中空多孔微球的制造方法与流程

本发明涉及制造可传递至皮肤组织之类的生物体组织内的组织工程学用支架(scaffold)的方法。

背景技术：

在以美容手术为目的而销售的美容手术用医疗器械中，填充剂(filler)以向皱纹以及凹陷部位皮肤组织进行注入的方式使用。大部分的填充剂以注入到皮肤组织中并通过该物质本身的体积而增大皮肤组织的体积的方式来改善皮肤皱纹或凹陷部位。作为目前使用最多的填充剂，有透明质酸和胶原蛋白等凝胶形态的无固定形状物质，但随着时间的推移吸收到皮肤组织内而存在其美容手术效果不会长期保持的问题。

另外，作为美容手术用医疗器械，为了具有较宽的使用范围，需要通过注射来传递，但作为现有开发的填充剂成分的多孔材料具有大小为几十㎜以上而不可能通过注射移植到皮肤组织中，只能通过切开皮肤组织的手术移植到皮肤组织内的缺点。

作为现有的上述多孔材料制造方法，有如下技术：作为用于在疏水性生物降解高分子微球中形成孔隙的致孔剂(porogen)，适用如藻酸盐(alginate)、胶原蛋白(collagen)、明胶(gelatin)之类的水溶性高分子物质而形成O/W(水包油(Oil in Water))、W/O(油包水(Water in Oil))、W/O/W(水包油包水(Water in Oil in Water))、或O/W/O(油包水包油(Oil in Water in Oil))之类的多重乳液(multi emulsion)的技术。但是作为上述O/W形态的工序，难以形成具有大气孔的微球。在W/O、W/O/W以及O/W/O形态的工序的情况下，需要双重乳化工序，并且同时需要用于稳定双重乳化的内部相稳定剂和外部相稳定剂。另外，由于制造的微粒的比重比水重，因此存在为了获得沉淀的微粒而另外需要过滤工序的缺点。另外，由于制造工序复杂、抑制因素较多而通过分批反应工序完成制造，因此存在生产效率降低，形成在微球中的孔隙的均匀性低，工序中损失率高而工业应用困难的问题。

现有技术文献

专利文献

韩国公开专利公报第2011-0075618号

技术实现要素：

本发明的目的在于提供制造可传递至皮肤组织之类的生物体组织内的组织工程学用支架的方法。具体而言，提供工序简单且能够容易地调节多孔微球的孔隙率以及孔隙的形态，通过注射可以注入到皮肤组织内，在上述多孔微球内使细胞增殖而能够使皮肤组织的体积增大的多孔微球的制造方法。

为了解决如上所述的目的，本发明的一观点为提供一种中空多孔微球的制造方法，其中，包括以下步骤：

高分子溶液的制造步骤，其中包括：将气孔形成诱导物质和疏水性生物降解高分子溶解于挥发性溶剂；

将上述高分子溶液分散于水或包含相稳定剂的水溶液中而形成O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)的步骤；

中空多孔微球的制造步骤，其中包括：在分散有上述高分子溶液的水溶液相中使挥发性溶剂挥发而固化上述疏水性生物降解高分子，发生疏水性生物降解高分子与上述气孔形成诱导物质之间的自发性相分离，使上述O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)中包含的油相高分子溶液变换为O/S(固包油(Oil in Solid))微球；以及

去除上述中空多孔微球所包含的气孔形成诱导物质的步骤。

本发明的制造方法由于多孔微球所包含的疏水性生物降解高分子与气孔形成诱导物质之间的自发性相分离而将O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)中包含的油相高分子溶液容易地体现为O/S(固包油(Oil in Solid))微球形态的结构，能够在不需要添加制造双重乳化形态的微球时所需的内部相稳定剂的情况下进行制造，因此不需要考虑由此带来的去除内部相稳定剂的洗涤工序。因此，与现有的使用亲水性气孔形成诱导物质分别通过1次以及2次乳化工序并以W/O/W或O/W/O的方式制造的技术相比，能够简化生产工序。

