交叉引用本申请要求2015年7月2日提交的美国临时申请号62/231,351的权益，该美国临时申请通过引用以其全文并入本文。序列表本申请包含已经以ascii格式电子提交的序列表，并且通过引用将其全部内容并入本文。于2016年6月29日创建的所述ascii副本被名称为48253-702_601_sl.txt并且大小是1,871字节。技术实现要素：本文提供了用于治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括将树突细胞(dc)与至少一种肿瘤细胞抗原一起温育；向该受试者施用登革病毒2型血清型株denv-2#1710；以及向该受试者施用该dc。本文进一步提供了方法，其中所述至少一种肿瘤细胞抗原得自来自所述受试者的实体癌细胞或血癌细胞。本文进一步提供了方法，其中所述血癌是白血病或淋巴瘤。本文进一步提供了方法，其中所述实体癌是黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌或脑癌。本文进一步提供了方法，其中所述dc通过白细胞去除术(leukapheresis)获得。本文进一步提供了方法，其中所述dc或所述至少一种肿瘤细胞抗原来自所述受试者。本文进一步提供了方法，其中所述dc和所述至少一种肿瘤细胞抗原来自所述受试者。本文进一步提供了方法，其中所述至少一种肿瘤细胞抗原来自所述受试者。本文进一步提供了方法，其中所述至少一种肿瘤细胞抗原存在于包含单细胞的悬浮液中。本文进一步提供了方法，其中用所述至少一种肿瘤细胞抗原来脉冲处理(pulse)所述dc。本文进一步提供了方法，其中所述至少一种肿瘤细胞抗原是肽。本文进一步提供了方法，其中该肽的长度为约9个氨基酸。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒2型血清型株denv-2#1710以足以诱发全身感染的量存在。本文进一步提供了方法，其中在该受试者的体温达到38摄氏度或更高之后施用dc。本文进一步提供了方法，其中在该受试者的体温达到38.5摄氏度之后施用dc。本文进一步提供了方法，其中对该受试者的单核细胞进行加工来获得dc。本文进一步提供了方法，其中所述dc是能够进行抗原摄取的成熟dc。本文提供了用于治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括：裂解来自受试者的肿瘤组织以形成包含凋亡体或坏死体的裂解产物；将树突细胞(dc)与该裂解产物一起温育；向受试者施用登革病毒；以及在该受试者的体温达到38摄氏度或更高之后将所述dc施用于该受试者。本文进一步提供了方法，其中所述肿瘤组织包含来自实体癌或血癌的细胞。本文进一步提供了方法，其中所述血癌是白血病或淋巴瘤。本文进一步提供了方法，其中所述实体癌是黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌或脑癌。本文进一步提供了方法，其中所述dc来自受试者。本文进一步提供了方法，其中所述dc通过白细胞去除术获得。本文进一步提供了方法，其中所述dc并非来自受试者。本文进一步提供了方法，其中所述肿瘤组织在裂解之前存在于包含单细胞的悬浮液中。本文进一步提供了方法，其中用该裂解产物来脉冲处理所述dc。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒以足以诱发全身感染的量施用。本文进一步提供了方法，其中获得dc包括处理受试者的单核细胞以产生树突细胞。本文进一步提供了方法，其中所述dc是能够进行抗原摄取的成熟dc。本文进一步提供了方法，其中所述肿瘤组织的量为0.5-5克。本文进一步提供了方法，其中所述肿瘤组织的量为1-2克。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒是血清型1、2、3、4或5。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒是血清型2。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒是登革病毒2型血清型株denv-2#1710。本文进一步提供了方法，其中在受试者的体温达到38.5摄氏度之后向该受试者施用所述dc。本文提供了用于靶向癌细胞的方法，其包括：将树突细胞(dc)与至少一种肿瘤细胞抗原一起温育；向受试者施用登革病毒2型血清型株denv-2#1710；以及向该受试者施用所述dc。本文提供了用于靶向癌细胞的方法，其包括：裂解来自受试者的肿瘤组织以形成包含凋亡体或坏死体的裂解产物；将树突细胞(dc)与裂解产物一起温育；向所述受试者施用登革病毒；以及在受试者的体温达到38.5摄氏度或更高之后将所述dc施用于该受试者。本文提供了用于减少肿瘤细胞的组合物，该组合物包含有效量的用于启动免疫应答的登革病毒2型血清型株denv-2#1710，其中与任一种药剂单独施用相比，该登革病毒2型血清型株denv-2#1710在施用肿瘤抗原致敏的(primed)树突细胞之前施用时使得肿瘤细胞更多地减少。本文进一步提供了组合物，其中所述肿瘤细胞来自实体癌或血癌。本文进一步提供了组合物，其中所述血癌是白血病或淋巴瘤。本文进一步提供了组合物，其中所述实体癌是黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌或脑癌。本文提供了有效量的登革病毒2型血清型株denv-2#1710在制备用于癌症治疗的药物中的用途。本文提供了有效量的登革病毒2型血清型株denv-2#1710用于治疗癌症的用途。本文提供了用于治疗癌症的有效量的登革病毒2型血清型株denv-2#1710。
背景技术：
