本发明涉及吸附剂在体外、离体或体内降低或抑制梭菌属(Clostridium)细菌的致病性或毒力的用途。本发明可以用于任何哺乳动物或环境中，并且对抑制艰难梭菌(Clostridium difficile)的致病性或毒力特别有效。
背景技术：
艰难梭菌属于受关注的细菌病原体的特定亚群：孢子形成细菌。细菌孢子(内生孢子)是由细菌响应环境应力形成的休眠非生殖性结构。一旦环境条件变得有利，孢子萌发并且细菌增殖。在致病细菌的情况下，在人类宿主中萌发可能导致疾病。孢子如艰难梭菌的萌发是孢子产生营养细菌的过程，该营养细菌接着能够生长和繁殖。细菌孢子对多种试剂和环境条件(包括辐射、干燥、温度、饥饿和化学试剂)极具耐受性。这种对数种试剂的天然耐受性使得孢子能够在关键环境如医院、其他保健中心和食物生产机构中存留数月，在这些环境中，标准清洁剂、杀菌剂和灭菌工艺不能根除所述细菌。在食物生产的情况下，孢子的存在会产生在简单的食物腐败到食物携带的病原体的传播和食物中毒范围内的严重后果。
梭菌属的成员是革兰氏阳性、形成孢子的专性厌氧菌。引起人类疾病的示例性菌种包括但不限于产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C.botulinium)、索氏梭菌(C.sordellii)和艰难梭菌。梭菌属与多种人类疾病有关，包括破伤风、气性坏疽、肉毒中毒和假膜性结肠炎，并且可以是食物中毒的病原体。特别受到关注的是由艰难梭菌引起的疾病。艰难梭菌引起艰难梭菌相关性疾病(CDAD)，也称为艰难梭菌感染(CDI)，并且在过去的10年中全世界病例数已经增加了10倍，其中高毒力和耐药菌株现在变得具有地方性。
艰难梭菌是一种共生的肠道细菌，其水平由正常的肠道菌群控制。然而，所述细菌是艰难梭菌相关性疾病(CDAD)的病原体，并且已被鉴定为CDAD的最严重表现，假膜性结肠炎的主要原因。CDAD与在轻度腹泻到严重的血性腹泻、假膜性结肠炎、中毒性巨结肠和死亡范围内的多种症状相关。CDAD产生的主要风险因素是使用抗生素破坏正常的肠道细菌微生物群，从而使得艰难梭菌能够过度生长。尽管克林霉素(clindamycin)已经是与CDAD相关的第一主要抗生素之一，但是在用几乎所有抗生素治疗患者后都发生了该疾病，所述抗生素包括氟喹诺酮、林可酰胺、β-内酰胺(包括青霉素、头孢菌素和碳青霉烯，无论单独给予或与β-内酰胺酶抑制剂一起给予)和许多其他类别的成员。有一个有说服力的文献描述抗生素治疗后获得CDAD的几率增加。来自US CDC的最近的通讯表明：“使用抗生素的人在使用药物期间和之后一个月期间感染艰难梭菌[感染]的可能性高7-10倍(people on antibiotics are 7-10times more likely to get C.difficile[infections]while on the drugs and during the month after)”。目前我们还看到多个CDAD病例，据报道其并没有潜在的抗生素使用，特别是在保健机构中爆发艰难梭菌的情况下。
CDAD主要在医院环境中受关注，并且在老年患者中备受关注，在所述情况下死亡率特别高。USA的死亡率从1999年的每1百万人中有5.7人上升到2004年的每1百万人中有23.7人。在一般人群中艰难梭菌的定殖率最多3％，但住院将定殖率急剧提高到高达25％。新的地方菌株的出现备受关注。一个特别相关的实例是显示增加的毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB)产生以及被称为二元毒素的另一种毒素的产生的高毒力BI/NAP1(也被称为核糖型027)菌株。菌株如核糖型027的高毒力菌株的高孢子形成特征很大程度上造成了该问题。
由艰难梭菌产毒菌株产生的两种主要毒素，TcdA和TcdB，自其最初被识别为主要的艰难梭菌毒力因子以来已被深入研究。艰难梭菌毒素A(TcdA)和B(TcdB)由两个独立但紧密连接的基因编码，所述基因一起形成被称为“产毒元件”或“致病性基因座”的19.6千碱基区域的一部分。TcdA和TcdB基因和蛋白质是高度同源的，并且所述基因可能是通过复制进化而来的。毒素A和B在大多数艰难梭菌产毒菌株中同时产生；其造成艰难梭菌的致病性。毒素在指数生长期开始产生，并且当细菌达到稳定期时，所述毒素通常在培养36至72小时之间从细菌释放。存在于细菌内的毒素可以通过超声处理或通过使用弗氏压碎器(French pressure cell)而提前释放。
早期的研究证实了毒素水平和假膜性结肠炎的产生和腹泻持续时间之间存在直接关系(Burdon,D.W.,R.H.George,G.A.Mogg,Y.Arabi,H.Thompson,M.Johnson,J.Alexander-Williams和M.R.Keighley.1981.粪便毒素和抗生素相关假膜性结肠炎的严重程度(Faecal toxin and severity of antibiotic-associated pseudomembranous colitis).J.Clin.Pathol.34:548-551.)。TcdA在艰难梭菌相关疾病中的作用的更直接证据来自于在无菌小鼠中的研究，其显示了TcdA的单克隆抗体的抵抗疾病的保护性(Corthier,G.,M.C.Muller,T.D.Wilkins,D.Lyerly和R.L'Haridon.1991.通过使用针对艰难梭菌毒素A的单克隆抗体而产生的在无菌小鼠中抵抗实验性假膜性结肠炎的保护性(Protection against experimental pseudomembranous colitis in gnotobiotic mice by use of monoclonal antibodies against Clostridium difficile toxin A).Infect.Immun.59:1192-1195.)。最近还显示用阴离子高分子量聚合物中和艰难梭菌毒素可保护80％的暴露于生物体的实验用仓鼠(Kurtz,C.B.,E.P.Cannon,A.Brezzani,M.Pitruzzello,C.Dinardo,E.Rinard,D.W.Acheson,R.Fitzpatrick,P.Kelly,K.Shackett,