本发明能够容易地调节微球内孔隙率以及孔隙的形态和大小，从而能够制造微球内皮肤组织细胞可增殖的中空以及包围该中空的分隔壁所包含的微细气孔，气孔均匀度优异。

如上所述，根据上述本发明的制造方法，中空多孔微球具有包含形成在粒子内中央的巨大空洞和含有微细气孔的分隔壁的双重结构，因此生物体内皮肤组织细胞可以利用作为通道的上述微细气孔而容易地移动到上述中空多孔微球中，在上述巨大空洞内上述移动的皮肤组织细胞可以有效地增殖。

附图说明

图1是根据本发明的一实施例制造中空多孔微球的方法的概略图。

图2是表示制造根据本发明的一实施例的中空多孔微球时根据致孔剂的种类和含量的粒子表面和切片的电子扫描显微镜照片的图。

图3是表示根据本发明的一实施例的中空多孔微球中培养成纤维细胞的活/死(Live/dead)染色共聚焦显微镜照片的图。

图4是在根据本发明的一实施例的中空多孔微球中培养成纤维细胞后通过MTT检测示出细胞生长率的图。

具体实施方式

本说明书中，“平均直径”是指将连接对象的横截面的两端的线段即直径进行平均的值，例如在本发明的空洞的情况下，可以指当形成在中空多孔微球内的空洞为非球形时上述空洞自身具有的直径的平均值。或者还可以指存在于多个微球内的各个空洞的直径的平均值。在微细气孔的情况下，当微细气孔自身为非球形时可以指上述微细气孔自身具有的直径的平均值或多个微细气孔的直径的平均值。

下面，对本发明详细地进行说明。

本发明提供一种中空多孔微球的制造方法，其中，包括以下步骤：高分子溶液的制造步骤，其中包括将气孔形成诱导物质和疏水性生物降解高分子溶解于挥发性溶剂；将上述高分子溶液分散于水或包含相稳定剂(phase stabilizer)的水溶液中而形成O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)的步骤；中空多孔微球的制造步骤，其中包括：在分散有上述高分子溶液的水溶液相中使挥发性溶剂挥发而固化上述疏水性生物降解高分子，发生疏水性生物降解高分子与上述气孔形成诱导物质之间的自发性相分离，使上述O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)中包含的油相高分子溶液变换为O/S(固包油(Oil in Solid))微球；以及去除上述中空多孔微球所包含的气孔形成诱导物质的步骤。

在作为用于制造现有多孔微球的技术而适用的多重乳液形成技术即在多重乳化技术中，需要将包含疏水性生物降解高分子的油相作为连续相，将含有用于形成孔隙的气孔形成诱导物质的水相作为不连续相而适用，从而形成1次乳液。这时，为了使制造的1次乳液内不连续相的大小和分布均匀，需要持续的搅拌和温度调节。但是，根据本发明的一实施例，疏水性生物降解高分子和孔隙及气孔形成诱导物质溶解于相同的溶剂中，因此在不需要另外的操作的情况下能够确保组成均匀性和组成稳定性。

另外，虽然在现有多重乳液形成技术中，在形成2次乳液后，可以实现用于维持2次乳液内不连续相的大小和形态均匀性的搅拌和保持温度，但存在如下问题，即没有可以对形成在2次乳液内的不连续相内不连续相即包含水溶性高分子之类的气孔形成诱导物质的水溶液的大小和分布进行控制直至疏水性生物降解高分子固化而稳定为止的方法。相反，根据本发明的一实施例，由于作为气孔形成诱导物质使用与疏水性生物降解高分子不具有相溶性且密度小于水的疏水性流体，因此当去除高分子溶液内的挥发性溶剂时疏水性生物降解高分子被固化，与疏水性生物降解高分子不具有相溶性的具有疏水性且液态的气孔形成诱导物质自然地相分离而在由疏水性生物降解高分子构成的微球内形成孔隙。因此，在不需要另外的操作的情况下在疏水性生物降解高分子固化前保持溶液相，因此能够确保组成均匀性，当疏水性生物降解高分子固化时，根据疏水性生物降解高分子具有的强度能够确保孔隙均匀性和稳定性。