：与细胞毒性药物、辐射和手术不同，免疫疗法刺激免疫系统识别并杀死肿瘤细胞。已经在刺激免疫系统识别并破坏肿瘤细胞方面进行了许多尝试。由于选择作为免疫疗法之靶标的肽的自身性(self-identity)、免疫活化的缺乏、不良事件和/或肿瘤免疫逃避机制，因此这些尝试已经取得的成功较为有限。附图说明图1例示了采用登革病毒和致敏的树突细胞的治疗方法。图2示出了对应于在各种治疗条件下小鼠中黑素瘤细胞的肺转移数的图。带有斜线的条代表每种情况下肺转移的平均数。图3示出了对应于在各种治疗条件下小鼠中黑素瘤细胞的肺转移数的图。带有斜线的条代表每种情况下肺转移的平均数。具体实施方式定义贯穿本公开内容，各个实施方案以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应该被解释为对任何实施方案范围的硬性限制。因此，除非上下文另有明确规定，否则范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及该范围内的单个数值(精确到下限单位的十分之一)。例如，如1至6的范围的描述应该认为具有具体公开的子范围，诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的个别值，例如1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都适用。这些中间范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包含在本发明内，受所述范围内任何具体排除的限值所约束。除非上下文另有明确说明，否则在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除这些所包括的界限中的任一个或两者的范围也包括在本发明内。本文所使用的术语仅用于描述特定的实施方案，而并非意图限制任何实施方案。除非上下文另有明确说明，否则如本文所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”也旨在包括复数形式。应当进一步理解，当在本说明书中使用时，术语“包括”和/或“包含”指明了所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但是不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组的存在或添加。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何组合和所有组合。除非特别指出或从上下文中明显看出，否则如本文所使用的，涉及数字或数字范围的术语“约”应理解为是指所述数字和其+/-10％的数字，或针对某一范围所列出的值，是指低于所列出的下限的10％，以及高于所列出的上限的10％。如本文所使用的，术语“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括大鼠、小鼠、非人灵长类动物和灵长类动物(包括人)。联合递送本文描述了组合物和方法，其中将树突细胞接种与登革病毒(dv)株的佐剂作用进行组合，以克服肿瘤免疫逃避机制并消耗肿瘤细胞。本文所述的方法可以用于通过从受试者获得101树突细胞102和肿瘤细胞104，使树突细胞暴露于肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物105(也称为“脉冲处理”树突细胞)以得到致敏的(或“活化的”)树突细胞，在受试者已经用dv108刺激其免疫系统后，将得到的致敏及肿瘤靶向的树突细胞递送107至受试者，来治疗受试者101的癌症(参见例如图1)。任选地，并非来自该受试者的肿瘤抗原可用于脉冲处理树突细胞。肿瘤免疫逃避机制是大多数免疫疗法平台缺乏功效的原因。本文所述的组合物和方法提供了将生理学(肿瘤灌注的过热减少)、免疫学(适应性和先天性免疫系统的效应细胞的激活)和凋亡诱导途径(strail)进行组合以破坏肿瘤细胞的多管齐下的方法。使用dv作为佐剂来激活协同作用的许多途径可以支持突变肿瘤细胞的根除，改善癌症免疫疗法的临床效果。与任何单一方法的递送相比，本文所述的方法提供了基于多种配合的作用机制的癌症免疫疗法，并且导致肿瘤细胞采用耐受方法的能力下降。本文提供了用于治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括：获得树突细胞(dc)；将该dc与至少一种肿瘤细胞抗原一起温育；向该受试者施用登革病毒2型血清型株；以及向该受试者施用所述dc。在一些情况下，该登革病毒2型血清型株为denv-2#1710。在一些情况下，该树突细胞是自体树突细胞。在一些情况下，该树突细胞是同种异体树突细胞。在一些情况下，将dc与至少一种肿瘤抗原一起温育包括将dc与肿瘤细胞一起温育。在一些情况下，将dc与至少一种肿瘤抗原一起温育包括将dc与肿瘤细胞裂解物一起温育。分离和裂解肿瘤细胞的方法本文提供了采用dv和活化dc进行联合疗法以靶向肿瘤细胞的方法。在一些情况下，用来自受试者的肿瘤细胞来致敏dc。在一些情况下，该肿瘤细胞是从受试者的肿瘤微环境中分离的细胞，在本文中被称为肿瘤支持细胞。在一些情况下，树突细胞暴露于肿瘤细胞、肿瘤支持细胞和/或其肽/由其进行脉冲处理，使得树突细胞将会靶向肿瘤细胞和/或支持肿瘤生长和转移的肿瘤支持细胞(例如内皮细胞、血管细胞、免疫细胞等)。在一些情况下，来自肿瘤细胞和肿瘤支持细胞的肽/抗原诱导针对肿瘤细胞和肿瘤支持细胞两者上的肽/抗原具有受体的树突细胞或细胞毒性淋巴细胞，导致树突细胞或细胞毒性淋巴细胞针对肿瘤微环境而不仅仅针对肿瘤细胞的靶向。在一些情况下，肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞从肿瘤组织的活检物获得。在一些情况下，该活检物包括选自肿瘤细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、浸润免疫细胞及其组合的细胞。本文提供了采用dv和活化dc进行联合疗法以靶向肿瘤细胞的方法，其中该dc用裂解的肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞以及周围的细胞外基质进行活化。在一些情况下，裂解包括使肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞与nh4cl酶溶液接触以消除红细胞。在一些情况下，该裂解包括使肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞与次氯酸溶液接触以诱导免疫原性细胞死亡。