用于表达嵌合抗原受体和其它受体的T细胞的制作方法

利用离体扩增的自体和同种异体(allogeneic)t细胞的过继性t细胞疗法(act)是用于治疗病毒感染、癌症和自身免疫性疾病的有吸引力的治疗方法。使大量治疗性t细胞能够快速生成的方法对于act的效力和安全性是至关重要的。已经对act使用各种t细胞富集方法，包括限定的t细胞亚组的选择，以及扩增方法。期望采用允许体内相对高的活性和相对高的增殖潜力的t细胞群体。

发明概述

本文中描述了用于制备可用于表达act的嵌合抗原受体(“car”)的t细胞群体的方法。t细胞群体也可用于需要高活性、长寿命的t细胞群体的多种其它目的。对通过本文中描述的方法制备的t细胞群体富集：幼稚t细胞(tn)、记忆干细胞(tscm)和中枢记忆t细胞(tcm)。因此，此类细胞群体可以描述为tcm/scm/n细胞或者tcm/scm/n细胞群体。可以通过以下两者从外周血单核细胞(pbmc)衍生这些细胞群体：1)消减不需要的细胞群体，如cd14表达性髓样细胞和cd25表达性细胞；和2)富集cd62l表达性记忆和幼稚t细胞。因此，所得到的细胞群体包括表达cd45ra和cd62l的t幼稚细胞(tn)和干记忆细胞(tscm)。它还包括表达cd45ro和cd62l的中央记忆t细胞(tcm)的群体。tcm/scm/n细胞群体与先前描述的tcm细胞群体的不同之处在于它们的制备不需要消减cd45ra+t细胞。tcm/scm/n细胞群体在制备后相对不含效应记忆细胞(tem)和效应细胞(te)。当然，随着tcm/scm/n细胞群体发生扩增，会发生分化，例如产生te细胞。

可以工程化改造患者特异性、自体、和同种异体tcm/scm/n细胞(或同种异体的tcm/scm/n细胞)以表达嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，并且可以扩增工程化细胞并且在act中使用。

本文中描述了包含t细胞(即表达cd3的细胞或cd3+细胞)的分离的人细胞群体，其中t细胞包含中枢记忆t细胞；记忆干细胞t细胞和幼稚t细胞，其中大于40％(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)的t细胞是cd45ra+和大于70％(大于75％、80％、85％或90％)的t细胞是cd62l+。在各个实施方案中，小于15％(小于12％、10％、8％、或6％)的t细胞是cd14+，并且小于5％(小于4％、3％或2％)的t细胞是cd25+；大于10％(大于15％、20％、25％、30％、35％或40％)的t细胞含有重组核酸分子(例如编码嵌合抗原受体或t细胞受体的重组核酸分子；例如病毒载体如t细胞载体)；至少40％(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)的t细胞是cd4+和cd62l+或cd8+和cd62l+；至少10％(大于15％、20％、25％、30％、35％或40％)的t细胞是cd8+和cd62l+；小于60％(小于55％、50％、45％、40％、35％、30％、24％、20％或15％)的t细胞是cd45ro+；并且在包含t细胞的分离的细胞群体中至少80％(大于85％、90％、95％或98％)的细胞是t细胞。

本文中还描述了包含人t细胞(即表达cd3的细胞或cd3+细胞)的分离的细胞群体，其中t细胞包含中枢记忆t细胞和记忆干细胞t细胞，其中大于40％(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)的t细胞是cd45ra+，大于40％(大于45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％)的t细胞是cd62l+，大于70％(大于75％、80％、85％或90％)的t细胞是cd95+，并且大于10％(例如，大于15％、20％、25％、30％、35％或40％)的t细胞含有重组核酸分子(例如重组核酸分子(例如病毒载体)，其例如编码嵌合抗原受体或t细胞受体)。在各个实施方案中，小于15％(小于12％、10％、8％、6％)的t细胞是cd14+并且小于5％(小于4％、3％或2％)的t细胞是cd25+；至少40％(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)的t细胞是cd4+和cd62l+或cd8+和cd62l+；至少10％(大于15％、20％、25％、30％、35％或40％)的t细胞是cd8+和cd62l+；小于60％(小于55％、50％、45％、40％、35％、30％、24％、20％或15％)的t细胞是cd45ro+；并且在包含t细胞的分离的细胞群体中至少80％(大于85％、90％、95％或98％)的细胞是t细胞。

本文中描述了用于制备包含含有重组核酸分子的t细胞(即，表达cd3的细胞或cd3+细胞)的人细胞群体的方法，其包括：(a)提供包含t细胞的人细胞样品，其中t细胞包含：中央记忆t细胞；记忆干细胞t细胞和幼稚t细胞，其中大于40％(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)的t细胞是cd45ra+和大于70％(大于75％、80％、85％或90％)的t细胞是cd62l+；(b)活化包含t细胞的人细胞群体；并且(c)用重组核酸分子转导或转染包含t细胞的人细胞群体中的细胞以提供包含含有重组核酸分子的t细胞的人细胞群体，其中所述方法不包括消减表达cd45ra的细胞。在各个实施方案中，重组核酸分子是病毒载体(例如，慢病毒载体、编码car的病毒载体、编码t细胞受体的病毒载体)；该方法还包括培养包含含有重组核酸分子的t细胞的人细胞群体；培养步骤包括添加外源il-2和外源il-15；并且活化步骤包括将细胞暴露于抗cd3抗体和抗cd28抗体；并且在包含t细胞的分离的细胞群体中至少80％(大于85％、90％、95％或98％)的细胞是t细胞。