作为一实施例，上述气孔形成诱导物质可以包含与疏水性生物降解高分子不具有相溶性且密度小于水的疏水性流体。上述气孔形成诱导物质还可以称为致孔剂(porogen)。上述气孔形成诱导物质只要是与疏水性生物降解高分子不具有相溶性且密度小于水的疏水性流体，则没有限定，均可以包含。具体而言，上述气孔形成诱导物质可以为在1atm、250℃以下具有沸点的物质，还可以为在1atm、30至150℃为液相的物质。例如，上述气孔形成诱导物质可以为选自烷烃(alkane)类、植物性油以及它们的混合物中的一种以上。作为一实施例，上述烷烃类为选自辛烷(Octane)、十一烷(Undecane)、十三烷(Tridecane)、十五烷(Pentadecane)以及它们的混合物中的一种以上，上述植物性油可以包含选自豆油、玉米油、棉籽油、橄榄油、葡萄籽油、核桃油、芝麻油、苏籽油以及它们的混合物中的一种以上。本发明除了上述具体的物质以外，还可以适用其他物质形成气孔，作为一实施例，本发明在制造上述中空多孔微球时，可以根据形成气孔的致孔剂的浓度以及种类对中空以及微细气孔的大小和形态进行调节，还可以增加气孔均匀度。例如，上述气孔形成诱导物质相对于高分子溶液总重量，可以包含0.1至50重量％，更具体而言，可以包含1至10重量％。

另外，根据本发明的一实施例的上述疏水性生物降解高分子可以包含选自聚乳酸(Poly-L-Lactic Acid,PLLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚ε-己内酯(Polycaprolactone,PCL)、聚酐(polyanhydrides)、聚原酸酯(polyorthoester)、聚乙烯醇(polyviniyalcohol)、聚乙二醇(polyethyleneglycol)、聚氨基甲酸酯(polyurethane)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚-N-异丙基丙烯酰胺(Poly-N-isopropyl acrylamide)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)共聚物(poly ethylene oxide)-poly propylene oxide-poly ethylene oxide copolymer)、它们的共聚物以及它们的混合物中的一种以上，但只要是被注入到皮肤组织内时安全且可分解的物质，则没有限定，均可以包含。

使根据本发明的一实施例的上述O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)中包含的油相高分子溶液变换为O/S(固包油(Oil in Solid))微球的步骤可以包括以下步骤：将上述水或包含相稳定剂(phase stabilizer)的水溶液作为连续相(continuous phase)，将上述高分子溶液作为不连续相(discontinuous phase)向上述水或包含相稳定剂的水溶液供给。这时，上述包含相稳定剂的水溶液为包含使界面稳定化的物质的水溶液，例如是溶解有选自聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pirr olidone)、聚乙二醇-co-聚丙二醇(polyethylene glycol-co-polyproplene glyc ol)、聚乙二醇-co-聚丙二醇-co-聚乙二醇(polyethylene glycol-co-polyprople ne glycol-co-polyethylene glycol)、聚乙二醇-co-聚乳酸(polyethylene glyc ol-co-polylactic acid)以及聚乙二醇-co-聚乳酸-co-聚乙二醇(polyethylene g lycol-co-polylactic acid-co-polyethylene glycol)等中的一种以上的相稳定剂的水溶液。

具体而言，将上述高分子溶液分散于水或包含相稳定剂的水溶液中的步骤可以包括以下步骤：作为一实施例，在微流体装置中将上述水或包含相稳定剂的水溶液作为连续相，向上述水或包含相稳定剂的水溶液供给上述高分子溶液作为不连续相。这时，上述步骤还可以包括以下步骤：对向输送上述连续相的微细导管内供给上述高分子溶液作为不连续相的速度进行调节，从而对中空多孔微球的粒子以及如中空和微细气孔之类的气孔中的一种以上的大小和形态进行调节。