在一些情况下，足够温和地对细胞进行裂解以不破坏肽。在一些情况下，裂解细胞以产生凋亡体或坏死体。在一些情况下，所述方法包括用酶溶液裂解肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。在一些情况下，所述方法包括用无过氧化物溶液或低过氧化物含量溶液裂解肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。在一些情况下，所述方法包括用去污剂溶液裂解肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。在一些情况下，该去污剂选自但不限于tritonx-100、tritonx-114、np-40、brij-35、brij-58、吐温20、吐温80、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、sds、chaps和chapso。在一些情况下，从该去污剂溶液中去除过氧化物和其他杂质。在一些情况下，该去污剂占去污剂溶液的约0.1％至约10％v/v。在一些情况下，该去污剂占去污剂溶液的约0.1％至约5％v/v。在一些情况下，该去污剂占去污剂溶液的约0.5％至约5％v/v。在一些情况下，该去污剂占去污剂溶液的约1％至约10％v/v。在一些情况下，该去污剂占去污剂溶液的约1％至约5％v/v。在一些情况下，所述方法包括在不摇动、涡旋、冷冻、融化、剪切力、超声处理并且/或者加热细胞的情况下裂解细胞。分离和致敏树突细胞(dc)的方法本文提供了采用dv和活化dc进行联合疗法以靶向肿瘤细胞的方法，其中该dc包含同种异体树突细胞或自体树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括向受试者施用同种异体的经致敏树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括向受试者施用自体的经致敏树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括从骨髓中的cd34+祖细胞获得树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括从外周血中的cd1+cd14+未成熟单核细胞获得树突细胞。在一些情况下，获得树突细胞包括白细胞去除术。在一些情况下，白细胞去除术包括从受试者或供体中抽出一单位血液，分离一系列血液成分：红细胞、血小板和大部分血浆因子，将其返回受试者，而留下白细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括检测白细胞的无菌性，运送或将它们冷藏(4℃)，并且/或者处理来自单采血液成分术产物的dc。在一些情况下，本文所述的方法包括用肽来脉冲处理dc。在一些情况下，该方法包括用与mhci类分子结合的肽(“mhci类肽”)来脉冲处理dc。在一些情况下，本文所述的方法包括用与mhcii类分子结合的肽(“mhcii类肽”)来脉冲处理dc。在一些情况下，本文所述的方法包括用mhci类肽和mhcii类肽来脉冲处理dc。在一些情况下，脉冲处理使得dc能够致敏ctl并将ctl靶向至肿瘤。在一些情况下，本文所述的方法包括用制备/合成的i类和/或ii类肽来脉冲处理dc。在一些情况下，制备i类和/或ii类肽，然后任选地以微克或更少的量将其添加到dc介质中。在一些情况下，本文所述的方法包括用于持续免疫应答的ii类肽。在一些情况下，本文所述的方法包括肽(即肿瘤抗原)的dna或rna测序，和/或使用电穿孔法将dna或rna插入到dc中以触发抗原加工。在一些情况下，本文所述的方法不需要dc的hla匹配。在一些情况下，该肽或其部分由选自egsrnqdwl(seqidno:1)、(tayryhll)(seqidno:2)或其组合的氨基酸序列来表示。在一些情况下，本文所述的方法包括使树突细胞与自体肿瘤细胞或其裂解物接触。在一些情况下，本文所述的方法包括使树突细胞与自体全肿瘤细胞(例如肿瘤细胞和肿瘤支持细胞)或其裂解物接触，后者含有用于广泛和深度免疫应答的潜在抗原的全阵列。在一些情况下，本文所述的方法包括使树突细胞与含有凋亡体或坏死体的肿瘤细胞裂解物进行接触。在进一步的情况下，该肿瘤细胞裂解物包含来自肿瘤细胞周围微环境的肿瘤抗原，如细胞外基质蛋白。在一些情况下，接触包括脉冲处理，其中脉冲处理包括以一个或多个间隔超过一次接触树突细胞。在一些情况下，dc的“脉冲处理”包括使dc与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触。在一些情况下，裂解肿瘤细胞不包括胰蛋白酶消化和冻融循环，胰蛋白酶消化和冻融循环简单且快速，但可破坏内部的精细肽。在一些情况下，本文所述的方法包括使用自动化细胞处理器，如miltenyigentlemacs系统，作为非限制性示例，手动切碎样品；将细胞悬浮于pbs溶液中；并且/或者用预选的组织特定的、软件控制的转子系统分离肿瘤细胞。在一些情况下，对单细胞悬浮液进行膜裂解，这对肿瘤肽的损伤最小。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理dc约1小时至约24小时。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理dc约12小时至约48小时。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理dc约8小时至约24小时。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理dc约18小时。登革病毒本文提供了采用登革病毒(dv)和活化dc进行联合疗法以靶向肿瘤细胞的方法，其中向受试者施用dv。如本文所使用的，术语“登革病毒”包括登革病毒血清型1、2、3、4或5的任何血清型。登革病毒是虫媒病毒(arboviruses)，并且仅由埃及伊蚊(aedesaegypti)和白纹伊蚊(aedesalbopictus)种的蚊子传播。这种病毒具有复杂的生命周期，涉及未确定的森林哺乳动物群(可能是灵长类动物)和人类宿主。