A.T.Papoulis,P.J.Goddard,R.H.Barker,Jr.,G.P.Palace和J.D.Klinger.2001.GT160-246,一种用于治疗艰难梭菌结肠炎的毒素结合性聚合物。(a toxin binding polymer for treatment of Clostridium difficile colitis).Antimicrob.Agents Chemother.45:2340-2347.)。
TcdA和TcdB对该疾病的相应作用和贡献尚不完全清楚。早期研究表明，可以在动物模型中用TcdA诱导假膜性结肠炎的特征，包括积液、发炎和细胞损伤(D.M.Lyerly等人,Infect.Immun 54:70-76,1986)。
然而，这个结果在此后受到若干报道的质疑。实际上，一项早期的研究发现，除非TcdA存在，否则TcdB不能引发疾病(Lyerly,D.M.,K.E.Saum,D.K.MacDonald和T.D.Wilkins.1985.在胃内给予的艰难梭菌毒素对动物的影响(Effects of Clostridium difficile toxins given intragastrically to animals).Infect.Immun.47:349-352)。从临床分离株中偶尔鉴定到天然存在的TcdA-TcdB+菌株(Sambol,S.P.,M.M.Merrigan,D.Lyerly,D.N.Gerding和S.Johnson.2000.导致人临床疾病的艰难梭菌变体菌株的毒素基因分析(Toxin gene analysis of a variant strain of Clostridium difficile that causes human clinical disease).Infect.Immun.68:5480-5487.)并且其可用于表征TcdB在艰难梭菌相关疾病中的作用。有趣的是，这些菌株能够引起疾病，并且在严重假膜性结肠炎的一些病例中，患者死于TcdA缺陷型菌株所引起的疾病(Alfa,M.J.,
A.Kabani,D.Lyerly,S.Moncrief,L.M.Neville,A.Al-Barrak,G.K.Harding,B.Dyck,K.Olekson和J.M.Embil.2000.导致艰难梭菌相关腹泻的医院内暴发的艰难梭菌的毒素A阴性、毒素B阳性菌株的表征(Characterization of a toxin A-negative,toxin B-positive strain of Clostridium difficile responsible for a nosocomial outbreak of Clostridium difficile-associated diarrhea).J.Clin.Microbiol.38:2706-2714)。最近，有人提出TcdA和TcdB两者在疾病中都起重要作用(S.A.Kuehne,S.T.Cartman,J.T.Heap,M.L.Kelly,A.Cockayne和N.P.Minton.2010.毒素A和毒素B在艰难梭菌感染中的作用(The role of toxin A and toxin B in Clostridium difficile infection).Nature 467:711-713,2010)；但其它两篇基于在若干动物模型中的实验的有据可查的报道表明，艰难梭菌毒力和造成疾病的的主要因子是TcdB(D.Lyras,J.R.O'Connor,P.M.Howarth,S.P.Sambol,G.P.Carter,T.Phumoonna,R.Poon,V.Adams,G.Vedantam,S.Johnson,D.N.Gerding,J.I.Rood.2009.毒素B对艰难梭菌的毒力是必不可少的(Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile).Nature 458:1176-1179.10.1038/nature07822.)。
治疗CDAD的主要治疗选择是停止任何目前的抗微生物治疗，接着适当地使用万古霉素(vancomycin)或甲硝唑(metronidazole)。两种药剂通常口服施用，但甲硝唑也可以静脉内施用，并且在严重的情况下，万古霉素也可以通过许多其他途径施用，包括结肠内，通过鼻胃管或以万古霉素-保留灌肠剂的形式施用。据报道用于治疗CDAD的其他抗生素药剂包括非达霉素(fidaxomicin)、夫西地酸(fusidic acid)、利福霉素(rifamycin)和其类似物、替考拉宁(teicoplanin)和杆菌肽(bacitracin)，但在治愈原发感染方面都没有显示优于万古霉素或甲硝唑的特定功效。然而，CDAD最棘手的问题之一是疾病的频繁复发。实际上，在用万古霉素或甲硝唑治疗后，25-30％的病例在3个月内观察到疾病复发。但如果患者已经经历了先前的CDAD发作，则复发率更高(约40％)；其在每次复发后变得越来越高，使得在第五或第六次CDAD发作后复发变得不可避免，从而没有其他治疗选择，而只能进行粪便微生物群落移植(FMT)。用非达霉素治疗后，复发率显著降低，15％相对于25％(T.J.Louie,M.A.Miller,K.M.Mullane,K.Weiss,A.Lentnek,Y.Golan,S.Gorbach,P.Sears,Y.K.Shue,OPT-80-003Clinical Study Group.2011.N Engl J Med 364:422-31)，这是对近来使用这种抗生素具有极大兴趣的基础。人们相信用万古霉素和甲硝唑治疗CDAD后高复发率的主要因素是其对肠道微生物群的严重破坏作用；非达霉素的作用谱比万古霉素和甲硝唑窄的事实可以有助于在其使用后观察到较低的复发率。除了停止任何有害的抗细菌治疗之外，还应避免使用抗蠕动剂(诸如阿片剂或洛哌丁胺(loperamide))，因为其可能减少艰难梭菌毒素的清除并且加剧毒素介导的结肠损伤。