本文中描述了用于制备包含t细胞(即，表达cd3的细胞或cd3+细胞)的人细胞群体的方法，其中t细胞包含中枢记忆t细胞；记忆干细胞t细胞和幼稚t细胞，其中大于40％(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)的细胞是cd45ra+并且大于70％(大于75％、80％、85％或90％)是cd62l+，所述方法包括：(a)提供包含t细胞的分离的人细胞群体；(b)处理包含t细胞的分离的人细胞群体以消减表达cd25的细胞和表达cd14的细胞，从而制备经消减的细胞群体；并且(c)处理经消减细胞群体以富集表达cd62l的细胞，从而制备包含t细胞的人细胞群体，其中所述t细胞包含中枢记忆t细胞；记忆干细胞t细胞和幼稚t细胞，其中大于40％的细胞是cd45ra+(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)，并且大于70％是cd62l+，其中该方法不包括消减表达cd45ra的细胞的步骤。在各个实施方案中，所述方法进一步包括活化包含t细胞的人细胞群体，并用重组核酸分子转导或转染活化的细胞，以提供包含含有重组核酸分子的t细胞的t细胞群体；包含t细胞的分离的人细胞群体包含pbmc；并且在包含t细胞的分离的细胞群体中至少80％(大于85％、90％、95％或98％)的细胞是t细胞。

本文中还描述了包含t细胞(即表达cd3的细胞或cd3+细胞)的人细胞群体，其中t细胞包含中枢记忆t细胞；记忆干细胞t细胞和幼稚t细胞，其中大于40％(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)的细胞是cd45ra+，并且大于70％(大于75％、80％、85％或90％)是cd62l+，其中群体通过包括以下步骤的方法制备：提供包含t细胞(例如来自供体的pbmc)的分离的人细胞群体；处理包含t细胞的分离的人细胞群体以消减表达cd25的细胞并消减表达cd14的细胞以制备经消减的细胞群体；并且处理经消减的细胞群体以富集表达cd62l的细胞，从而制备包含t细胞的人细胞群体，其中t细胞包含中枢记忆t细胞；记忆干细胞t细胞和幼稚t细胞，其中大于40％(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)的细胞是cd45ra+并且大于70％(大于75％、80％、85％或90％)是cd62l+，其中所述方法不包括消减表达cd45ra的细胞的步骤。在各个实施方案中，人细胞群体中小于15％(小于12％、10％、8％、6％)的t细胞是cd14+，并且小于5％(小于4％、3％或2％)的t细胞是cd25+；至少40％(大于45％、50％、55％、60％、65％或70％)的t细胞是cd4+和cd62l+或cd8+和cd62l+；至少10％(大于15％、20％、25％、30％、35％或40％)的t细胞是cd8+和cd62l+；小于60％(小于55％、50％、45％、40％、35％、30％、24％、20％或15％)的t细胞是cd45ro+。

本文中还描述了治疗癌症、自身免疫或感染的方法，其包括对有此需要的患者施用包含本文所述的人细胞群体的药物组合物。在某些情况下，细胞对所治疗的患者是自体的，并且在某些情况下，它们对所治疗的患者是同种异体的。

可以如下对细胞群体消减表达特定标志物(例如受体)的细胞：通过从细胞群体除去(使用例如选择性抗体和细胞分选方法)一些、大多数或几乎所有表达标志物的细胞，使得群体中表达标志物的细胞的相对比例降低。可以如下对细胞群体富集表达特定标志物(例如受体)的细胞：通过收集(使用例如选择性抗体和细胞分选方法)一些、大多数或几乎所有表达标志物的细胞，并且弃去不表达标志物的细胞，使得群体中表达标志物的细胞的相对比例降低。

附图简述

图1描绘了各种t细胞亚组的某些标志物表达模式，特别是区分tscm与tn的表达模式。

图2描绘了各种t细胞亚组的某些标志物表达数据。

图3描绘了基于cd62l和cd45ro的表达的某些t细胞亚组之间的关系。

图4描绘了用clinimacs^tm富集tcm或tcm/scm/n细胞后细胞的表面表型分析的结果。使用对t细胞标志物cd3和cd8、中央记忆t细胞标志物cd62l和幼稚t细胞标志物cd45ra，以及单核细胞标志物cd14和调节性t细胞标志物cd25特异性的缀合有荧光染料的抗体对来自指定产物的细胞进行染色。在每个直方图中指示高于同种型对照染色(黑线)的免疫反应性细胞百分比(阴影直方图)。

图5描绘了tcm和tcm/scm/n细胞群体扩增的研究结果。对于由5个供体中的4个制备的细胞产物描绘了在慢病毒转导当天开始的活细胞数目，以黑色圆圈表示tcm衍生的产物并且以白色正方形表示tcm/scm/n衍生的产物。为了更好地描述培养中的细胞的倍增时间，对y轴使用log2标度。

图6描绘了tcm和tcm/scm/n细胞群体的表面表型分析的结果。对经tcm或tcm/scm/n富集的细胞进行珠刺激，用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7或il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7转导，并且离体扩增。然后，在用对egfrt或cd19t转导标志物，或t细胞标志物cd3、cd4和cd8、中央记忆t细胞标志物cd27、cd28和cd62l和幼稚t细胞标志物cd45ra(灰色直方图)特异性的缀合有荧光染料的试剂染色后通过流式细胞术分析细胞。高于对照染色(空心直方图)的免疫反应性细胞的百分比在代表性tcm/tcm/scm/n对的每个直方图(a)中指示或者对于tcm衍生的产物用空心符号和对于tcm/scm/n衍生的产物用灰色符号在(b)中指示为每个细胞系的数据点。红色柱形描绘了每组的平均值，并且对于每个表面标志物指示tcm对tcm/scm/n衍生的细胞产物的成对studentt-检验比较的p-值。*，对于cd27，p-值是不可计算的，因为评估太少。注意，由于重叠，在(b)中对于cd3染色仅描绘了阴影，而非细胞系特异性的符号。