雌蚊从受感染的人身上吸食血液，病毒在肠道上皮细胞中复制达高感染滴度(105/ml)，然后蚊子在另一次吸食血液之后利用背压在抽出其口针时将病毒传递给另一人。登革热流行每年感染5000万人，其中有数千人死亡，通常是继发性感染相关休克治疗不足的儿童。登革病毒基因组编码结构蛋白、衣壳蛋白c、膜蛋白m、包膜蛋白e和非结构蛋白：ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5。在一些情况下，该登革病毒是登革病毒的活株。在一些情况下，该登革病毒是登革病毒的减毒株。在一些情况下，该登革病毒是登革病毒的弱毒株。在一些情况下，该登革病毒选自以下血清型的登革病毒：denv-1、denv-2、denv-3、denv-4和denv-5及其组合。登革病毒是披膜病毒科、黄病毒亚科(b组)的正链rna病毒。该病毒具有二十面体(icoashederal)几何形状，且直径约为40-45纳米。11,000个碱基的基因组编码核壳(nc)、蛋白质、prm膜融合蛋白、包膜糖蛋白(e)和5个非结构蛋白ns1-ns5。nc蛋白形成病毒核心，具有通过prm复合体附接的包膜刺突。e糖蛋白是中和抗体的主要靶标，而ns-3和ns-4蛋白质构成cd4+和cd8+ctl的主要靶标。登革病毒构成五种不同的血清型：denv-1至denv-5。血清型2和4对igg是交叉中和的，而1型和3型也是交叉中和。然而，免疫并不完全，并且登革热在病毒感染中是独特的，原因在于非交叉中和血清型的后续感染由于免疫过度激活引起的休克综合征而具有增加的死亡风险。本文提供了组合物和使用此类组合物的方法，其中该组合物包含登革病毒血清型1、2、3、4或5。在一些情况下，该dv是血清型2。在一些情况下，该dv血清型2是denv-2株#1710。该毒株来自于1985年从波多黎各(puertorico)采集的样品，并且使用包膜基因区特异性的4种引物(见表1)在限制性位点特异性rt-pcr分析中表征为a型。参见harris等人,virology253,86-95(1999)。用这些引物进行的限制性位点特异性rt-pcr产生了582个碱基对、754个碱基对和可能676个碱基对的扩增产物。将denv-2株#1710记录在cdc数据库中，条目号为555。参见harris(1999)。denv-2株#1710在波多黎各流行期间被分离。这次暴发有9,540例dv疑似病例，其中有一例疑似的、但未经确认的由于该病毒导致的死亡，这表明den-2株#1710的毒性非常低，因此适用于本文所公开的方法。表1.扩增denv-2病毒的引物的序列和位置引物序列基因组位置链rss15’-ggatcccaagaaggggccat-3’(seqidno:3)1696-1715+rss25’-ggcagctccatagattgct-3(seqidno:4)2277-2259-rss35’-ggtgttgctgcagatggaa-3’(seqidno:5)1524-1542+rss45’-gtgtcacagacagtgaggt-3’(seqidno:6)2371-2353-dv具有许多特性，支持其在癌症免疫疗法中用作强效免疫刺激物。dv对未成熟b-淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞和dc谱系的抗原呈递细胞(apc)具有亲和力。dv的独特特征在于原发性感染导致cd4+和cd8+辅助诱导和细胞毒性效应ctl的th1型应答的激活。通过感染但不杀死apc，dv上调其cd80和cd83表达，导致促炎性th1细胞因子谱。原发性dv感染诱导th1型应答，具有活化的cd4+和cd8+效应t细胞以及lak细胞。在对癌症免疫疗法完全反应的患者中可见这种类型的应答(见表2)。表2.肿瘤免疫逃避机制和dv感染在原发性感染中，dv的死亡率非常低(根据manson’stropicaldiseases，每61,000人中有1人)。病毒感染但不杀死单核细胞-巨噬细胞和树突细胞谱系的apc。然后，这些感染的apc开始促炎(tnf-α和il-1β)和th1(il-2、il-7、il-12、il-15和il-21)类型的细胞因子级联。这些细胞因子导致适应性(ctl)和先天性(nk)免疫系统的强烈激活。在3-5天的潜伏期后，发热升高到39.5-40.5℃，并持续高热4-5天。患者具有剧烈头痛、关节痛、不适以及对光敏感。到发热的第3天，胸背会出现疹，并且腿和手臂有时也会出现。在临床上，登革感染导致血小板计数降低，引起出血，出血范围从轻微到在休克综合征的情况下危及生命。在合理的液体管理的基础上进行适当的支持性医护，99％的病例完全康复。dv感染可以增加受试者细胞中的基因表达，包括但不限于il-1β、il-2、il-7、il-12、il-15、ifn-α、ifn-γ、tnf-α、tnf-β、gm-csf、cd8抗原、icosl、ccl3、ccl5、trail、ip10,gnly、gzma、hla-dra、hla-dpα1、hla-dpβ1和zap70。在受试者的循环体液中可以观察到与这些基因相对应的蛋白质水平升高。水平可以增加至少2倍。水平可以增加2-1000倍。水平可以增加2-100倍。水平可以增加2-10倍。dv感染可以增加施用dv的受试者的细胞类型，包括但不限于cd8+cd44+62l-细胞、cd4+cd44+cd62llo细胞、hla-dr+cd8+细胞、tia-1cd8+细胞、vla-4cd8+细胞、icam-1cd8+细胞和lfa-1cd8+细胞。在一些情况下，在dv感染期间由免疫系统释放tnf-α。tnfα是具有多效性的炎性细胞因子，包括通过trail(tnf-凋亡诱导配体)直接杀死肿瘤细胞。在一些情况下，dv诱导来自多种细胞(包括γδctl、活化的m1巨噬细胞和浆细胞样dc(pdc))的高水平的可溶性trail(strail)。在一些情况下，dv激活ifnβ——一种对于与ifnα相同的受体具有10倍亲和力的多功能细胞因子。ifnβ在抑制病毒rna转录方面具有相似的抗病毒性质，但在诱导肿瘤细胞凋亡方面比ifnα有效得多。一氧化氮和ifnβ在登革感染期间可以协同作用。这些分子可以接连工作以克服对由m1巨噬细胞、pdc和δγctl诱导的高水平strail介导的凋亡的抗性。癌症本文所述的方法用于治疗受试者的癌症。