或者，使根据本发明的一实施例的上述O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)中包含的油相高分子溶液变换为O/S(固包油(Oil in Solid))微球的步骤可以包括以下步骤：在膜(membrane)乳化装置中将上述水溶性溶液作为连续相，向上述水或包含相稳定剂的水溶液供给上述高分子溶液作为不连续相。代替在微流体装置中使用的微细导管，通过孔隙的大小固定的膜(membrane)将不连续相向连续相流动的导管进行输送，这时，上述步骤还可以包括以下步骤：对形成在上述膜乳化装置的膜上的孔隙大小进行调节，从而对中空多孔微球的粒子以及如中空和微细气孔之类的气孔中的一种以上的大小和形态进行调节。

当利用上述微流体装置或膜乳化装置时，可以对制造微球时微球的大小和形态、中空以及气孔的粒度分布进行控制。

作为一实施例，形成在上述中空多孔微球的中央的空洞可以具有5至150μm的平均直径。当上述空洞的直径不足5μm时细胞的生长困难，当超过150μm时微球的强度特别弱而在注入到生物体内时可能会被破坏。具体而言，上述空洞的平均直径可以为5μm以上、10μm以上、13μm以上、15μm以上、17μm以上、20μm以上、23μm以上、25μm以上、27μm以上、30μm以上、33μm以上、35μm以上、37μm以上、40μm以上、43μm以上、45μm以上、48μm以上、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、100μm以上、110μm以上、120μm以上、130μm以上、140μm以上或150μm。另外，上述空洞的平均直径可以为150μm以下、140μm以下、130μm以下、120μm以下、110μm以下、100μm以下、90μm以下、80μm以下、70μm以下、60μm以下、50μm以下、47μm以下、45μm以下、43μm以下、40μm以下、37μm以下、35μm以下、33μm以下、30μm以下、28μm以下、25μm以下、23μm以下、20μm以下、18μm以下、15μm以下、13μm以下、10μm以下或5μm，只要是可以实现皮肤组织细胞的增殖的大小，则不限于上述大小，均可以包含。

作为一实施例，根据本发明的组合物所包含的上述中空多孔微球的粒子可以具有50至200μm的平均直径，但只要可以通过注射注入到皮肤组织内，并且可以实现皮肤组织细胞的增殖，则并不限定于上述范围，均可以包含。上述中空多孔微球通过具有如上所述范围的小的粒子大小，从而可以通过具有300μm以下的内径的注射针对皮肤组织内进行给药，由此可以解决现有的多孔材料由于大的粒子大小而需要切开皮肤组织进行移植的缺点。当上述中空多孔微球的直径不足50μm时，皮肤组织细胞的增殖困难，当超过200μm时利用注射针的手术不容易进行。具体而言，上述中空多孔微球粒子的平均直径可以为50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、100μm以上、110μm以上、120μm以上、130μm以上、140μm以上、150μm以上、160μm以上、170μm以上、180μm以上、190μm以上或200μm。另外，上述中空多孔微球粒子的平均直径可以为200μm以下、190μm以下、180μm以下、170μm以下、160μm以下、150μm以下、140μm以下、130μm以下、120μm以下、110μm以下、100μm以下、90μm以下、80μm以下、70μm以下、60μm以下或50μm。

作为一实施例，上述中空多孔微球的空洞的体积相对于上述中空多孔微球全部体积可以为20至80体积％。当不足上述20体积％时，皮肤组织细胞增殖的空间不充分，当超过80体积％时，分隔壁的厚度变得过薄，因此可能会无法保持微球的形态而坍塌。作为一实施例，上述分隔壁的厚度可以为上述中空多孔微球全部直径的1/5至1/2。

具体而言，包含在上述中空多孔微球的分隔壁的微细气孔作为一实施例可以具有5至50μm的平均直径。当不足上述5μm时，将上述中空多孔微球注入到皮下组织时，皮肤组织细胞无法移动到微球内部，当超过上述50μm时分隔壁内气孔所占的体积增加而难以保持微球的形态。