图7a-c描绘了评估当用sup-b15肿瘤细胞攻击时cd19rtcm或cd19rtcm/scm/n预处理的治疗效力的研究结果。照射nsg小鼠后一天，将它们分成组(n＝4)并且保持未处理，或者用2.5x10⁶个模拟转导pbmc(无car)、cd19rtcm或cd19rtcm/scm/n(约0.5x10⁶个car+细胞)i.v.处理。在第2天，用0.7-1.0x10⁶个ffluc+sup-b15肿瘤细胞i.v.攻击小鼠。m，百万(图7a)。来自每组的代表性小鼠，显示使用xenogenlivingimage的相对肿瘤负荷(图7b)。随时间的每组小鼠中的平均sup-b15肿瘤生长，如通过xenogen成像和ffluc通量(光子/秒)的定量监测(图7c)。

图8a-b描绘了用cd19rtcm或cd19rtcm/scm/n的i.v.预处理后41天检查血液中人t细胞的存在的研究结果。照射nsg小鼠后一天，将它们分成组(n＝4)并且保持未处理，或者用2.5x10⁶个模拟转导pbmc(无car)、cd19rtcm或cd19rtcm/scm/n(约0.5x10⁶个car+细胞)i.v.处理。在第2天，用0.7-1.0x10⁶个肿瘤gfp+sup-b15i.v.攻击小鼠。在第41天，通过流式细胞术评估每只小鼠的血液中人cd45+cd3+细胞(即人t细胞)的存在。描绘了每只小鼠的代表性流式细胞分析(图8a中描绘了小鼠1和小鼠2；图8b中描绘了小鼠3和小鼠4)，其中进一步分析了hucd45门控细胞的cd3t细胞标志物和egfrt转导标志物的表达(基于右上象限的％car+)。金色盒用于突出显示gfp+supb15群体。

图9描绘了用已经经模拟转导或用cd19r(eq)28zegfrt_ephiv7转导的tcm细胞或tcm/scm/n细胞作为效应物和cd19阴性k562细胞(白色柱形)或cd19+supb15细胞(黑色柱形)作为靶物进行的长期杀伤测定法的结果。描绘了相对于100％标准化的模拟效应物共培养物相比72小时后剩余的活的靶细胞(cd45阴性，fsc高)的百分比。

图10描绘了用已经经模拟转导或用cd19r(eq)28zegfrt_ephiv7转导的tcm细胞或tcm/scm/n细胞作为效应物和cd19阴性k562细胞(白色柱形)或cd19+supb15细胞(黑色柱形)作为刺激物进行的5小时脱粒测定法的结果。指示对于cd107a具有免疫反应性的cd45/cd8/egfrt门控细胞的百分比。

图11描绘了已经经模拟转导或用cd19r(eq)28zegfrt_ephiv7转导的tcm细胞或tcm/scm/n细胞的ifnγ生成的结果分析。用已经经模拟转导或用cd19r(eq)28zegfrt_ephiv7转导的tcm衍生的或tcm/scm/n衍生的细胞产物作为效应物和cd19阴性k562细胞(白色柱形)或cd19+supb15细胞(黑色柱形)作为刺激物进行5小时共培养。指示对ifn-γ具有免疫反应性的cd45/cd8/egfrt门控细胞的百分比。

图12描绘了由各种t细胞群体表达的il13car的功效研究的结果。

发明详述

t细胞区室包括处于不同分化阶段的t细胞亚组。这些亚组来自于cd45ra+、cd62l+、cd28+、和cd95-的幼稚t细胞(tn)的分化。干细胞样亚组之一是cd45ra+、cd62l+、cd28+、和cd95+的记忆干细胞(tscm)。这些细胞分化成cd45ro+、cd62l+、cd28+、和cd95+的中央记忆细胞(tcm)。效应记忆细胞(tem)中的tcm分化为cd45ro+，cd62l-，cd28+/-和cd95+。tem分化为cd45ro+、cd62l+、cd28+、和cd95+的效应t细胞(te)。

记忆干细胞t细胞(tscm)在t细胞区室中以低水平存在，但似乎具有显著的自我更新和增殖潜能。虽然它们与幼稚t细胞(tn)的相似之处在于它们表达cd45ra+和cd62l+，但是它们可以通过其cd95表达而与tn区分(图1)。可以通过在il-7和il-15存在下用cd3/cd28珠刺激从tn产生tscm。它们也可以在wnt/β-连环蛋白途径活化的情况下扩增。

pbmc中比tscm更丰富的中央记忆t细胞(tcm)是具有高自我更新和增殖潜力的定义明确的记忆t细胞亚组。存在着过继转移后tcm比效应t细胞(te)更好持续的证据(bergeretal.,2008journalofcellularimmunology118:4817；wangetal.,2011blood117:1888)。tcm可以基于其cd45ra-cd45ro+cd62l+表型从pbmc富集用于t细胞疗法制备(图2)wangxetal.jimmunotherapy2012；35:689。存在着tcm与成年干细胞一样运行的某种证据。小鼠中的研究证明了：在三代内tcm的单细胞转移表明tcm可以提供完全的免疫重建；tcm扩增以产生更多tcm；并且tcm分化成tem/te(graefetal.2014immunity41:116；gattionietal.2014immunity41:7)。

下文所述的tcm/scm/n细胞群体包括在car-t疗法中已被证明有效的tcm，和tn以及tscm，这两者比tcm更为干细胞样。图3呈现描绘各种细胞群体与pbmc之间关系的表达数据。