本文所述的方法还用于清除癌细胞。在一些情况下，向受试者施用dv诱导免疫应答。在一些情况下，该免疫应答与普通病毒如感冒病毒相比是有效的。在一些情况下，该免疫应答导致肿瘤消退。dna微阵列分析显示，在一个晚期肿瘤患者中可能存在数百个遗传学上不同的肿瘤克隆。o2供应与基因突变率之间存在负相关模式。大多数药剂，如细胞毒性药物、抗体和小分子，几乎总是以血液为载体，对逃脱治疗机制的肿瘤克隆施加达尔文(darwinian)选择压力。具有最低灌注率的克隆既具有低药物暴露量，又具有逃避免疫系统检测的高容量，从而使其对常规疗法具有抗性。本文提供了用于癌细胞靶向的方法，其包括通过向患有癌症的受试者施用dv诱导发热性高热，使得具有突变表型的低流量(lowflow)抗性克隆饥饿，留下更多遗传稳定的克隆以供被活化的淋巴细胞和免疫系统的其他武器(arms)消除。在一些情况下，所述方法包括通过施用脉冲处理的dc将发热与ctl活化和淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)进行组合，导致比常规癌症疗法(例如，抗体药物缀合物、激酶抑制剂、小分子等)或单独的ctl更高的响应率。在晚期癌症患者中所见的免疫抑制是一个复杂而动态的过程。它涉及对肿瘤抗原本身的耐受性，这通常被ctl识别为“自身的”。在一些情况下，本文所述的方法包括破坏这种耐受性并获得dv感染所诱导的高水平的th1细胞因子。本文靶向的癌症可以是复发性和/或难治性癌症。在一些情况下，该癌症是急性癌症或慢性癌症。在一些情况下，该癌症是加速的难治性癌症。在一些情况下，该癌症处于缓解期。在一些情况下，该癌症是i期、ii期、iii期或iv期癌症。在一些情况下，该癌症是青少年癌症或成年癌症。癌症的实例包括但不限于肉瘤、癌、淋巴瘤或白血病。在一些情况下，该癌症是实体瘤或脂肪肉瘤。在一些情况下，所述癌症是肉瘤。该肉瘤可以是骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症。在一些情况下，肉瘤包括但不限于骨癌、纤维肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、双侧前庭神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤(例如，软组织腺泡状肉瘤、血管肉瘤、叶状囊性肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、上皮样肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤)。该肉瘤可包括尤因肉瘤。在一些情况下，所述癌症是癌。癌是起源于上皮细胞的癌症，该上皮细胞是覆盖身体表面、产生激素和组成腺体的细胞。作为非限制性实例，癌包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、脑癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、口癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、皮肤癌、输卵管癌、头颈癌、胃肠间质癌、腺癌、皮肤或眼内黑素瘤、肛区癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、垂体癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、脑干胶质瘤和脊柱肿瘤。在一些情况下，所述癌症是皮肤癌，诸如基底细胞癌、鳞状、黑素瘤、非黑素瘤或光化性(日光性)角化病。在一些情况下，所述癌症是神经内分泌癌。在一些情况下，该癌症是胰腺癌、甲状腺癌或前列腺癌。在一些情况下，该癌症是上皮癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、间质卵巢癌或宫颈癌。在一些情况下，该癌症是皮肤癌。在一些情况下，该癌症是新生血管性皮肤癌。在一些情况下，该癌症是黑素瘤。在一些情况下，该癌症是肾癌、肺癌。示例性肺癌包括但不限于小细胞肺癌或非小细胞肺癌。在一些情况下，该癌症是结直肠癌，例如胃癌或结肠癌。在一些情况下，该癌症是脑癌。在一些情况下，该癌症是脑瘤。在一些情况下，该癌症是胶质母细胞瘤或星形细胞瘤。在一些情况下，所述癌症是肺癌。在一些情况下，该肺癌是非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌或间皮瘤(mesotheliomia)。nscls的实例包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。在一些情况下，该间皮瘤是肺和胸腔内衬(胸膜)或腹腔内衬(腹膜)的癌性肿瘤。在一些情况下，该间皮瘤是由于石棉暴露而导致的。在一些情况下，所述癌症是中枢神经系统(cns)肿瘤。在一些情况下，该cnc肿瘤被分类为胶质瘤或非胶质瘤。在一些情况下，该胶质瘤是恶性胶质瘤、高分化胶质瘤、弥漫性内因性脑桥胶质瘤。胶质瘤的实例包括星形细胞瘤、少突神经胶质瘤(或少突神经胶质瘤和星形细胞瘤元素的混合型)和室管膜瘤。星形细胞瘤包括但不限于低分化星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、纤维状细胞性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤和室管膜下巨细胞星形细胞瘤。少突神经胶质瘤包括低分化少突神经胶质瘤(或少突星形细胞瘤)和间变性少突神经胶质瘤。非胶质瘤包括脑膜瘤、垂体腺瘤、原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤和髓母细胞瘤。在一些情况下，该癌症是脑膜瘤。在一些情况下，所述癌症是血癌。在一些情况下，该癌症是白血病。在一些情况下，该癌症是髓样白血病。在一些情况下，该癌症是淋巴瘤。在一些情况下，该癌症是非霍奇金淋巴瘤。