例如，上述中空多孔微球的优选的孔隙率可以为平均20至80％。

在根据本发明的一实施例的制造方法中，去除上述多孔微球所包含的气孔形成诱导物质的步骤作为一实施例可以包括用水洗涤上述微球后冷冻干燥而去除气孔形成诱导物质的步骤。上述冷冻干燥可以为真空干燥。本发明中使用的上述的气孔形成诱导物质在1atm、30至150℃保持液相，在1atm、250℃以下具有沸点，在本发明的利用疏水性生物降解高分子的多孔微球制造工序中不会挥发或蒸发而在多孔微球内以充满孔隙的状态残留。因此，如上所述，直至通过冷冻干燥去除气孔形成诱导物质之前，在多孔微球内保持形成孔隙的气孔形成诱导物质而可以使孔隙稳定性极大化。

根据本发明的一实施例用上述的制造方法制造的上述制造的中空多孔微球可以包含形成在中央的空洞、以及包围上述空洞的包含微细气孔的分隔壁。另外，本发明的一实施例可以提供包含中空多孔微球的皮肤组织再生或皮肤组织体积增大注射用组合物。将上述根据本发明的一实施例的中空多孔微球包含在注射用组合物中而注入到皮肤组织内时，生物体内皮肤组织细胞通过上述微细气孔向上述中空多孔微球内移动，在中央的空洞中上述移动的皮肤组织细胞增殖而使皮肤组织再生或使体积增大。即，存在于生物体组织内的细胞渗透到上述中空多孔微球内，生长分裂而能够形成新的生物体组织。通过对根据本发明的一实施例的上述孔隙以及气孔形成诱导物质与疏水性生物降解高分子的混合比进行调节，从而能够自由地调节形成于微球中央的空洞的大小和形态以及分隔壁的微细气孔的大小和形态，从而能够赋予存在于上述中空多孔微球外部的成纤维细胞、脂肪细胞等渗透到多孔微球内后可生长分裂的空间。

另外，根据本发明，在经过一定时间后，上述中空多孔微球在皮肤内生物降解后，上述新增殖的皮肤组织细胞保持其体积，因此可以增大皮肤皱纹或皮肤凹陷部位等的皮肤组织体积增大效果，并且可以安全长久地维持其效果。因此，本发明为制造能够传递至皮肤组织之类的生物体组织内的组织工程学用支架的技术，根据上述本发明制造的中空多孔微球通过皮肤组织再生可以适用于皮肤皱纹或凹陷部位的改善以及骨组织的再生之类的医药产业。更具体而言，本发明的上述中空多孔微球可以出于包含皮肤皱纹的老化改善、肤色改善或皮肤弹力改善用填充剂(filler)或提升(lifting)等目的而使用，但只要是通过皮肤的组织再生，则没有限定，均可以包含。例如，可以用于人造皮肤、人造软骨、骨填充物、整形假体等。

下面，通过实施例对本发明更详细地进行说明。这些实施例只是用于例示本发明，本发明的范围不应被解释为限定于这些实施例对于本领域技术人员来说是显而易见的。

[实施例1]中空多孔微球的制造1

通过下述方法制造了根据本发明一实施例的中空多孔微球(参照图1)。

步骤1：微流体装置(simple fluidic device)的制作

在PVC管中放入弯曲成90°的30号注射针，在注射针与PVC管之间插入微细玻璃管而制作了微流体装置。制作的微流体装置利用环氧粘合剂堵上了微细的缝隙。

步骤2：含有烷烃类的PLLA溶液的制造

将0.1g的作为疏水性生物降解高分子的PLLA(RESOMER LR 704S,Evonik Industries AG)、10g的作为挥发性溶剂的二氯甲烷(Dichloromethane；34355-0350,Junsei)、作为气孔形成诱导物质的烷烃类物质，具体地为辛烷(Octane,412236,Sigma-aldrich)或十一烷(Undecane,U407,Sigma-aldrich)或十三烷(Tridecane,T57401,Sigma-aldrich)或十五烷(Pentadecane,76510,Sigma-aldrich)各0.1g、0.3g以及0.6g进行混合，从而制造了疏水性生物降解高分子(PLLA)溶液。