本文中所述的细胞群体可以经遗传工程化改造而表达例如car或t细胞受体。car是含有胞外识别域、跨膜区和一个或多个胞内信号传导域的重组生物分子。因此，术语“抗原”不限于结合抗体的分子，而是限于可以特异性结合任何受体的任何分子。因此，“抗原”是指car的识别域。胞外识别域(也称为胞外域或仅由其所含的识别元件提及)包含特异性结合存在于靶细胞的细胞表面上的分子的识别元件。跨膜区将car固定在膜上。胞内信号传导域包含来自人cd3复合物的zeta链的信号传导域，并且任选地包含一个或多个共刺激信号传导域。car既可以结合抗原，又可以转导t细胞活化，而不依赖于mhc限制。因此，car是“通用的”免疫受体，其可以治疗具有抗原阳性肿瘤的患者群体，而不论其hla基因型如何。使用表达肿瘤特异性car的t淋巴细胞的过继免疫治疗可以是治疗癌症的强大治疗策略。

可以通过本领域已知的任何手段产生car，但它优选使用重组dna技术产生。可以通过方便的本领域已知的分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、重叠pcr、引物辅助连接、定点诱变，等等)来制备编码嵌合受体几个区域的核酸并组装成完整的编码序列。优选地，将所得到的编码区插入到表达载体中并用于转化合适的表达宿主细胞系，优选t淋巴细胞系，最优选自体t淋巴细胞系。

适用于tcm/scm/n细胞表达的各种car包括例如wo2016/044811；wo2104/144622；wo2002/077029；和wo/us2014/0288961中描述的car。

实施例1：制备tcm/scm/n细胞

可以使用多种方法来产生人tcm/scm/n细胞的群体。例如，可以从混合群体t淋巴细胞制备tcm/scm/n细胞群体。t淋巴细胞群体可以与使用细胞最终治疗的受试者是同种异体或自体的，并且可以通过白细胞单采术(leukopheresis)或抽血从受试者获得。

以下方法是可用于从通过白细胞单采术或其它手段获得的t淋巴细胞获得tcm/scm/n细胞群体的方法的实例。通过白细胞单采术或外周血抽取收集外周血。典型的制备周期的第1天是发生蔗聚糖(ficoll)程序当天。用edta/pbs稀释受试者的白细胞单采术产物，并且以最大制动在室温以1200rpm离心产物10分钟。离心后，除去富含血小板的上清液并温和涡旋振荡细胞团粒。使用edta/pbs使每个锥形管中的涡旋振荡的细胞团粒重悬。然后，用聚蔗糖铺在每个管下面，并在无制动的情况下在室温以2000rpm离心20分钟。离心后，将来自每个管的pbmc层转移到另一个锥形管中。在最大制动的情况下在4℃将细胞以1800rpm离心15分钟。

离心后，弃去无细胞上清液并温和涡旋振荡细胞团粒。每次使用edta/pbs清洗细胞两次，并且第三次使用pbs。在最大制动的情况下在4℃每次以1200rpm离心细胞10分钟。在最后的pbs清洗后，将涡旋振荡的细胞团粒重悬于完全x-vivo15培养基(具有10％fbs的x-vivo^tm培养基)中并转移至转移袋中。将具有清洗过的pbmc的袋在室温在旋转器上在桌上保持过夜，以在次日进行免疫磁性选择。

接下来，使用选择程序来消减表达某些标志物的细胞的细胞群体，并富集表达某些其它标志物的细胞的细胞群体。优选地，这些选择步骤在制备周期的第二天发生。对细胞群体基本上消减了表达cd25和cd14的细胞。重要的是，基本上未对细胞群体消减表达cd45ra的细胞。简言之，将细胞重悬于标记缓冲液(lb；含有0.5％hsa的edta/pbs)中，并与抗cd14和抗cd25miltenyi抗体一起温育以进行消减，并且温和地混合组合物，然后在桌上在旋转器上在室温温育30分钟。

使用消减管道组在装置上进行消减步骤。将消减步骤后的回收细胞转移到管中，并在最大制动的情况下在4℃以1400rpm离心15分钟。

除去无细胞上清液，并且温和地涡旋振荡并重悬细胞团粒。为了富集表达cd62l的细胞，用抗-cd62l-生物素(在cityofhopecenterforbiomedicineandgenetics制备)处理细胞悬浮液，温和地混合，并在室温在旋转器上在桌上温育30分钟。

温育期后，将lb添加到管，并在4℃以最大制动的情况下以1400rpm离心细胞15分钟。除去无细胞上清液并温和地涡旋振荡细胞团粒。添加lb以重悬管中的细胞团粒，并且将重悬的细胞转移到新的转移袋。添加抗生物素(miltenyibiotec)试剂，并且将混合物温和地混合，并在室温在旋转器上在桌上温育30分钟。

使用管道组在装置上进行cd62l富集步骤。可以冷冻此富集的产物以贮存，然后融化并且活化

为了在制备中提供中间保持步骤，存在选项以在选择过程之后冷冻细胞。通过在最大制动的情况下在4℃以1400rpm离心15分钟使细胞沉淀。将细胞在中重悬，并等分取样到冷冻小瓶中。将小瓶转移到可以以约1℃/分钟冷却的受控冷却装置(例如，mr.frosty；sigma-aldrich)，立即将冷却装置转移到-80℃冷冻器。在-80℃冷冻器中三天后，将细胞转移到gmpln2冷冻器中储存。

我们发现了冷冻保存的细胞表现出良好的恢复和存活力，在冷冻保存后直至8.5个月融化时保持适当的细胞表面表型，并且可以成功转导并在融化时体外扩增。

或者，可以将新鲜富集的tcm/scm/n细胞活化，转导或扩增，如下文实施例3中所述。

实施例2：tcm和tcm/scm/n产率和回收率的比较

进行研究以评估经历了以下t细胞群体的clinimacs/automacs^tm富集的人外周血单核细胞(pbmc)的产率：1)cd62l+中枢记忆(tcm)细胞，和2)cd62l+tcm/scm/n细胞，其包括中央记忆(tcm)和干细胞记忆(tscm)群体两者以及幼稚t细胞(tn)。使用对活细胞数目的guava分析和对表型的流式细胞分析进行评估。