作为独立药剂或与抗细菌剂结合使用的替代疗法的目的在于以下策略中的一种或数种，诸如：试图阻止抗生素介导的微生物群的破坏，重建天然肠道微生物群体，减少艰难梭菌毒素的水平或刺激免疫系统。因此，替代性CDAD疗法包括提供布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)或嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)以及抗生素，但结果不能令人信服。在所有其他治疗选择失效的严重情形下，使用手术；尽管结肠切除术的比率很低(最多3％例)，但结肠切除术与高死亡率(高达60％)有关。最近且非常成功的选择由粪便微生物群落移植(FMT)组成，其能够获得超过85％的治愈率(Hamilton MJ,Weingarden AR,Sadowsky MJ等人,用于复发性艰难梭菌感染的粪便微生物群移植的标准化冷冻制剂(Standardized Frozen Preparation for Transplantation of Fecal Microbiota for Recurrent Clostridium difficile Infection).Am J Gastroenterol.2012；107:761-767.doi:10.1038/ajg.2011.482)；基于FMT原理的新型治疗选择正在迅速发展。
艰难梭菌相关疾病(CDAD)或艰难梭菌感染(CDI)是医院中抗生素相关性腹泻的主要可鉴定原因(Cohen S,Gerding D,Johnson S等人,成人艰难梭菌感染的临床实践指南：2010年由美国医疗保健流行病学协会(SHEA)和美国传染病协会(IDSA)更新(Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in adults:2010update by the Society for Healthcare Epidemiology of America(SHEA)and the Infectious Diseases Society of America(IDSA)).Infect Control Hosp Epidemiol 2010；31:431-55.；Kelly CP.管理初始艰难梭菌感染的当前策略(Current strategies for management of initial Clostridium difficile infection).J Hosp Med 2012；7:S5-10)。仅在USA，据报道每年就有>500,000位患者患有CDAD，其中每年多达29,000位死亡(Rupnik M,Wilcox MH,Gerding DN.艰难梭菌感染：流行病学和发病机制的新发展(Clostridium difficile infection:new developments in epidemiology and pathogenesis).Nat Rev Microbiol 2009；7:526-36.,Lessa等人,美国艰难梭菌感染的负担(Burden of Clostridium difficile Infection in the United States).N Engl J Med 2015；372:825-834)。据估计，美国每年的保健负担为>30亿美元(Kachrimanidou M,Malisiovas N.艰难梭菌感染：综合评论(Clostridium difficile infection:A comprehensive review).Crit Rev Microbiol 2012；37:178-87.)。最近的一项研究报道，CDAD比耐甲氧西林(methicillin)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)造成的医院内感染多25％(Voelker R.艰难梭菌毒力增加需要新的治疗方法(Increased Clostridium difficile virulence demands new treatment approach).J Am Med Assoc 2010；303:2017-9.)。CDAD进展为严重症状和死亡的比率一直在增加(Valiquette L,Low DE,Pepin J,McGeer A.医院中的艰难梭菌感染：酝酿中的风暴(Clostridium difficile infection in hospitals:a brewing storm).Can Med Assoc J 2004；171:27-9.)。
迫切需要新的和有效的药剂和治疗来预防和治疗孢子形成细菌相关疾病，特别是由梭菌属成员引起的疾病，并且特别是与艰难梭菌感染相关的疾病。考虑到多种广谱抗生素(包括β-内酰胺和喹诺酮抗生素)对艰难梭菌的难治性以及耐药性出现和病症复发的频率，这种需求特别急迫。
技术实现要素：
本发明涉及用于治疗或预防梭菌相关疾病的组合物和方法。本发明更特别涉及吸附剂在体外、离体或体内抑制梭菌属细菌的致病性的用途。本发明尤其来自本发明者的如下意外发现：吸附剂可以通过抑制毒素的产生和释放、梭菌的孢子形成和孢子萌发来有效地改变梭菌属细菌的毒力，从而有效地中和这些细菌的致病性。
因此本发明的一个目的涉及一种用于治疗哺乳动物的梭菌相关疾病的吸附剂。
本发明的一个特定目的涉及一种用于预防哺乳动物的梭菌相关疾病的吸附剂。
本发明的另一个目的涉及一种用于抑制梭菌属的细菌的致病性的吸附剂。
本发明还涉及一种用于抑制梭菌属的细菌的致病性的方法，所述方法包含使所述细菌暴露于吸附剂。
本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物的梭菌相关疾病的方法，所述方法包含使所述哺乳动物暴露于吸附剂。
本发明还涉及一种用于预防哺乳动物的梭菌相关疾病的方法，所述方法包含使所述哺乳动物暴露于吸附剂。