步骤3：制造均匀的PLLA乳液

将在上述步骤2中得到的PLLA溶液利用微流体装置，将2％PVA溶液作为连续相(continuous phase)，将其流速设为每分钟1.5ml，将含有烷烃类的PLLA溶液作为不连续相(discontinuous phase)，利用30号注射针，将流速设为每分钟0.1ml，从而形成一定大小的乳液。

步骤4：均匀的中空多孔微球的制造

将在上述步骤3中得到的乳液分散于2％PVA收集相(collection phase)中，以150rpm搅拌后，使二氯甲烷充分挥发。

步骤5：去除气孔形成诱导物质而赋予多孔

将在上述步骤4中得到的PLLA珠用蒸馏水(D.W.)洗涤数次后，利用冷冻干燥机使烷烃类升华，从而制造了作为均匀的大小的中空多孔微球的多孔PLLA珠。

将上述制造的各个中空多孔微球示于图2。可以确认随着气孔形成诱导物质的含量增加，或者随着碳链的长度变长，能够在微球中央更有效地制造空洞。

[实施例2]中空多孔微球的制造2

通过下述方法制造了根据本发明的一实施例的中空多孔微球。

步骤1：微流体装置(simple fluidic device)的制作

在PVC管中放入弯曲成90°的30号注射针，在注射针与PVC管之间插入微细玻璃管而制作了微流体装置。制作的微流体装置利用环氧粘合剂堵上了微细的缝隙。

步骤2：含有植物性油的PLLA溶液的制造

将0.1g的作为疏水性生物降解高分子的PLLA(RESOMER LR 704S,Evonik Industries AG)、10g的二氯甲烷(34355-0350,Junsei)、作为气孔形成诱导物质的棉籽油或豆油各0.5g进行混合，从而制造了疏水性生物降解高分子(PLLA)溶液。

步骤3：制造均匀的PLLA乳液

将在上述步骤2中得到的PLLA溶液利用微流体装置，将2％PVA溶液作为连续相(continuous phase)，将其流速设为每分钟1.5ml，将含有植物性油的PLLA溶液作为不连续相(discontinuous phase)，利用30号注射针，将流速设为每分钟0.1ml，从而形成一定大小的乳液。

步骤4：均匀的PLLA珠的制造

将在上述步骤3中得到的乳液分散于2％PVA收集相(collection phase)中，以150rpm进行搅拌后，使二氯甲烷(Dichloromethane)充分挥发。

步骤5：去除内部气孔形成诱导物质而赋予多孔

将在上述步骤4中得到的PLLA珠用蒸馏水(D.W.)洗涤数次后，利用冷冻干燥机去除植物性油，从而制造了作为均匀的大小的中空多孔微球的多孔PLLA珠。

[试验例1]皮肤组织细胞的培养

如下进行用于比较根据本发明的一实施例的中空多孔微球的中空形成与否导致的细胞移动性和增殖效应的实验。

作为比较例，将不包含中空的多孔微球(小孔隙(small pores)：十三烷3wt％)和上述实施例1的包含中空的多孔微球(大孔隙(Large pores)：作为烷烃类包含6wt％的十三烷)分别在70％乙醇中进行灭菌处理后，用PBS充分洗涤，移植NIH3T3成纤维细胞，对细胞增殖举动进行了观察。将NIH3T3成纤维细胞以1×10³cells/mL浓度分散于培养基中，利用旋转瓶(spinner flask)搅拌6小时后，将多孔粒子移到培养容器(culture Plate)中进行培养。在细胞培养第1、3、7、10日，将上述培养的各个多孔微球粒子进行LIVE/DEAD染色后，通过共聚焦显微镜和MTT检测对细胞附着以及有无增殖进行了确认。如图3和图4所示，可以确认包含中空的中空多孔微球(大孔隙)与不包含中空而只包含微细气孔的多孔微球(小孔隙)相比，NIH3T3成纤维细胞向内部气孔的渗透及增殖良好地进行至第10天。这表示包含在多孔微球内的中空对细胞渗透及增殖有大的效果。