实验设计：从自健康人供体收集的pbmc富集tcm和tcm/scm/n细胞系。简言之，通过cd14+单核细胞和cd25+调节性t细胞的clinimacs/automacs^tm消减，接着cd62l+记忆群体的automacs^tm选择来产生tcm/scm/n细胞。相反，通过cd14+单核细胞、cd25+调节性t细胞和cd45ra+幼稚和干细胞记忆t细胞的clinimacs/automacs^tm消减，接着cd62l+群体的automacs^tm选择来产生tcm细胞。选择过程的评估包括下面更详细描述的活细胞数计数以及流式细胞分析。然后，将细胞冷冻保存用于未来的研究。

富集过程的概述：用蔗聚糖处理血液产物，并将得到的pbmc在pbs/edta中进行一系列清洗。然后，将pbmc重悬在完全x-vivo15培养基中，并在一些情况下转移到300cc转移袋中，然后将所述转移袋置于3-d旋转器上过夜。然后，pbmc经历连续轮次的clinimacs/automacs^tm消减和选择以富集cd14^-/cd25^-/cd45ra^-/cd62l⁺tcm或cd14^-/cd25^-/cd62l⁺tcm/scm/n群体。第一步涉及磁性消减(通过clinimacs^tm或automacs^tm)以除去cd14+单核细胞、cd25+调节性t细胞，并且对于tcm，cd45ra+幼稚t细胞。然后，使用抗-cd62l-生物素(dreg56)试剂对剩余的细胞进行cd62l+群体的正选择(通过automacs^tm)。记录两轮富集后的最终细胞计数。然后，通过流式细胞术分析最终选择的细胞群体的样品。

流式细胞测定和分析的概述：如下进行细胞群体的流式细胞分析。使用台式离心机在facs染色溶液(fss)中清洗样品，重悬于fss中，并且将每个样品100μl等分取样至预标记的12x75mmfacs管(每种条件1管)中。将所需要的体积的抗体添加到其各自的facs管，然后将管在4℃在黑暗中温育30分钟。在温育结束时，将每管在fss中清洗两次，并重悬于250μlfss或含有dapi作为存活力染料的fss中。然后，运行样品，并在facscalibur(bectondickenson)或macsquant(miltenyi)仪上分析。通过fcsexpress软件(denovosoftware,losangeles,ca)计算存活的免疫反应性细胞的百分比。

富集后产率：下表1中描绘了自每种细胞产物的cd3+t细胞的回收率。总体上，cd14^-/cd25^-/cd45ra^-/cd62l⁺cd3⁺tcm的富集导致2-6％的回收率，而cd14^-/cd25^-/cd62l⁺cd3⁺tcm/scm/n的富集导致4-30％回收率。事实上，当比较每个匹配对时，tcm/scm/n细胞对tcm细胞有高1.6-15倍的回收率。

富集后流式细胞分析：两轮clinimacs^tm富集后，通过facs分析测定富集细胞的表型。自三个代表性供体衍生的细胞产物的结果显示在图4中。来自每个供体的tcm和tcm/scm/n群体表现出富集的cd3+和cd62l+细胞水平，对tcm消减cd45ra，而tcm/scm/n表达cd45ra，如预期的。也观察到cd14+和cd25+群体的消减，如用这两种选择策略预期的。令人感兴趣的是，在tcm/scm/n群体中当与其供体匹配tcm群体相比时，cd8+细胞的百分比通常更高(图4和表1)。

结果：该研究的结果证明临床可转移的gmp制造方法可用于有效分离cd62l+tcm以及tcm/scm/n细胞群体两者。从pbmc开始，2-6％的起始群体作为cd3+tcm回收。消除cd45ra消减步骤允许以cd3+tcm/scm/n细胞回收起始群体的4-30％。与tcm细胞相比回收多1.6至15倍的tcm/scm/n细胞的能力将增加可用作遗传工程的起始群体的t细胞的数目。此外，我们观察到消除cd45ra消减步骤看起来也增加了富集产物中cd8t细胞的百分比。

实施例3：tcm/scm/n细胞的慢病毒转导

可以将tcm/scm/n细胞群体遗传工程化改造为表达一种或多种感兴趣的蛋白质。例如，可以用能够表达一种或多种感兴趣的蛋白质的慢病毒转导细胞。下面是可用于用硫酸鱼精蛋白/细胞因子溶液用慢病毒载体转导t细胞的一种方法的实例。

如果在选择过程之后冷冻细胞，则在继续制备过程时将需要融化细胞。将冷冻保存的小瓶在37℃水浴中融化直到主要保留液体。将小瓶的内容物放入含有冷x-vivo15培养基的锥形管中。在最大制动的情况下在4℃将细胞以1200rpm离心10分钟。离心后，弃去无细胞上清液，将团粒涡旋振荡，并在要用慢病毒转导的x-vivo15培养基中将所有团粒合并成一个管。测定细胞数目，并且制备过程继续dynal珠活化。

在25℃以1400rpm离心细胞10分钟。离心后，除去无细胞上清液，温和地涡旋振荡细胞团粒，并且重悬于要用慢病毒转导的完整的xvivo15培养基中。如果在使用融化的细胞，则离心步骤是不必要的。

用人t扩充剂cd3/cd28(invitrogen)以1:3的比例(t细胞:珠)刺激tcm/scm/n细胞，然后在50u/mlrhil-2(chiron)和0.5ng/mlrhil-15(cellgenix)的情况下培养。

温育1至3天后，用含有10％fcs及5μg/ml硫酸鱼精蛋白(apppharmaceutical)、50u/mlrhil-2和0.5ng/mlrhil-15的xvivo15中以范围通常为0.1-1.5的moi用慢病毒载体转导t细胞。在慢病毒转导次日，添加含有完整x-vivo15培养基和细胞因子(10μlrhuil-2和0.5μlrhuil-15)的新鲜制备的培养基/细胞因子主混合物的1体积培养基。