在一些情况下，该癌症选自髓性白血病、淋巴母细胞性白血病、髓样白血病、急性髓样白血病、髓单核细胞白血病、嗜中性粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征、b-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、混合细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、复发性小淋巴细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、嗜碱细胞白血病、嗜酸细胞白血病、巨核母细胞性白血病、单核母细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病、红细胞系白血病和肝细胞癌。在一些情况下，该癌症是恶性血液肿瘤。在一些情况下，该恶性血液肿瘤是b细胞恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是慢性淋巴细胞白血病。在一些情况下，该癌症是急性淋巴母细胞性白血病。在一些情况下，该癌症是cd19-阳性伯基特淋巴瘤。在一些情况下，该白血病是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓细胞白血病。其他类型的白血病包括但不限于毛细胞白血病、慢性髓单核细胞白血病和青少年髓单核细胞白血病。在一些情况下，所述淋巴瘤从b淋巴细胞或t淋巴细胞发展而来。两种主要类型的淋巴瘤是先前称为霍奇金病的霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在一些情况下，非霍奇金淋巴瘤是惰性的(indolent)。在一些情况下，非霍奇金淋巴瘤是侵袭性的。非霍奇金淋巴瘤包括但不限于弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(malt)、小细胞淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、纵隔大b细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、结节边缘区b细胞淋巴瘤(nmzl)、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、结外边缘区b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤和淋巴瘤样肉芽肿病。施用方法本文提供了包括向有需要的受试者施用登革病毒和树突细胞的方法。在一些情况下，所述病毒以水性形式提供。在一些情况下，将病毒冻干并在水溶液(例如，盐水溶液)中重建。在一些情况下，病毒通过选自皮下注射、肌肉内注射、皮内注射、经皮给药、静脉内(“i.v.”)给药、鼻内给药、淋巴管内注射和口服给药的途径施用。在一些情况下，通过淋巴管内微导管向受试者输注病毒。在一些情况下，登革病毒首先在施用树突细胞之前至少24小时施用。在一些情况下，登革病毒首先在施用树突细胞之前约12小时至约96小时施用。在一些情况下，登革病毒首先在施用经致敏的树突细胞之前约24小时至约72小时施用。在一些情况下，登革病毒首先在施用经致敏的树突细胞之前1天至4天施用。在一些情况下，登革病毒仅施用一次。在一些情况下，登革病毒施用不止一次。在一些情况下，登革病毒仅在接收树突细胞之前施用。在一些情况下，登革病毒在接收经致敏的树突细胞之后施用。在一些情况下，登革病毒在接收经致敏的树突细胞之前和之后施用。在一些情况下，所述方法包括以约0.5ml106pfu/ml的剂量施用登革病毒。在一些情况下，该剂量在约103pfu/ml和约108pfu/ml之间。在一些情况下，该剂量在约103pfu/ml和约106pfu/ml之间。在一些情况下，高热或发热的发生证实了登革病毒对受试者的成功感染或接种。在一些情况下，受试者血液/血浆中的循环细胞因子的存在或增加证实了登革病毒对受试者的成功感染或接种。细胞因子可以包括但不限于白细胞介素-2和干扰素-γ。在一些情况下，本文所述的方法包括向有需要的受试者施用经致敏的树突细胞仅一次。在一些情况下，经致敏的树突细胞施用不止一次。在一些情况下，第一次和第二次施用经致敏的树突细胞，其中第一次和第二次相隔约1天、约2天、约3天、约4天、约5天或约6天、约8天、约10天、约12天或约18天。在一些情况下，第一次和第二次相隔约1周、约2周、约3周或约一个月。在一些情况下，第一次和第二次相隔超过一个月。在一些情况下，第一次和第二次相隔不到12个月。在一些情况下，第一次和第二次相隔超过12个月。在一些情况下，本文所述的方法提供了当受试者高热时向该受试者施用经致敏的树突细胞。在一些情况下，经致敏的树突细胞在受试者突发发热后施用。在一些情况下，在受试者的体温升高到约37.5℃至约42℃之后施用经致敏的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到约38℃至约42℃之后施用经致敏的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到至少约38.5℃之后施用经致敏的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到38.5℃之后施用经致敏的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温达到38摄氏度或更高之后向该受试者施用经致敏的树突细胞。在一些情况下，受试者的体温通过鼓室或口腔方法来测量。实施例实施例1.树突细胞(dc)的产生和脉冲处理使用lutzm.等人(j.immunol.methods223:77-92,1999)描述的方法由小鼠骨髓产生成熟dc。将骨髓悬浮液在培养皿中于补充有重组鼠gm-csf的培养基中温育10天。收集非贴壁细胞，离心并重悬于含有gm-csf和脂多糖的培养基中。两天后，收集dc并通过台盼蓝排除法测定其活力。通过流式细胞术分析测定dc的纯度。用10μg/ml的合成肽来脉冲处理dc18小时。温育18小时后，收获dc，在hbss中洗涤两次，并重悬于hess中以进行另外的研究(参见实施例2和3)。实施例2.