本发明还涉及一种用于降低哺乳动物的梭菌相关疾病的严重性和死亡率的方法，所述方法包含使所述哺乳动物暴露于吸附剂。
本发明还涉及吸附剂的用途，其用于抑制或延缓梭菌属的细菌的毒素的产生，或抑制或延缓梭菌属的细菌的孢子的萌发，和/或抑制或延缓梭菌属的细菌的孢子形成。
根据优选实施方式，所述吸附剂是活性炭和/或所述细菌是艰难梭菌。此外，在一个优选实施方式中，将本发明用于哺乳动物体内，并且口服施用所述吸附剂，优选使用在胃肠道中、特别是在小肠下部、特别是在回肠-盲肠接合处释放所述吸附剂的制剂。优选地，所述制剂在回肠末端，即在盲肠和结肠之前释放所述吸附剂。本发明可以用于任何哺乳动物，诸如人类或非人类动物，并且可以用于治疗或预防环境。本发明还可以用于在任何环境如医院中防止梭菌孢子和/或梭菌相关疾病的污染或传播。
附图说明
图1：培养48h后，吸附剂处理的BHI肉汤中的艰难梭菌的计数、孢子的计数和毒素滴度。艰难梭菌菌株核糖型001、027和078的平均计数。
图2：培养48h后，吸附剂处理的粪便浆液肉汤中的艰难梭菌、孢子的计数和毒素滴度。艰难梭菌菌株核糖型001、027和078的平均计数。
图3：培养48h后，吸附剂处理的肠道模型肉汤中的艰难梭菌、孢子的计数和毒素滴度。艰难梭菌菌株核糖型001、027和078的平均计数。
图4：在与活性炭一起培育后，BHI肉汤中核糖型027菌株的艰难梭菌毒素滴度的测量。
图5：在与活性炭一起培育后，BHI肉汤中核糖型078菌株的艰难梭菌毒素滴度的测量。
图6：在与活性炭一起培育后，BHI肉汤中核糖型VA-11REA J菌株的艰难梭菌毒素滴度的测量。
图7：在与活性炭一起培育后，粪便浆液肉汤中艰难梭菌菌株核糖型001、027和078的艰难梭菌萌发的测量。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗或预防梭菌相关疾病的组合物和方法并且涉及在体外、离体或体内抑制梭菌属细菌的致病性。本发明尤其来自如下意外发现：吸附剂可以通过抑制毒素的产生和释放、梭菌属细菌的孢子形成和/或孢子萌发来有效地改变梭菌属细菌的毒力，从而有效地中和这些细菌的致病性并且有效地预防和/或治疗由这些细菌引起的疾病或病状。
吸附剂和制剂
术语吸附剂是指可以吸附基质的任何化合物或材料，该吸附通常通过吸附剂表面与待吸附基质之间的物理化学结合进行。吸附剂可以是特异性或非特异性的。用于本发明的优选吸附剂是最适用于人类或动物进行药学或兽医应用的药用级吸附剂。
适用于本发明的吸附剂的实例包括但不限于活性炭；粘土，包括膨润土、高岭土、蒙脱石(montmorrillonite)、硅镁土、埃洛石、合成锂皂石(laponite)等；二氧化硅，包括胶态二氧化硅(例如AS-40)、中孔二氧化硅(MCM41)、煅制二氧化硅(fumed silica)、沸石等；滑石；消胆胺(cholesteramine)等；聚苯乙烯磺酸盐等；单磺化和多磺化树脂；以及其他树脂，如用于细菌学测试的树脂，如树脂。
优选的吸附剂是药用级活性炭(Chemviron、Cabot、Norit、Merck或其他来源)。在一个特定实施方式中，所述吸附剂是活性炭，更优选比表面积高于1000m2/g、优先高于1200m2/g、优先高于1400m2/g、优选高于1600m2/g、甚至更优选高于1800m2/g的活性炭。在一个优选实施方式中，所述活性炭来源于植物。在一个优选实施方式中，活性炭的特征为糖蜜值(molasses number)大于200，优选大于250，更优选大于400或甚至大于600。在一个优选实施方式中，活性炭展现大于20g/100g、优选大于30g/100g或甚至更优选大于35g/100g的亚甲基蓝吸附。
本发明方法中使用的吸附剂的量可以根据所处理的主体/材料以及吸附剂的总容量、吸附能力和选择性而变化。通常，吸附剂的量是如下量，其足以抑制梭菌属细菌的致病性，或产生治疗效果，例如在治疗上显著降低在肠道末端部分中、特别是在结肠中由细菌所释放的孢子和/或毒素的量，或显著延缓细菌的成熟，即环境中孢子的产生和进一步脱落。
用于本发明的吸附剂可以被配制成任何可接受且适合的组合物。这些适合的组合物包括用于口服传递、直肠传递、局部施用、粘膜施用、吸入等的制剂。在一个特定实施方式中，将吸附剂配制成适用于向人类或动物施用的药物组合物。更优选地，将吸附剂配制成如下口服制剂，其适合于在肠道中，或与肠细菌接触时，特别是在胃肠道中，更特别是在肠的下部，即回肠末端、盲肠和/或结肠中释放所述吸附剂。
WO2006/122835和WO2007/132022中已经描述了适合于吸附剂的肠道递送的制剂的实例。在一个优选实施方式中，如WO2011/104275中所提出，将吸附剂与角叉菜胶一起配制，优选配制成丸粒的形式。这种制剂可以形成核心，其可以覆盖有包衣层，使得所述吸附剂在肠的下部，即在回肠末端、盲肠和/或结肠中释放。
角叉菜胶是从红海藻提取的天然存在的线性硫酸化多糖的家族。角叉菜胶是由重复的半乳糖和3,6-脱水半乳糖(3,6-AG)单元组成的高分子量多糖，所述单元都被硫酸化和非硫酸化。所述单元通过交替的α1-3和β1-4糖苷键连接在一起。可购得三种基本类型的角叉菜胶，即κ、ι和λ角叉菜胶，其不同之处在于半乳糖单元上的硫酸酯基的数量和位置。用于本发明的角叉菜胶可以选自κ、ι和λ角叉菜胶以及其混合物。在这个实施方式的一方面中，将吸附剂与κ-角叉菜胶混合。在一个特定实施方式中，所述混合物包含活性炭和κ-角叉菜胶。
优选地，以吸附剂与角叉菜胶的混合物的重量计，角叉菜胶的量在约5％至约25％之间，更优选约10％至约20％之间。根据本发明的一个特定实施方式，角叉菜胶的量为所述混合物的约15重量％。例如，以所有混合物的重量计，所述混合物可以含有85％的吸附剂和15％的角叉菜胶。
根据本发明的一个特定实施方式，提供上示重量比的活性炭与角叉菜胶的混合物。
所述核心(或丸粒)可以通过本领域技术人员已知的任何适合方式来制造。具体地，粒化技术适合于制造所述核心。例如，可以通过以上述比率混合吸附剂与角叉菜胶，添加溶剂如水进行湿式粒化，接着挤出球化或一锅制粒来获得所述核心。可以去除任何剩余的水，例如，通过使用常规技术干燥所得丸粒来进行。
