1.5h),7.17-7.31(m,3h),7.35(d,j＝8.10hz,0.5h),7.43(d,j＝8.05hz,0.5h),7.50-7.59(m,2h),7.62(d,j＝8.88hz,0.5h),7.84(d,j＝9.18hz,0.5h),7.99(d,j＝7.17hz,0.5h),8.04(d,j＝6.93hz,0.5h),8.28(d,j＝9.76hz,0.5h),8.34(d,j＝9.57hz,0.5h).ms(esi)688.0[(m+2h)/2]⁺.

b)按照如实施例a(b)中描述的类似程序，从1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-[1-(苯基硒代)乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素(0.514g,0.374mmol)、α,α-偶氮异丁腈(0.092g,0.56mmol)和氢化三丁基锡(0.163g,0.561mmol)获得作为非对映异构体的混合物的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a：0.393g(86％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm2.69(bs,3h),2.71(bs,3h),3.12(s,1.5h),3.13(s,1.5h),3.18(s,1.5h),3.19(s,1.5h),3.24(s,1.5h),3.25(s,1.5h),3.39(s,1.5h),3.40(s,1.5h),3.48(s,1.5h),3.51(s,1.5h),7.39(d,j＝7.96hz,0.5h),7.43(d,j＝7.95hz,0.5h),7.68(d,j＝8.98hz,0.5h),7.81(d,j＝8.98hz,0.5h),8.02(d,j＝7.13hz,0.5h),8.06(d,j＝6.93hz,0.5h),8.32(d,j＝9.86hz,0.5h),8.35(d,j＝9.61hz,0.5h).ms(esi)610.0[(m+2h)/2]⁺.

实施例d.1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙烯基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a

以如实施例b中描述的相似方式，使用来自实施例d(a)的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-[1-(苯基硒代)乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a(3.38g,2.46mmol)、nahco3(0.620g,7.38mmol)和高碘酸钠(1.05g,4.92mmol)获得作为非对映异构体的混合物的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙烯基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a，2.26g(76％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm2.69(s,1.5h),2.69(s,1.5h),2.71(bs,3h),3.12(s,1.5h),3.13(s,1.5h),3.18(s,1.5h),3.19(s,1.5h),3.25(bs,3h),3.39(s,1.5h),3.39(s,1.5h),3.50(s,1.5h),3.50(s,1.5h),7.39(d,j＝8.25hz,0.5h),7.45(d,j＝8.05hz,0.5h),7.69(d,j＝9.03hz,0.5h),7.81(d,j＝9.08hz,0.5h),8.00(d,j＝6.83hz,0.5h),8.07(d,j＝7.03hz,0.5h),8.32(d,j＝9.86hz,0.5h),8.37(d,j＝9.61hz,0.5h).ms(esi)609.0[(m+2h)/2]⁺.

实施例e.1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-(2-羟乙基)-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a

向1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙烯基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a(2.15g,1.77mmol)在thf(100ml)中的溶液逐滴添加1.0m硼烷-thf溶液(5.30ml,5.30mmol)，并将混合物在室温搅拌持续16h。然后将反应装载有2.0nnaoh(3.10ml,6.20mmol)和30％(w/w)含水h2o2(0.90ml,8.85mmol)并在室温搅拌直到实现向产物的完全转化。将反应用etoac稀释并用水洗涤、经na2so4干燥、过滤并在减压下浓缩。粗产物通过色谱法在硅胶柱体上用从100％ch2cl2至9:1ch2cl2:ch3oh的梯度洗脱进行纯化，以得到作为非对映异构体的混合物的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-(2-羟乙基)-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a，1.54g(71％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm2.69(s,1.5h)2.71(bs,3h),2.72(s,1.5h),3.08(s,1.5h),3.13(s,1.5h),3.19(bs,3h),3.20(s,1.5h),3.25(s,1.5h),3.36(s,1.5h),3.39(bs,3h),3.47(s,1.5h),7.19(d,j＝8.00hz,0.5h),7.23(d,j＝8.00hz,0.5h),7.59(d,j＝8.49hz,0.5h),7.64(d,j＝9.08hz,0.5h),7.73(d,j＝7.32hz,0.5h),7.88(d,j＝7.56hz,0.5h),7.98(d,j＝9.76hz,0.5h),8.18(d,j＝10.05hz,0.5h).ms(esi)618.0[(m+2h)/2]⁺.