用于在第一个小鼠模型中治疗黑素瘤的登革病毒和树突细胞使用登革病毒(dv)株和肿瘤抗原致敏的树突细胞(dc)进行小鼠模型测定以观察癌细胞联合靶向的结果。通过尾部注射，向dvc57bl/6小鼠接种0.05ml的1x106或1x107pfu/m1的登革病毒(den-2株#1710)。在施用登革病毒(den-2株#1710，cdc数据库条目号555，由duanegubler博士提供)后第5天、第10天、第15天和第20天，通过静脉内输注以2000(ril-2)和500iu(rifn-γ)施用重组鼠il-2(genzyme)和ifn-γ(sigmapharmaceuticals)。登革病毒施用后7天，用分别与2种肽一起温育并静脉内注射的小鼠dc免疫c57bl/6小鼠。合成肽。使用来自卵清蛋白(ova-8)——siinfekl(seqidno：7)的h-2b-限制性肽作为对照。使用来源于抗原gp100/pme117(egsrnqdwl(seqidno：1))和来源于trp-1/75(tayryhll(seqidno：2))的b16黑素瘤相关的h-2b-限制性肽来脉冲处理鼠dc(详情参见实施例1)。以14天的间隔进行另外两次dc免疫。在最后一次dc输注后三天，用5×104个活b16黑素瘤细胞在侧尾静脉中静脉内攻击小鼠，然后跟踪记录存活率，将其记录为在肿瘤注射后随时间推移(以天计)的存活动物百分比。记录来自每组五只或更多只小鼠的数据(参见表3和图2)。表3在组2(登革病毒血清型2株#1710和肿瘤肽致敏的dc)中施用的小鼠中观察到的肺转移数比组1中的对照小鼠低7.5％，该组1施用肿瘤肽致敏的dc但未施用登革病毒。实施例3.用于在第二个小鼠模型中治疗黑素瘤的登革病毒和树突细胞使用登革病毒(dv)株和肿瘤抗原致敏的树突细胞(dc)进行小鼠模型测定以观察癌细胞联合靶向的结果。向小鼠施用细胞因子以模拟(parallel)在人中所观察到的对dv的应答。使用h-2b-限制性b16小鼠黑素瘤细胞系(atcc#crl-6322)在小鼠中建立肿瘤。合成用于脉冲处理树突细胞的肽(来源于抗原gp100/pme117和来源于trp-1/gp75的b16黑素瘤相关的h-2b限制性肽)。根据lutz等人(j.immunol.methods223:77-92,1999)描述的方法从小鼠骨髓产生树突细胞。在第0天，小鼠在侧尾静脉内通过静脉内注射接受5x104个活b16黑素瘤细胞以建立肺转移。在第7天，通过尾部注射，向小鼠接种0.05ml的1x106或1x107pfu/m1的登革病毒(den-2株#1710，cdc数据库条目号555)。在施用登革病毒(den-2株#1710)后，每隔5天，通过静脉内输注以2000iu(ril-2)和500iu(rifn-γ)来施用重组鼠il-2(genzyme)和ifn-γ(sigmapharmaceuticals)。在第21天、第35天和第49天，将小鼠dc分别与2种肽一起温育，并在同一天以2次连续给药的方式静脉内注射，以匹配患者的给药途径和时间表(其他细节参见实施例2)。对照组小鼠未接受登革病毒或接受经来自卵清蛋白(ova-8)——siinfkel的h-2b-限制性肽脉冲处理的树突细胞。表4列出了治疗组和对照组。表4在第90天，处死动物并对肺肿瘤集落进行计数。用fekette溶液吹入并固定肺后，以盲法编码方式对肺转移进行计数。数据被报告为转移的平均数；每组四只小鼠(参见表5和图3)。进行以下主要器官系统的组织病理学分析：脑、心脏、肺、肝、肾、脾和性腺(数据未示出)。表5在c组小鼠(施用肿瘤抗原致敏的dc并且未施用病毒)中观察到的肺转移数比d对照组(施用denv-2#1710和暴露于对照肽的dc)低47％。在a组小鼠(施用denv-2#1710和肿瘤抗原致敏的dc)中观察到的肺转移数比d对照组(施用denv-2#1710和暴露于对照肽的dc)低54％。在b组小鼠(施用denv-2#1710和肿瘤抗原致敏的dc)中观察到的肺转移数比d对照组(施用denv-2#1710和暴露于对照肽的dc)低51％。a组和b组相比于d组平均减少52.8％。实施例4.登革病毒的制备和使用建立具有来自vero(非洲绿猴肾细胞)的经验证和认证的细胞系的主细胞库，并且测试其没有任何污染物和外来的生物体。世界卫生组织使用vero系来生产多种病毒疫苗。根据fda生物制剂中心(cber)制定的指导方针，将登革病毒在源自主细胞库并确立为工作细胞库的经验证的vero系中传代。将来自初始种子储备的1、2、3或4型登革病毒以10-5的moi添加到工作细胞库(wcb)的vero细胞中。在200-ml病毒接种物在37℃下吸附1.5小时后添加第一份4-ml覆盖培养基——其含有在营养培养基(0.165％乳白蛋白水解物[difcolaboratories,detroit,mich.])中的1％seakemle琼脂糖(fmcbioproducts,rockland,maine)、0.033％酵母提取物[difco]、earle平衡盐溶液、25mg硫酸庆大霉素[biowhittaker,walkersville,md.]和1.0mg/l两性霉素b[fungizone；e.r.squibb&sons,princeton,n.j.]和2％fbs。在37℃温育7天后，加入每毫升含有另外80mg的中性红活性染色剂(gibco-brl,gaithersburg,md.)的第二份2-ml覆盖物。感染后8至11天对噬斑进行计数。以目标106pfu/ml作为标准剂量，在最终病毒培养物上进行噬斑测定。如果未达到该目标，则使用超速离心法来浓缩病毒。在确认病毒滴度后，过滤最终产物以去除任何细胞碎片，测试是否存在任何外来生物体，并且在得到最终批次后，将其装入具有bsl-2水平病原体标签的5ml瓶子中，并在4℃下储存直到准备运输及施用。实施例5.用肿瘤抗原脉冲处理的树突细胞的制备和使用将单核细胞与其他白细胞(例如，t细胞、b细胞、nk细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)分离。这是通过免疫磁性选择或备选地通过粘附性质来实现的。免疫磁性选择包括将白细胞倒入具有塑料珠的无菌塑料柱中，该塑料珠上包被有针对免疫细胞cd表面蛋白质(cd4/cd8/cd56等)的抗体。不需要的细胞粘附在珠上，从而让单核细胞通过并被收集。