在一个实施方式中，所述核心或丸粒的平均湿粒度在250至3000μm范围内，特别是在250至1000μm范围内，特别是在300至3000μm(诸如500至3000μm)范围内，特别是在300至1000μm(诸如500至1000μm)范围内，特别是在500至1000μm范围内，特别是在500至700μm范围内。
所述核心组合物还可以包括常规赋形剂，诸如防粘剂、粘合剂、填充剂、稀释剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、吸附剂和/或甜味剂。这些赋形剂的量可以变化，但通常在丸粒的0.1至50重量％的范围内。
如上所述，本发明的优选制剂包含有包含吸附剂、可能补充有角叉菜胶的核心，该核心覆盖有包衣层，使得所述吸附剂在肠的下部，即在回肠末端、盲肠和/或结肠中释放。
在这个方面，在一个优选实施方式中，使用如下制剂形式的吸附剂，该制剂包含：
-含有所述吸附剂和角叉菜胶的核心，和
-在核心周围形成的外部包衣层，使得所述吸附剂在小肠下部从所述制剂释放。
适合的包衣的实例包括pH依赖性肠溶性聚合物、偶氮聚合物、二硫化物聚合物和多糖，特别是直链淀粉、果胶(例如与二价阳离子交联的果胶如果胶酸钙或果胶酸锌)、硫酸软骨素和瓜尔胶。代表性的pH依赖性肠溶性聚合物包括偏苯三酸乙酸纤维素(CAT)、邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、基于丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的阴离子共聚物、邻苯二甲酸羟基丙基甲基纤维素(HPMCP)、丁二酸乙酸羟基丙基甲基纤维素(HPMCAS)、甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的共聚物、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(1:1比率)、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(1:2比率)、聚乙烯醇乙酸邻苯二甲酸酯(PVAP)和虫胶树脂。特别优选的聚合物包括虫胶、基于丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的阴离子共聚物以及甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(1:2比率)。理想地，所述聚合物在等于6.0和高于6.0、优选6.5和高于6.5的pH下溶解。适合的包衣还可以通过混合上述聚合物和共聚物来获得。
在一个特定实施方式中，所述制剂包含位于所述核心和外部pH依赖层之间的另一个中间包衣。所述中间包衣可以由各种聚合物形成，包括pH依赖性聚合物、不依赖于pH的水溶性聚合物、不依赖于pH的不溶性聚合物以及其混合物。这些pH依赖性聚合物的实例包括虫胶型聚合物、基于丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的阴离子共聚物、甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的共聚物、邻苯二甲酸羟基丙基甲基纤维素(HPMCP)和丁二酸乙酸羟基丙基甲基纤维素(HPMCAS)。不依赖于pH的水溶性聚合物的实例包括PVP或高分子量纤维素聚合物，诸如羟基丙基甲基纤维素(HPMC)或羟基丙基纤维素(HPC)。不依赖于pH的不溶性聚合物的实例包括乙基纤维素聚合物或丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
在一个特定实施方式中，本发明使用如下制剂，其包含：
-包含吸附剂(优选活性炭)与角叉菜胶(优选κ-角叉菜胶)的混合物的核心，
-选自以下各项的中间包衣：HPMC、乙基纤维素、以及甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的共聚物如L30D-55与丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物如NE30D的混合物(例如混合物比率为1:9至9:1，优选2:8至3:7)，和
-基于丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的阴离子共聚物如FS30D的外层。
在一个特定实施方式中，所述制剂包含有包含85％活性炭和15％Gelcarin GP911(κ-角叉菜胶)的核心以及具有FS30D或L30D55(Evonik,Darmstadt,Germany)的包衣。
使用方法
本发明涉及用于以使用吸附剂为基础来治疗或预防梭菌相关疾病或抑制梭菌属细菌的致病性的组合物和方法。本领域已经使用吸附剂来通过隔离肠中剩余量的活性化合物降低或避免一些所述活性化合物的副作用。例如，与抗生素一起施用的具有控释剂型的吸附剂可以隔离残留在肠下部的抗生素，从而避免不适当的抗生素诱导的生态失调，抗生素抗性细菌的产生以及相关或相应的病症。令人惊讶地，通过进行进一步测试，本发明者现在已经发现吸附剂恰好可以对梭菌属细菌的致病性具有影响。如实施例中所说明，如通过有效抑制毒素产生和/或释放、孢子形成和萌发所测量，在暴露于吸附剂的培养基中培养的梭菌属细菌和暴露于吸附剂(例如在培养期间)的梭菌属细菌丧失其毒力。结果特别显著，因为其证实了抑制艰难梭菌致病性的能力，所述艰难梭菌中的一些菌株特别具有毒力。
因此，本发明涉及用于抑制梭菌属细菌的毒力的方法，所述方法通过在体外、离体或体内将这些细菌或其直接环境暴露于吸附剂来进行。
本发明还涉及用于通过向哺乳动物施用吸附剂来治疗梭菌相关疾病的方法。
本发明还涉及用于通过向哺乳动物施用吸附剂来预防梭菌相关疾病的方法。
梭菌相关疾病是指由梭菌属细菌的感染或定殖引起或与其有关的任何病状或疾病。与梭菌属细菌如艰难梭菌感染相关的疾病可能是轻度至危及生命的。轻度情形的病症包括一天三次或超过三次水样腹泻持续数天、腹痛或触痛。更严重的艰难梭菌感染的疾病包括每天多达15次的水样腹泻、严重腹痛、食欲不振、发烧、粪便中有血或脓或体重减轻。