实施例f.1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a

1-[n-甲基-l-2-[四氢-3r-甲基-5-[1-(苯基硒代)乙基]-2r-呋喃基]甘氨酸]-3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a

使用类似于实施例a(a)中描述的程序的程序，使用3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a(0.300g,0.227mmol)和苯基氯化硒(0.044g,0.227mmol)得到作为非对映异构体的混合物的1-[n-甲基-l-2-[四氢-3r-甲基-5-[1-(苯基硒代)乙基]-2r-呋喃基]甘氨酸]-3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a0.287g(86％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm2.68(s,1.5h),2.68(bs,3h),2.70(s,1.5h),3.16(s,1.5h),3.17(s,1.5h),3.18(bs,3h),3.24(s,1.5h),3.25(s,1.5h),3.40(s,1.5h),3.41(s,1.5h),3.42(s,1.5h),3.50(s,1.5h),5.76(s,0.5h),5.93(s,0.5h),7.23-7.31(m,3h),7.34(d,j＝8.05hz,0.5h),7.39(d,j＝4.25hz,0.5h),7.42(d,j＝4.93hz,0.5h),7.49-7.60(m,2h),7.73(d,j＝8.83hz,0.5h),8.00(d,j＝7.22hz,0.5h),8.03(d,j＝6.93hz,0.5h),8.28(d,j＝9.61hz,0.5h),8.33(d,j＝9.52hz,0.5h).ms(esi)739.5[(m+2h)/2]⁺.

按照与实施例a(b)中描述的类似程序，从1-[n-甲基-l-2-[四氢-3r-甲基-5-[1-(苯基硒代)乙基]-2r-呋喃基]甘氨酸]-3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a(0.243g,0.164mmol)、α,α-偶氮异丁腈(0.040g,0.25mmol)和氢化三丁基锡(0.072g,0.25mmol)获得作为非对映异构体的混合物的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a，0.136g(63％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm2.23(s,6h),2.70(bs,3h),2.71(bs,3h),3.16(s,1.5h),3.16(s,1.5h),3.18(s,1.5h),3.19(s,1.5h),3.24(s,1.5h),3.25(s,1.5h),3.43(s,1.5h),3.45(s,1.5h),3.49(s,1.5h),3.51(s,1.5h),5.97(s,0.5h),6.02(s,0.5h),7.37(d,j＝7.96hz,0.5h),7.42(d,j＝7.95hz,0.5h),7.46(d,j＝8.88hz,0.5h),7.60(d,j＝9.42hz,0.5h),8.05(d,j＝7.17hz,0.5h),8.08(d,j＝6.73hz,0.5h),8.25(d,j＝9.81hz,0.5h),8.29(d,j＝9.66hz,0.5h).ms(esi)661.5[(m+2h)/2]⁺.

实施例g.1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙烯基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a

以如实施例b中描述的类似方式，使用来自实施例g(a)的1-[n-甲基-l-2-[四氢-3r-甲基-5-[1-(苯基硒代)乙基]-2r-呋喃基]甘氨酸]-3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a(0.287g,0.194mmol)、nahco3(0.024g,0.29mmol)和高碘酸钠(0.046g,0.21mmol)获得作为非对映异构体的混合物的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-乙烯基-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a，0.217g(85％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm2.23(s,6h),2.69(s,1.5h),2.70(s,1.5h),2.70(bs,3h),3.16(bs,3h),3.18(s,1.5h),3.19(s,1.5h),3.25(bs,3h),3.43(s,1.5h),3.45(s,1.5h),3.50(s,1.5h),3.51(s,1.5h),5.97(s,0.5h),6.01(s,0.5h),7.38(d,j＝8.10hz,0.5h),7.44(d,j＝7.96hz,0.5h),7.48(d,j＝8.98hz,0.5h),7.61(d,j＝8.93hz,0.5h),8.03(d,j＝6.98hz,0.5h),8.09(d,j＝7.13hz,0.5h),8.26(d,j＝9.81hz,0.5h),8.32(d,j＝9.37hz,0.5h).ms(esi)660.5[(m+2h)/2]⁺.