在正选择中，用cd1+/cd14+包被的磁珠捕获单核细胞，将磁体抵靠着柱而放置，并且用pbs溶液将不需要的细胞从柱中冲出。然后将单核细胞从珠上洗下来以进行下一步骤。在粘附选择中，利用单核细胞粘附到特定表面的性质，通过使单采血液成分术产物沿倾斜柱向下运行来分离它们。或者，采用针对cd3、cd4和cd8的单克隆抗体，通过荧光激活细胞分选(facs)，除去骨髓细胞中的淋巴细胞和mhc类阳性细胞。将剩余的细胞在补充有10％胎牛血清(fcs)、2-me和100iu/ml青霉素、1mm丙酮酸钠和10μm非必需氨基酸的iscove改良dulbecco培养基(imdm)中于37℃、5％co2气氛下在24孔板中培养过夜，每孔1ml培养基中具有约1百万个细胞。24小时后，将细胞在粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(gm-csf)和900u/ml的重组il-4的存在下重新铺板并培养。3至4天后，将培养基换成新鲜的细胞因子培养基。或者，使用以下方法制备真皮树突细胞(ddc)：将来自健康人志愿者的keratome在rpmi1640中的终浓度为1.2u/ml的细菌蛋白酶分散酶2型溶液中于37℃下温育1小时。温育期后，表皮和真皮得以轻松分离。然后用pbs洗涤几次后，将表皮和真皮片切成小块(1-10mm)，并置于补充有10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640中，置于10cm组织培养板中。2-3天后，去除组织块，并收集培养基。将离开组织切片迁移到培养基中的细胞离心，重悬于1-2ml的新鲜培养基中，并用台盼蓝染色。通过在甲泛葡胺梯度上分离来实现进一步富集。将细胞铺在3ml高渗14.5％甲泛葡胺柱上，并在室温下以650g沉降10分钟。收集低密度的间期细胞，并用两次连续较低高渗性的洗液(含有10％fbs和40mmnacl的rpmi1640)进行洗涤，以使细胞恢复至等渗。当收集单核细胞时，它们可能只有几千个。在多步骤方案中使用重组人生长因子rhu白细胞介素(rhuinterleukin)-4(il-4)和rhu粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(gm-csf)来实现将dc数扩大至5000万左右。il-4和gm-csf的加入扩大了成熟dc标志物(cd11+、cd80+、cd83+)的数目和发展，以及增加了i类(用于将短肽呈递给cd8+)和ii类mhc复合物(用于将更长的肽呈递给cd4+辅助诱导t淋巴细胞)的表达。大约4天后，测量成熟dc的数目。脉冲处理树突细胞通过几种方法制备全自体肿瘤细胞裂解物。像miltenyigentlemacs系统这样的自动化细胞处理器的开发使得样品可以被手动切碎，悬浮在pbs溶液中，然后用预先选择的组织特定的、软件控制的转子系统分离肿瘤细胞。可对单细胞悬浮液进行膜裂解，这对肿瘤肽的损伤最小。或者，样品不分离肿瘤细胞。相反，留下的样品含有肿瘤细胞和支持细胞(例如，来自肿瘤微环境的细胞)。用nh4cl裂解细胞以消除红细胞并产生凋亡体和坏死体，而不破坏ctl诱导所需的肽。加入裂解物后，dc吞噬并加工肽以呈递给ctl。最后一步是用炎性信号进行成熟化。优选的药剂是来自细菌细胞壁的脂多糖(lps)。在暴露于lps后，dc上调其cd80/cd83+活化标志物，增加il-12p70的产生以诱导1型ctl应答，并对进一步的抗原摄取和加工产生抗性。在最后的无菌性、特异性和活力测试后，将dc转移到适合在-70℃下在液氮中冷冻的聚合物袋中，储存至多1年，然后运送到诊所以供使用。将该聚合物袋运输冷却过夜，然后在温水浴中再温热至37℃，之后与0.9％nacl溶液同时静脉内施用。静脉内(i.v.)施用的dc运送到肺部，其中一些将被截留，但是大多数将输送到继发性淋巴器官如肝脏和脾脏白髓t细胞区以致敏ctl。实施例6.用于癌症治疗的联合递送登革病毒的施用与其他病毒疫苗注射相似。受试者的肩部(三角肌)区域的皮肤区域用酒精清洁，然后在皮下注射0.5ml病毒以模仿蚊子叮咬。一旦在dv注射2-3天后受试者发烧达到38.5℃，即通过淋巴管内微导管向患者输注脉冲处理的(致敏的)树突细胞。重复注射，直到患者呈疾病阴性。dc融合将使用实施例5中制备的细胞。尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案均可用于实施本发明。旨在由以下权利要求来限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。序列表<110>普莱瓦克斯免疫肿瘤学公司<120>用于采用登革病毒与树突细胞的联合疗法的组合物及方法<130>48253-702.601<140><141><150>62/231,351<151>2015-07-02<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成肽<400>1gluglyserargasnglnasptrpleu15<210>2<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成肽<400>2thralatyrargtyrhisleuleu15<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>3ggatcccaagaaggggccat20<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成引物<400>4ggcagctccatagattgct19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成引物<400>5ggtgttgctgcagatggaa19<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>6gtgtcacagacagtgaggt19<210>7<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成肽<400>7serileileasnpheglulysleu15当前第1页12