本发明特别涉及一种用于抑制或延缓梭菌属的细菌的毒素产生的方法，所述方法包含体外、离体或体内使这些细菌暴露于吸附剂。
本发明特别涉及一种用于抑制或延缓梭菌属的细菌的毒素产生的方法，所述方法包含体外、离体或体内使这些细菌的环境如其生长环境暴露于吸附剂。
本发明还涉及一种用于抑制或延缓梭菌属的细菌的孢子萌发的方法，所述方法包含体外、离体或体内使这些细菌暴露于吸附剂。
本发明还涉及一种用于抑制或延缓梭菌属的细菌的孢子萌发的方法，所述方法包含体外、离体或体内使这些细菌的环境如其生长环境暴露于吸附剂。
本发明还涉及一种用于抑制或延缓梭菌属的细菌的孢子形成的方法，所述方法包含体外、离体或体内使这些细菌暴露于吸附剂。
本发明还涉及一种用于抑制或延缓梭菌属的细菌的孢子形成的方法，所述方法包含体外、离体或体内使这些细菌的环境如其生长环境暴露于吸附剂。
术语“治疗”在本发明上下文中表示病状或感染的治疗性或预防性治疗。术语治疗特别指对现有病状的治疗，并且包括抑制、降低或延缓病状或其症状的程度、发展、严重性、发病率和/或持续时间。术语“预防”表示在发生疾病或感染之前对受试者进行治疗，以便保护受试者而使其避免产生梭菌相关疾病。术语治疗特别包括治疗患有梭菌相关疾病的受试者，以便例如抑制所述疾病或降低其程度、持续时间、严重性、发病率或症状。术语治疗还包括治疗暴露于梭菌属细菌或具有梭菌感染风险的受试者，以便抑制或降低或避免所述受试者的梭菌相关疾病的产生。本发明还可以用于防止或减少梭菌孢子和/或梭菌相关病症的传播。
在本发明的上下文中，术语“环境”表示细菌生长的环境。当细菌在体内培养时，该术语可以指培养基或生长培养基。其还可以指哺乳动物的体液，诸如肠液或结肠液，在这些体液中存在细菌并且细菌可以在其中生长和繁殖。其还可以指梭菌细菌可以定殖的人体的任何区室。
术语“抑制致病性”或“抑制毒力”表示至少降低细菌的致病性/毒力。优选地，该术语指示如例如通过毒素释放、孢子形成或孢子萌发所测量，致病性/毒力大幅降低至少20％，甚至更优选至少50％或超过50％。如实施例中所示，根据本发明的治疗可以将梭菌的毒素释放抑制到低于检测水平，并且可以使孢子形成或孢子萌发降低2个数量级(即100倍)或超过2个数量级，从而使这些细菌的致病性较低，甚至无致病性。
因此，本发明的一个目的在于一种抑制梭菌属细菌的致病性或毒力的方法，所述方法包含体外、离体或体内使所述细菌或其直接环境暴露于吸附剂。这种方法可以用于实验室或任何环境中，特别是体内，来控制梭菌属细菌的毒力。这种方法还可以用于哺乳动物体内来避免梭菌相关疾病。
在一个特定实施方式中，致病性或毒力的抑制通过减缓梭菌属细菌的产生来提供。在另一个实施方式中，致病性或毒力的抑制通过减缓梭菌属细菌的繁殖来提供。在又一个实施方式中，致病性或毒力的抑制通过减缓梭菌属细菌的进展来提供。在另一个实施方式中，致病性或毒力的抑制通过减缓梭菌属细菌的生命周期来提供。在另一个实施方式中，致病性或毒力的抑制通过减缓感染的演变来提供。在又一个实施方式中，致病性或毒力的抑制通过减缓感染症状的演变来提供。
因此，本发明还涉及一种方法，其用于减缓：
-梭菌属细菌的产生，
-梭菌属细菌的繁殖，
-梭菌属细菌的进展，
-梭菌属细菌的生命周期，
-梭菌属细菌感染的演变，或
-梭菌属细菌的感染症状的演变，
所述方法包含向有需要的受试者施用有效量的吸附剂。
本发明还涉及一种在如下方法中使用的吸附剂，所述方法用于减缓：
-梭菌属细菌的产生，
-梭菌属细菌的繁殖，
-梭菌属细菌的进展，
-梭菌属细菌的生命周期，
-梭菌属细菌感染的演变，或
-梭菌属细菌的感染症状的演变，
所述方法包含向有需要的受试者施用有效量的吸附剂。
因此，本发明的一个目的还涉及一种用于减缓梭菌属细菌的产生的方法。通过这种方法，减缓了由所述细菌引起的感染的产生，这在数个方面是有利的，特别是为免疫系统和/或医疗护理对抗感染提供了更多时间。本发明方法也为肠微生物群重组和排斥梭菌属细菌提供了更多时间。细菌的产生减缓可以导致感染症状的减轻，或甚至整体上抑制感染症状。
在本发明的上下文中，梭菌细菌的减缓可能发生在其细胞生命和发育的每个阶段。因此，本发明提供一种降低受试者肠道中存在的营养细菌和/或孢子的数目的方法。因此，所产生的降低还可以减少如下细菌和/或孢子的数目，所述细菌和/或孢子由受试者潜在分泌，并且污染环境，从而可能在共享同一环境的其他受试者中引发疾病的进一步发作。
在本发明的一个实施方式中，所述吸附剂独立于任何其它治疗施用。因此，本发明的一个目的是即使不对患者的微生物群进行任何诱导性破坏，也能防止梭菌属细菌生命周期中的生长和/或进展。因此，在一个特定方面，本发明提供一种用于防止或减缓梭菌属细菌生命周期中的生长和/或进展的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用吸附剂，其中该患者没有同时用抗生素治疗。在本发明的上下文中，表述“患者没有同时用抗生素治疗”是指未在向患者施用吸附剂之日并且任选地未在施用吸附剂的前一天向其施用抗生素。在另一个实施方式中，除了在施用吸附剂的同一天不施用抗生素以外，在施用吸附剂之前1至30天，诸如在施用吸附剂之前1至25天，诸如1至20天，诸如1至15天，诸如1至10天，诸如1至9天、1至8天、1至7天、1至6天、1至5天、1至4天、1至3天或1至2天，也不施用抗生素治疗。在另一个实施方式中，除了在施用吸附剂的同一天不施用抗生素以外，在施用吸附剂之后1至30天，诸如在施用吸附剂之后1至25天，诸如1至20天，诸如1至15天，诸如1至10天，诸如1至9天、1至8天、1至7天、1至6天、1至5天、1至4天、1至3天或1至2天，也不施用抗生素治疗。
本发明的一个目的还在于一种抑制梭菌属细菌的致病性或毒力的方法，所述方法包含体外、离体或体内使所述细菌的环境暴露于吸附剂。这种方法可以用于实验室或任何环境中，特别是体内，来控制梭菌属细菌的毒力。这种方法还可以用于哺乳动物体内来避免梭菌相关疾病。