实施例h.1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-(2-羟乙基)-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-3-[2r-[[2-(二甲基氨基)乙基]硫代]-n-甲基甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a

将n,n-二异丙基乙胺(1.37ml,9.72mmol,12.0当量)在thf(40ml)中的溶液冷却至-25℃，并装载有逐滴添加的正丁基锂(2.5m在己烷中,3.89ml,9.72mmol,12.0当量)。在-25℃搅拌持续30min后，将反应装载有逐滴添加的1-[(2s)-n-甲基-2-[四氢-5-(2-羟乙基)-3-甲基-2-呋喃基]甘氨酸]-4-(4-羟基-n-甲基-l-亮氨酸)-环孢菌素a(实施例f,1.00g,0.810mmol,1.00当量)在thf(5.0ml)中的溶液。在-25℃搅拌持续90min后，将反应装载有n,n-二甲基-2-(对甲苯磺酰基硫烷基)乙胺(1.26g,4.83mmol)在thf(5.0ml)中的溶液。在-25℃搅拌持续2h后，允许反应加热至室温并然后在室温搅拌持续16h。然后将反应装载有饱和的nh4cl水溶液(50ml)并萃取到etoac(3x200ml)中。然后将有机级分汇集、经na2so4干燥、过滤并在减压下浓缩。然后将粗产物在40giscoredisep柱体上使用从100％ch2cl2至9:1ch2cl2:ch3oh的梯度进行色谱法。作为非对映异构体的混合物的5c的收率：330mg(31％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm2.23(s,6h),2.69(s,1.5h),2.70(bs,3h),2.71(s,1.5h),3.16(s,1.5h),3.18(bs,3h),3.20(s,1.5h),3.21(s,1.5h),3.26(s,1.5h),3.42(s,1.5h),3.44(s,1.5h),3.45(s,1.5h),3.49(s,1.5h),5.99(s,0.5h),6.10(s,0.5h),7.21(d,j＝8.39hz,0.5h),7.24-7.31(m,0.5h),7.38(d,j＝8.30hz,0.5h),7.51(d,j＝8.88hz,0.5h),7.81(d,j＝7.03hz,0.5h),7.93(d,j＝7.56hz,0.5h),8.07(d,j＝9.42hz,0.5h),8.16(d,j＝10.05hz,0.5h).ms(esi)669.5[(m+2h)/2].

根据欧洲专利第484,281号中描述的方法制备4-[4-羟基-n-甲基亮氨酸]环孢菌素a，该专利的公开内容通过引用具体地并入。

hbv进入活性

使用watashi等人,hepatology,2014volume59,p.1726–1737中描述的方法，测试本发明的化合物抗hbv感染(进入)的活性。

使用原代人肝细胞和被工程化以表达ntcp转运蛋白的肝细胞细胞系(hepg2-hntcp-c4)测试本发明的化合物作为hbv进入抑制剂的活性。原代人肝细胞(phh)(phoenixbio)的分离和培养基由yamasaki等人,drugmetabpharmacokinet.2010；25:539-550描述。根据制造商的指导，使用transit-lt1(mirus)系统通过将用于人ntcp的表达质粒(参见sugiyama等人,drugmetab.dispos.2006,34,pp1575–1581)转染到hepg2细胞中来制备hepg2-hntcp-c4细胞。

在实验中使用的病毒源自hepad38细胞(参见ladner等人,antimicrobagentschemother1997；41,pp1715-1720)。为了诱导病毒产生，在不存在四环素下培养hepad38细胞。将在诱导后7-31天期间每3天收集一次的培养基通过0.45mm过滤器。使用10％peg8000和2.3％nacl沉淀病毒。洗涤沉淀物并将其以大约200倍浓度用培养基重悬。用hbv以2000-20000(通常6000)基因组当量(geq)/细胞、在4％peg8000的存在下在37℃感染hepg2-hntcp-c4细胞和原代人肝细胞持续16h，如watshi等人,jbiolchem2013；288:31715-31727描述的。

用于测试本发明的化合物作为hbv进入抑制剂的活性的示例性程序包括：i)用化合物处理适当的细胞持续约2小时的时期；ii)加入hbv或hdv病毒并允许感染过程发生持续约16小时；iii)洗涤细胞以去除游离病毒和测试化合物；iv)在不存在化合物的情况下培养细胞持续另外12天；以及通过测量hbvdna、上清液中的hbs蛋白或hbvcccdna确定细胞中hbv的量。此程序可以由图1中示出的示意图呈现。

乙型肝炎表面抗原蛋白(hbs)的测量通过elisa使用以下进行：通过在4℃与绵羊抗hbs抗体以1:5000稀释孵育过夜，然后用0.2％bsa/0.02％nan3/1xpbs在4℃包被直到使用制备的微孔抗原捕获板(maxisorpnunc-immunoplate,nunc#439454)。对于hbs检测，在捕获板的单独的孔中孵育样品持续2h。洗涤后，添加辣根过氧化物酶-标记的兔抗hbs抗体，另外孵育持续2h。反应底物溶液(来自hcvcoreelisa试剂盒:ortho)持续15-60min，然后测量od450值。