然后，根据需要将培养物在x-vivo1510％fcs中维持于37℃,5％co2以保持3×10⁵-2×10⁶个活细胞/ml的细胞密度，培养的每周一、周三和周五补充细胞因子(终浓度50u/mlrhil-2和0.5ng/mlrhil-15)。

珠刺激后第7天至第9天进行cd3/cd28dynabead珠除去。使用dynamag-50或mpc磁铁除去dynal珠粒。除去珠后，采集细胞悬浮液样品进行计数。基于计数，将浓度调节至约0.5x10⁶/ml。

使培养物增殖直到达到足够数目的细胞，其通常在8和18天之间。在此时间期间，将细胞因子的完整替换添加到t细胞培养物。从第12天开始，然后每周一、周三和周五，进行计数以维持约0.5x10⁶个细胞/ml的浓度

如下进行最终收获和冷冻保存。一旦扩增的细胞达到临床施用或研究目的所需要的活细胞的必要数目，冷冻保存细胞产物。计数细胞并收获培养中的样品用于支原体检测。在4℃在最大制动的情况下将剩余的细胞以1800rpm离心20分钟。除去无细胞上清液，并且温和地涡旋振荡所有细胞团粒，重悬并合并到isolyte缓冲液(braun)中。在4℃在最大制动的情况下将管以1800rpm离心20分钟。将细胞在isolyte中重悬进行第二次清洗。

在第二次isolyte清洗后，除去无细胞上清液并温和地涡旋振荡细胞团粒并重悬于适当体积的冷冻保存介质5(biolifesolutions)中以具有适当浓度的细胞。通过置于可以以约1℃/分钟冷却的受控冷却装置(例如，mr.frosty；sigma-aldrich)或控制速率冷冻器系统(custombiogenics)中对细胞进行细胞保存。在完成冷冻程序后，立即将盒/袋和冷冻小瓶转移到ln2冷冻器中贮存。

实施例4：已经经珠刺激、慢病毒转导和扩增的tcm和tcm/scm/n细胞的比较

进行研究以评估人外周血单核细胞(pbmc)的离体扩增和细胞表面表型，所述人外周血单核细胞已经经历cd62l+tcm群体，或cd62l+tcm/scm/n群体(其包括幼稚、中枢记忆、和干细胞记忆t细胞)的clinimacs/automacs^tm富集，接着是珠刺激和用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7(一种表达靶向cd19r的car的慢病毒)或il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7(靶向il-13ralpla的慢病毒载体)(关于载体和表达的car的详情，参见wo2016/044811和wo/2002/077029)的慢病毒转导，使用为了临床使用提出的方法进行。通过监测活细胞数目评估扩增，并通过流式细胞分析评估细胞表面表型。

实验设计：使用预期适合于临床使用的方法，产生源自三名不同人供体的pbmc的嵌合抗原受体(car)t细胞产物。简言之，通过cd3/cd28-珠刺激活化已经从pbmc(基本上如上文实施例2所述)富集的tcm和tcm/scm/n细胞，并用cd19r(eq)28z-egfrt_ephiv7或il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7慢病毒转导。7-9天后除去cd3/cd28珠，然后，相应扩增t细胞培养物，并且维持长达29天，根据细胞扩增的需要添加完全x-vivo15培养基(保持0.3x10⁶-2x10⁶个活细胞/ml的细胞密度)。培养的每星期一、星期三和星期五补充细胞因子。在此扩增过程期间监测活细胞数目。然后，对最终细胞产物评估传统上用于细胞产物释放的表面标志物，例如cd3和截短的egfr(egfrt)或截短的cd19(cd19t)作为转导标志物，以及t细胞标志物cd4、cd8、cd27、cd28、cd45ra和cd62l。

刺激、转导和扩增的概述：用cd3/cd28-珠活化富集的tcm或tcm/scm/n细胞，并用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7或gmp级或研究级il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7以0.3和3.0之间的感染复数(moi)进行慢病毒转导。将细胞放入具有50u/ml的rhil-2和0.5ng/ml的rhil-15的完全x-vivo15培养基中。然后，维持培养物，根据需要添加完全x-vivo15培养基，以保持0.3x10⁶-2x10⁶个活细胞/ml的细胞密度，并且培养的每周一、周三和周五补充细胞因子(rhil-2和rhil-15)。珠刺激的7至9天后，使用dynamag-50磁体从培养物中除去cd3/cd28dynabead。在此扩增过程期间监测活细胞数目，并记录培养期间和冷冻保存最后一天的活细胞计数。各种产物列于表2。

流式细胞术：使用台式离心机在facs染色溶液(fss)中清洗样品，重悬浮于fss中，并且将每个样品100μl等分取样到预标记的12x75mmfacs管(每种条件1管)中。将所需要的体积的抗体添加到其相应的facs管中，然后将管在4℃在黑暗中温育30分钟。在一些情况下，清洗样品，然后用缀合有荧光染料的链霉抗生物素蛋白作为第二试剂染色。在温育结束时，将每管在fss中清洗两次，并重悬于250μlfss或140μlfss和70μldapi的工作稀释液(通过将6.9μl的储液与25mlfss混合制成)中。然后，运行样品，并在facscalibur(bectondickenson)或macsquant(miltenyi)仪上分析。通过fcsexpress软件(denovosoftware，losangeles，ca)计算免疫反应性细胞的百分比。

活细胞数目分析的结果：在珠刺激和用cd19r(eq)28z-egfrt_ephiv7的慢病毒转导后，在支持t细胞生长的条件下扩增细胞产物。图5中描绘了生长曲线，并且表3中描绘了基于每种产物的总活细胞的最终细胞数目和倍数扩增。总体上，tcm/scm/n衍生的细胞产物的倍数扩增与其tcm衍生的对应物的倍数扩增相似。