在一个特定实施方式中，在艰难梭菌爆发期间向受试者预防性地施用吸附剂来防止疾病传播，并且如果受试者受到爆发影响，即感染梭菌，则降低CDAD的负担或严重性或发病率或死亡率。
在另一个特定实施方式中，在艰难梭菌感染发作后向受试者施用吸附剂来防止患者环境中的孢子形成和孢子脱落，从而降低患者环境中进一步感染的风险并且防止在保健机构(包括医院、疗养院等)或任何其他生活环境中爆发。
在另一个实施方式中，向受试者施用吸附剂以便降低艰难梭菌感染的严重性。
在另一个实施方式中，向受试者施用吸附剂以便加速艰难梭菌感染后患者的恢复。
在另一个实施方式中，向受试者施用吸附剂以防止艰难梭菌感染复发，即在上一次艰难梭菌感染发作结束后最多90天的时间内发生由相同或另一种菌株引起的新的艰难梭菌感染发作。
本发明还可以用于在艰难梭菌爆发期间和/或之后，例如在保健机构中治疗受试者，来防止孢子形成和孢子脱落并且降低所述爆发的总体严重性。
本发明还可以用于在艰难梭菌感染后治疗受试者以便通过削弱艰难梭菌的致病性来加快恢复并且降低复发的机会。
本发明还特别适用于治疗具有感染艰难梭菌风险的受试者，例如与CDAD患者接触的医疗护理人员，或感染CDAD和/或被梭菌感染的患者的家庭成员。
本发明还可以适当地用于具有CDAD风险的患者，如服用抗生素的患者、50岁以上或优选地65岁以上或甚至更优选地75岁以上的患者、近期有住院史的患者，来防止CDAD发生，或在尽管用本发明初步治疗但仍将发作一次时降低CDAD发作的严重性。
本发明还可以用于具有高CDAD风险的患者，诸如在新抗生素治疗、新近住院或新免疫抑制治疗前数年以前曾有过CDAD发作的患者。
本发明还可以用于已经被梭菌、特别是艰难梭菌定殖的患者，以防止CDAD的任何发作并且降低所述细菌的致病性。
本发明的其他方面和优点将在以下说明性实验部分中公开。
实施例
实施例1：活性炭延缓并且抑制BHI肉汤中艰难梭菌的孢子形成和毒素产生
将5mL BHI(脑心浸液)肉汤与或不与活性炭(浓度为0.05g/mL的来源于植物的药用级活性炭)一起培育2小时，而将5mL BHI肉汤在没有活性炭制剂的情况下培育2小时。将每个样品的一半离心并且用0.22μm过滤器过滤，而另一半不进行离心和过滤。离心/用0.22μm过滤器过滤去除了与活性炭一起培育的样品中的活性炭。
下表总结了4个条件：
-在“对照”组中，培养BHI肉汤未进行处理。
-在“离心对照”组中，仅对培养肉汤离心/过滤。
-在“活性炭”组中，将培养肉汤与活性炭一起培育2小时并且活性炭仍存在于样品中。
-在“活性炭离心”肉汤中，将培养肉汤与活性炭一起培育2小时并且通过离心/过滤从样品中去除活性炭。
接着，在艰难梭菌接种之前，将所有肉汤都预还原过夜来去除溶解氧并且提供厌氧培养条件。
使艰难梭菌在CCEYL琼脂或Columbia血琼脂上厌氧生长48小时。将来自平板的生长物接种到如上所述处理的预还原肉汤中，并且在37℃下厌氧培育。48小时后，将1mL等分试样离心并且取出上清液进行毒素测试。此外，取等分试样(500μL)用于营养细菌和孢子计数。72小时后，再取等分试样用于孢子形成分析。通过接种CCEYL琼脂和相位显微术在48和72小时计数营养细菌和孢子群。
如下进行毒素测试。用PBS稀释(10倍连续稀释)测试用样品。将纯样品(即培养物上清液)和稀释的样品一式两份添加到Vero细胞单层中。作用的特异性通过用索氏梭菌抗毒素中和来确定。将BHI肉汤中艰难梭菌核糖型027的培养物上清液用作阳性技术对照(毒素滴度约4RU)。48小时后，通过显微术确定细胞圆整。在80％单层中观察到圆整被认为是阳性的。阳性纯样品的滴度为1，阳性1:10稀释样品的滴度为2，依此类推。将样品重复添加到2个单独的单层上(技术重复)。
如下进行琼脂计数。将样品用蛋白胨水(进行和不进行醇休克)稀释(10倍连续稀释)，并且在Brazier CCEYL琼脂上计数艰难梭菌总数和孢子数(醇休克后)。将每种稀释液(20μL)涂在四分之一琼脂平板上并且在48小时后进行菌落计数(每个稀释度20-100cfu)。
如下进行相位显微术。将70μL培养液置于显微术载玻片上，并且在50℃下热固定。用70μL熔融的Wilkins-Chalgren琼脂和盖玻片覆盖样品。琼脂干燥后，测定相界明亮孢子(phase bright spore)、相界黑暗孢子(phase dark spore)和营养细菌的百分比(一式三份从至少3个不同视野计数的100个实体)。
对于3种称为核糖型001、027和078的艰难梭菌菌株，重复上述过程。
图1显示在如上所解释用活性炭处理或不用活性炭处理的BHI肉汤中培养48h后艰难梭菌和孢子的计数。图1还呈现了培养48h后每个样品中的毒素滴度。
图1显示用活性炭处理BHI肉汤有效地抑制艰难梭菌的致病性。更具体地，在用活性炭预处理肉汤的两个组中，观察到孢子计数大幅减少至少1个对数单位(即减少>90％)。此外，在用活性炭预处理肉汤的两个组中，早在处理后48小时后就测量到毒素滴度非常明显地降低(具有超过2个单位的差异，即至少100倍)。值得注意的是，在活性炭离心组中也观察到了这种效果，在该组中，仅在接种艰难梭菌之前使肉汤短暂地暴露于活性炭。这些结果显示，使培养基暴露于活性炭延缓或抑制了艰难梭菌的孢子形成以及毒素产生和释放，证实了艰难梭菌毒力的非常明显的损失。
实施例2：活性炭延缓和抑制粪便浆液肉汤中艰难梭菌的孢子形成和毒素产生
如以下文献所述，用预还原的肠道模型肉汤制备来自健康供体的汇集的粪便的10％浆液：Freeman,J.,O'Neill,F.J.,and Wilcox,M.H.头孢噻肟和去乙酰基头孢噻肟对人肠道三级恒化模型中艰难梭菌增殖和毒素产生的影响(Effects of cefotaxime and desacetylcefotaxime upon Clostridium difficile proliferation and toxin production in a triple-stage chemostat model of the human gut).Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2003；52:96-102。