根据制造商的方案，通过使用qiaamp迷你试剂盒(qiagen)从细胞提取来测量hbvdna。使用引物集5’-actcaccaacctcctgtcct-3’和5’-gacaaacgggcaacatacct-3’以及探针5’fam-tatcgctggatgtgtctgcggcgt-tamra3’通过实时pcr分析定量hbvdna。使用5’-cgtctgtgccttctcatctgc-3’和5’-gcacagcttggaggcttgaa-3’作为引物以及5’-ctgtaggcataaattggt(mgb)-3’作为探针实现cccdna的检测。按照制造商的方案，使用一步rnapcr试剂盒(takara)检测ntcp、cypa、cypb、和gapdh的mrna。对于ntcp，引物是5’-ccggctgaagaacattgaggcactgg-3’和5’-agggaggaggtggcaatcaagagtgg-3’，对于cypa，引物是5’-ctcctttgagctgtttgcagacaaggtccc-3’和5’-catttgccatggacaagatgccaggacccg-3’，对于cypb，引物是5’-agactgttccaaaaacagtggataa-3’和5’-agtgcttcagtttgaagttctcatc-3’，且对于gapdh，引物是5’-ccatggagaaggctgggg-3’和5’-caaagttgtcatggatgacc-3’。

在某些实施方案中，本发明的化合物以比环孢菌素更大的程度有效地抑制人肝细胞中的hbv感染。当使用hepg2-hntcp-c4细胞测试本发明的化合物对hbv进入的抑制和通过测量分泌到上清液中的hbs蛋白的量确定本发明的化合物的有效性时，化合物诱导hbs蛋白产生的显著抑制(图2)。

当使用原代人肝细胞测试本发明的化合物对hbv进入的抑制和通过测量分泌到上清液中的hbs蛋白的量和通过产生的hbvdna的抑制确定本发明的化合物的有效性时，化合物诱导两种标志物的显著的抑制(图3)。

hbv复制活性

使用如ladner等人,antimicrobagentschemother.1997aug；41(8):1715–1720所描述的被设计为评价依赖于病毒dna的病毒复制的测定系统，显示了本发明的化合物对hbv的复制无作用(图4)。

与ntcp膜转运蛋白的相互作用

hbv和hdv通过涉及hbv大表面蛋白与在细胞上表达的ntcp膜转运蛋白的相互作用的过程感染细胞。pres1肽(参见dandri等人,j.hepatol,2013,vol.58,pp.861-867)呈现了参与结合至ntcp的hbv大表面蛋白的区域。测试本发明的化合物阻止pres1肽与人ntcp结合的能力。将测试化合物和荧光标记的pres1肽序列(pres1-tamra，参见watashi等人,jbiolchem.2015,vol.290(9),pp.5673-84)添加至hepg2-hntcp-c4细胞持续30分钟。洗涤细胞以去除化合物和未结合的pres1-tamra并用多聚甲醛固定细胞。然后用dapi处理细胞持续1小时、洗涤并置于荧光检测以定量pres1-tamra的量。本发明的化合物降低了结合hntcp的pres1-tamra的量，如图5中示出的。

il-2产生的抑制

通过在pma(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)和pha(植物凝集素)共刺激后，用jurkat细胞测量对il-2产生的作用，测试本发明的化合物作为t细胞刺激的抑制剂的活性。在0.1um、1um和10um测试所有新的化合物。还测试环孢菌素a(对照)0.1um、1um和10um。将所有待测的化合物溶解于二甲基亚砜。用平行alamarblue板评价细胞毒性。在透明的、u形底的96孔板中，以2x10⁵细胞/孔将jurkat细胞接种在200μl生长培养基中。细胞培养于rpmi1640培养基、10％胎牛血清和l-谷氨酰胺中，在37℃用5％二氧化碳孵育。在孵育1小时后，用pma(在1％dmso/培养基中的1ng/ml溶液的12.5ul)和pha(在pbs中的5ug/ml溶液的12.5ul)刺激细胞。24小时后，收获样品上清液并保存在-80℃。用rpmi(25ul)稀释上清液的样品(25ul)并通过elisa(pierce,eh2il25)确定人il-2的浓度。

本发明的化合物示出了对il-2产生的以下作用：

测试的本发明的化合物都不显示细胞毒性。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用以其整体并入本文，如同每个单独出版物或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入。虽然已根据各种实施方案描述了本发明，但是技术人员会认识到，可作出各种改进、替代、省略和改变而不违背本发明精神。因此，本发明的范围意图仅由以下权利要求，包括其等效物，的范围限制。