终产物流式细胞计数分析：离体扩增后每种细胞产物的流式细胞分析揭示了所有最终的冷冻保持细胞产物已经通过我们的传统产品规格对于同一性为>80％cd3，且对于效力为>10％egfrt或cd19t(图6a)。事实上，来自每个供体的tcm/scm/n衍生的产物在cd3和egfrt/cd19t两者的免疫反应性上与其相应的tcm衍生产物非常相似。

其它t细胞标志物的流式细胞分析(图6a)揭示，虽然所有细胞产物具有cd4和cd8t细胞亚组，但是tcm/scm/n衍生的cart细胞系与其tcm衍生的对应物相比具有相对更高比例的cd8细胞。tcm衍生的细胞产物和tcm/scm/n衍生的细胞产物两者也都表达记忆相关标志物cd27、cd28和cd62l。然而，cd27表达通常在tcm/scm/n衍生的产物上更高。此外，cd45ra表达水平在tcm/scm/n衍生的产物上也显著更高。

结论：所获得的这些数据共同指示，可以对tcm和tcm/scm/n富集群体两者进行cd3/cd28珠粒刺激，慢病毒转导，并在体外扩增。由于tcm和tcm/scm/n衍生的对应物之间的倍数扩增是相似的，重要的是注意，以较大的tcm/scm/n细胞数目开始的能力可以允许较短的扩增时间以达到对于临床使用足够的细胞数目。

流式细胞分析揭示了以类似的效率转导tcm和tcm/scm/n细胞群体两者以表达egfrt或cd19t转基因。流式细胞分析也证实，tcm和tcm/scm/n细胞群体均表达t细胞标志物cd3、cd4、cd8以及t细胞记忆标志物cd27、cd28和cd62l。在tcm/scm/n群体中观察到的cd45ra+细胞的较高百分比如预期的那样，因为在选择过程中对tcm细胞消减了cd45ra。

实施例5：用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7转导的静脉内递送的tcm和tcm/scm/n细胞群体的体内功效

进行研究以评估使用适合临床使用的方法用表达靶向cd19的car的慢病毒载体(cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7慢病毒载体)转导并扩增的未选择的pbmc、cd62l+tcm细胞和cd62l+tcm/scm/n细胞的体内功效。使用表达cd19的sup-b15人急性淋巴细胞性白血病细胞系在免疫缺陷型nsg小鼠中检查静脉内(i.v.)施用的这些细胞的体内抗肿瘤效力，所述细胞系经工程化改造而表达绿色荧光蛋白(gfp)和萤火虫萤光素酶(ffluc)报告基因(pmid：22407828)。

实验设计：在本研究中使用已经用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7进行慢病毒转导并扩增21天的tcm衍生的或tcm/scm/n衍生的t细胞系(参见上文，实施例2和4)。然后，对i.v.施用的新鲜融化的cart细胞评估其控制i.v.植入的sup-b15细胞的体内生长的能力。检测如通过xenogen成像测量的肿瘤负荷和如通过外周血的流式细胞分析测量的t细胞持续性。

体内异种移植物研究的概述：在第0天以300rad照射雌性nsg小鼠(10-12周龄)。在第1天，将小鼠分成组(n＝4)并且保持未处理，或者用2.5x10⁶个hd270衍生的模拟转导pbmc(无car)、hd270cd19rtpbmc、hd270cd19rtcm、或hd270cd19rtcm/scm/ni.v.(即，经由尾静脉)处理。这转化成对每只小鼠施用0.5x10⁶个cd19r/egfrt+tpbmc，cd19r/egfrt+tcm的car+细胞或0.625x10⁶cd19r/egfrt+tcm/scm/n的平均值，如通过hd270cd19rtcm和tcm/scm/n衍生系的表型分析限定。在第2天，用每1car+t细胞gfp:ffluc+sup-b15肿瘤细胞的2个肿瘤细胞i.v.攻击2只小鼠。然后通过xenogen成像和萤火虫萤光素酶(ffluc)通量(光子/秒)的量化随时监测人急性淋巴白血病细胞系的生长。在第41天，进行眶后放血，并且使用macsquant仪和fcsexpress软件(denovosoftware，losangeles，ca)，通过流式细胞分析对血液评估人cd3表达t细胞的存在。

体内抗肿瘤效力的评估：在图7a和图7b(其描绘了此研究的结果)中，可以看出，cd19rtcm细胞的i.v.施用仅显示暂时的治疗益处，而cd19rtcm/scm/n细胞对ffluc+sup-b15肿瘤表现出更强的抗肿瘤活性。

外周血中t细胞的分析：为了评估这些小鼠中外周血中t细胞的持久性，对i.v.t细胞施用后40天收集的眶后血进行流式细胞分析。如图8中描绘，car+t细胞仅在接受tcm/scm/n细胞的小鼠中在此时间点时检出。car+人t细胞的此种存在与表达gfp的supb15肿瘤细胞的不存在相关。

这些研究证明了，用cd19rtcm和cd19rtcm/scm/n衍生的细胞系两者观察到体内抗肿瘤效力，其中经cd19rtcm/scm/n细胞处理的小鼠的抗肿瘤响应大于经cd19rtcm处理的小鼠的抗肿瘤响应。此种功效部分与检测经cd19rtcm/scm/n处理的小鼠的血液中car+t细胞的能力相关。

实施例6：用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7转导的tcm和tcm/scm/n细胞的效应器活性

进行研究以评估使用预期适合临床使用的方法用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7慢病毒载体转导并扩增的cd62l+中枢记忆(tcm)细胞或cd62l+tcm/scm/n细胞的cd19特异性细胞溶解活性、脱粒和细胞因子产生。使用基于流式细胞术的长期杀伤测定法和5小时脱粒测定法评估细胞溶解活性。通过与刺激物细胞共培养5小时后t细胞的胞内染色来评估细胞因子产生。