将5mL这种粪便浆液肉汤与或不与活性炭(浓度为0.05g/mL的来源于植物的药用级活性炭)一起培育2小时。将每个样品的一半离心并且用0.22μm过滤器过滤，而另一半不进行离心和过滤。离心/用0.22μm过滤器过滤去除了与活性炭一起培育的样品中的活性炭。
下表总结了4个条件：
-在“对照”组中，培养粪便浆液肉汤未进行处理。
-在“离心对照”组中，仅对培养肉汤离心/过滤。
-在“活性炭”组中，将培养肉汤与活性炭一起培育2小时并且活性炭仍存在于样品中。
-在“活性炭离心”肉汤中，将培养肉汤与活性炭一起培育2小时并且通过离心/过滤从样品中去除活性炭。
用实施例1中提供的做法进行实验。
图2显示在如上所述用活性炭处理或不用活性炭处理的粪便浆液肉汤中培养48h后艰难梭菌和孢子的计数。图2还呈现了培养48h后每个样品中的毒素滴度。
图2显示用活性炭处理粪便浆液肉汤有效地抑制艰难梭菌的致病性。更具体地，在用活性炭预处理粪便浆液肉汤的两个组中，观察到培养48h后孢子计数大幅减少至少2个对数单位(即减少>99％)。此外，在用活性炭预处理粪便浆液肉汤的两个组中，早在处理后48小时后就测量到毒素滴度非常明显地降低(具有超过1个单位的差异，即至少10倍)。值得注意的是，在活性炭离心组中也观察到了这种效果，在该组中，仅在接种艰难梭菌之前使粪便浆液肉汤短暂地暴露于活性炭。这些结果显示，使粪便浆液肉汤暴露于活性炭延缓或抑制了艰难梭菌的孢子形成以及毒素产生和释放，证实了艰难梭菌毒力的非常明显的损失。
实施例3：活性炭延缓或抑制肠道模型肉汤中艰难梭菌的孢子形成和毒素产生
将5mL预还原的肠道模型肉汤(GM肉汤)(Freeman,J.,O'Neill,F.J.和Wilcox,M.H.头孢噻肟和去乙酰基头孢噻肟对人肠道三级恒化模型中艰难梭菌增殖和毒素产生的影响(Effects of cefotaxime and desacetylcefotaxime upon Clostridium difficile proliferation and toxin production in a triple-stage chemostat model of the human gut).Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2003；52:96-102.)与或不与活性炭(浓度为0.05g/mL的来源于植物的药用级活性炭)一起培育2小时。将每个样品的一半离心并且用0.22μm过滤器过滤，而另一半不进行离心和过滤。离心/用0.22μm过滤器过滤去除了与活性炭一起培育的样品中的活性炭。
下表总结了4个条件：
-在“对照”组中，培养GM肉汤未进行处理。
-在“离心对照”组中，仅对培养肉汤离心/过滤。
-在“活性炭”组中，将培养肉汤与活性炭一起培育2小时并且活性炭仍存在于样品中。
-在“活性炭离心”肉汤中，将培养肉汤与活性炭一起培育2小时并且通过离心/过滤从样品中去除活性炭。
用实施例1中提供的做法进行实验。
图3显示在如上所述用活性炭处理或不用活性炭处理的肠道模型肉汤中培养48h后艰难梭菌和孢子的计数。图3还呈现了培养48h后每个样品中的毒素滴度。
图3显示用活性炭处理有效地抑制艰难梭菌的致病性。更具体地，在用活性炭预处理GM肉汤的两个组中，观察到孢子计数大幅减少至少1个对数单位(即减少>90％)。此外，在用活性炭预处理GM的两个组中，在培养48h后测量到毒素滴度非常明显地降低(具有超过2个单位的差异，即至少100倍)。值得注意的是，在活性炭离心组中也观察到了这种效果，在该组中，仅在接种艰难梭菌之前短暂地暴露于活性炭。这些结果显示，使GM暴露于活性炭延缓或抑制了艰难梭菌的孢子形成以及毒素产生和释放，证实了艰难梭菌毒力的非常明显的损失。
实施例4：活性炭延缓或抑制BHI肉汤中3种不同的艰难梭菌菌株的毒素产生
制备并预还原BHI培养基的等分试样。将活性炭(浓度为0.05g/mL的来源于植物的药用级活性炭)在不同时间点添加到生长培养基中：艰难梭菌接种前3小时；艰难梭菌接种的同时；或接种后3、6小时。接着在艰难梭菌接种后6、24和48小时测量毒素滴度。在对照组的生长培养基中未培育无活性炭。
用实施例1中提供的做法进行生长、接种和毒素滴度的测量。
图4、5和6显示用活性炭处理有效抑制了艰难梭菌的致病性。更具体地，用活性炭处理肉汤的所有组都显示毒素滴度大幅降低至少1个单位并且毒素滴度差异最多为4个单位。
这些数据显示，将环境预先暴露于活性炭有效地防止了梭菌属细菌的定殖或毒力。具体地，当培养基在接种细菌前3小时暴露于活性炭时，甚至在接种后48小时在培养基中都基本上没有检测到毒素，显示使接种的细菌不具有致病性。
类似地，当培养基在接种细菌的同时或在之后前6小时暴露于活性炭时，甚至在接种后48小时在培养基中都基本上没有检测到毒素。这些结果还证实活性炭可以有效地治疗梭菌相关疾病。
实施例5：活性炭延缓或抑制BHI肉汤中3种不同的艰难梭菌菌株的孢子萌发
将8mL BHI肉汤与或不与活性炭(浓度为0.05g/mL的来源于植物的药用级活性炭)一起培育2小时(AC离心组)，而将8mL BHI肉汤在没有活性炭制剂的情况下培育2小时(对照组)。接着将与活性炭一起培育的样品离心并且用0.22μm过滤器过滤。离心/用0.22μm过滤器过滤去除了与活性炭一起培育的样品中的活性炭。
将艰难梭菌孢子制剂(约107CFU/mL)接种到每个等分试样中，并且在37℃下厌氧培育。在24和48小时，取500μL样品，并且通过琼脂和相位显微术计数营养细菌和孢子。用实施例1中所提供的做法进行琼脂和相位显微术计数。
图7显示培养24h和48h后艰难梭菌孢子的生理状态。相界明亮细胞(phase bright cell)对应于尚未萌发的孢子。相界黑暗细胞(phase dark cell)对应于萌发期间的孢子。营养细胞对应于孢子萌发后的成熟细菌。
如图7所示，在接种孢子后24h和48h，3种艰难梭菌菌株在用活性炭处理肉汤的组中的营养细胞的数目较少。因此，在接种之前用活性炭处理肉汤的组中，处于相界明亮状态的细菌群(即尚未萌发的孢子)的比例较高。
这些数据显示，将环境预先暴露于活性炭有效地延缓了梭菌属细菌的孢子萌发。