实验设计：将tcm细胞和tcm/scm/n细胞用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7进行慢病毒转导并扩增长达21天(参见实施例2和4)。通过长期杀伤测定法和5小时脱粒测定法评估这些细胞产物的cd19特异性效应器功能，所述长期杀伤测定法评估了与效应物t细胞共温育72小时后靶细胞的损失，所述5小时脱粒测定法评估作为t细胞细胞毒活性的标志物的细胞表面cd107a动员。然后，通过胞内ifn-γ染色的流式细胞分析进行体外刺激5小时后新鲜融化的最终细胞产物的细胞因子产生的评估。

长期杀伤测定法的简要概述：在测定前1天将每种t细胞产物的样品融化，在50u/mlrhil-2和0.5ng/mlrhil-15存在下静置过夜，然后进行72小时杀伤测定法。简言之，计数每种t细胞系和靶细胞系，并且以1:1car+t细胞比靶细胞比率接种到96孔组织培养处理的圆底板中–具体地，每孔具有10％fbs的200ulx-vivo15培养基中25,000:25,000。培养72小时后，在胰蛋白酶处理的情况下收集细胞，在冷facs缓冲液中清洗，然后用抗人cd45染色以检测t细胞，用dapi作为存活力染料。运行样品并在macsquant(miltenyi)仪上分析，并且通过flowjo软件(flowjo，llc，ashland，or)计算活的免疫反应性细胞的数目。然后，将最终结果绘制为当与已经100％标准化的模拟转导的效应细胞共培养物的cd45阴性前向散射高肿瘤细胞相比时保留在培养物中的cd45阴性前向散射高肿瘤细胞的百分比。

脱粒测定法和胞内细胞因子分析的简要概述：将每种t细胞产物样品新鲜融化，然后进行5小时脱粒测定法。计数t细胞并重悬于含有golgistop(一种阻断从细胞表面再吸收cd107a的蛋白转运抑制剂)的培养基中。然后，以1:1比率在96孔板中将t细胞与肿瘤细胞(具有golgistop)接种。对每孔添加针对cd107a抗体，然后在37℃将板温育5小时。然后，将另外的抗体添加到每种条件以染色cd45、cd4、cd8和egfrt转基因。然后，将细胞固定并透化，以用对ifn-γ特异性的抗体或同种型对照抗体进行染色。运行样品并在macsquant(miltenyi)仪上分析，通过flowjo软件(flowjo,llc,ashland,or)计算免疫反应性细胞的百分比。

通过长期杀伤测定法测定细胞溶解活性：将已经经模拟转导或用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7转导的tcm细胞和tcm/scm/n细胞各自与cd19阴性k562细胞或cd19+supb15细胞一起铺板72小时。结果呈现在图9中，并且显示了在用cd19rtcm和cd19rtcm/scm/n细胞两者的培养物中当与其相应的模拟转导对照相比时，可检测的supb15靶物的相似丧失。实际上，supb15靶物的此种丧失显著大于用k562靶物观察到的，进一步支持了此种细胞溶解活性的cd19特异性。

通过脱粒测定法测定效应物活性：将已经经模拟转导或用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7转导的tcm细胞和tcm/scm/n细胞各自与cd19阴性k562细胞或cd19+supb15细胞一起铺板。结果在下文呈现(图10)，并且证明在用supb15细胞刺激时，cd8+cd19rtcm和cd8+cd19rtcm/scm/n细胞抑制相似的cd19特异性脱粒(即cd107a表达)。通过检查未被cd19表达性supb15细胞刺激以脱粒的模拟转导细胞(图10)进一步证实了此种活性的抗原特异性。

通过胞内细胞因子测定法测定效应物活性：将已经经模拟转导或用cd19r(eq)28z-t2a-egfrt_ephiv7转导的tcm细胞和tcm/scm/n细胞各自与cd19阴性k562细胞或cd19+supb15细胞一起铺板。结果呈现在图11中，并证明cd8+cd19rtcm和cd8+cd19rtcm/scm/n表现出类似的cd19特异性胞内ifn-γ谱。通过检查未被cd19表达性supb15细胞刺激以表达ifn-γ的模拟转导细胞()进一步证实了此种活性的抗原特异性。

这些数据证实，已经用cd19r(eq)c28z-t2a-egfrt_ephiv7转导的tcm细胞和tcm/scm/n细胞两者在与cd19表达性靶细胞共培养时表现出细胞溶解活性、脱粒和细胞因子(即ifn-γ)的产生。

实施例7：用il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7转导的tcm和tcm/scm/n细胞的效应器活性

进行研究以评估用表达靶向il13rα2的car的慢病毒载体转导的cd62l+tcm细胞和cd62l+tcm/scm/n细胞的体内功效。car包括人il-13变体，并通过慢病毒载体(il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7)表达。表达该载体的细胞群体如上述实施例4中所述制备，并在免疫缺陷nsg小鼠的胶质母细胞瘤鼠模型中使用il13rα2+主要低传代gbm肿瘤球品系pbt030-2评估，所述pbt030-2已经经工程化改造以表达萤火虫萤光素酶(ffluc)报告基因。

简言之，在第0天，将雄性nsg小鼠(10-12周龄)在右和左对侧半球两者中用1x10⁵ffluc+pbt030-2细胞立体定向注射，并允许植入6天。然后，将各组小鼠保持未处理或用1x10⁶car+il13(eq)bbζ/cd19t+tcm/scm？n、car+il13(eq)bbζ/cd19t+tcm、模拟转导tcm/scm？n或模拟转导tcm处理。通过xenogen成像和ffluc通量(光子/秒)定量随时间监测pbt030-2肿瘤生长。

如图12中显示，用针对il-il13rα2的car转染的tcm/scm/n就抑制肿瘤生长而言以及就鼠瘤内胶质母细胞瘤模型中的存活而言优于相似转染的tcm。