本发明作为一实施例可以提供如下的实施方式。

第1实施方式可以提供一种中空多孔微球的制造方法，其中，包括以下步骤：高分子溶液的制造步骤，其中包括：将气孔形成诱导物质和疏水性生物降解高分子溶解于挥发性溶剂；将上述高分子溶液分散于水或包含相稳定剂的水溶液中而形成O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)的步骤；中空多孔微球的制造步骤，其中包括：在分散有上述高分子溶液的水溶液相中使挥发性溶剂挥发而固化上述疏水性生物降解高分子，发生疏水性生物降解高分子与上述气孔形成诱导物质之间的自发性相分离，使O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)中包含的油相高分子溶液变换为O/S(固包油(Oil in Solid))微球；以及去除上述中空多孔微球所包含的气孔形成诱导物质的步骤。

第2实施方式可以提供根据第1实施方式所述的中空多孔微球的制造方法，其中，上述气孔形成诱导物质为与疏水性生物降解高分子不具有相溶性且密度小于水的疏水性流体。

第3实施方式可以提供根据第1实施方式和第2实施方式中的任一项以上所述的中空多孔微球的制造方法，其中，上述气孔形成诱导物质为选自烷烃(alkane)类、植物性油以及它们的混合物中的一种以上。

第4实施方式可以提供根据第3实施方式所述的中空多孔微球的制造方法，其中，上述烷烃类为选自辛烷(Octane)、十一烷(Undecane)、十三烷(Tridecane)、十五烷(Pentadecane)以及它们的混合物中的一种以上，上述植物性油为选自豆油、玉米油、棉籽油、橄榄油、葡萄籽油、核桃油、芝麻油、苏籽油以及它们的混合物中的一种以上。

第5实施方式可以提供根据第1实施方式至第4实施方式中的任一项以上所述的中空多孔微球的制造方法，其中，将上述O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)中包含的油相高分子溶液变换为O/S(固包油(Oil in Solid))微球的步骤包括在微流体装置中将上述水或包含相稳定剂的水溶液作为连续相而向上述水或包含相稳定剂的水溶液供给上述高分子溶液作为不连续相的步骤。

第6实施方式可以提供根据第1实施方式至第5实施方式中的任一项以上所述的中空多孔微球的制造方法，其中，还包括对供给上述高分子溶液作为不连续相的供给速度进行调节而对中空多孔微球的粒子和气孔中的一种以上的大小和形态进行调节的步骤。

第7实施方式可以提供根据第1实施方式至第6实施方式中的任一项以上所述的中空多孔微球的制造方法，其中，将上述O/W(水包油(Oil in Water))形态的乳液(emulsion)中包含的油相高分子溶液变换为O/S(固包油(Oil in Solid))微球的步骤包括在膜乳化装置中将上述水或包含相稳定剂的水溶液作为连续相并向上述水或包含相稳定剂的水溶液供给上述高分子溶液作为不连续相的步骤。

第8实施方式可以提供根据第7实施方式所述的中空多孔微球的制造方法，其中，还包含对形成于上述膜乳化装置的膜的孔隙大小进行调节而对中空多孔微球的粒子和气孔中的一种以上的大小和形态进行调节的步骤。

第9实施方式可以提供根据第1实施方式至第8实施方式中的任一项以上所述的中空多孔微球的制造方法，其中，去除上述微球所包含的气孔形成诱导物质的步骤包括用水洗涤上述微球后进行冷冻干燥而去除气孔形成诱导物质的步骤。

第10实施方式可以提供根据第1实施方式至第9实施方式中的任一项以上所述的中空多孔微球的制造方法，其中，上述疏水性生物降解高分子为选自聚乳酸(Poly-L-Lactic Acid,PLLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚ε-己内酯(Polycaprolactone,PCL)、聚酐(polyanhydrides)、聚原酸酯(polyorth oester)、聚乙烯醇(polyviniyalcohol)、聚乙二醇(polyethyleneglycol)、聚氨基甲酸酯(polyurethane)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚-N-异丙基丙烯酰胺(Poly-N-isopropyl acrylamide)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)共聚物(poly ethylene oxide)-poly propylene oxide-poly ethylene oxide copolymer)、它们的共聚物以及它们的混合物中的一种以上。

第11实施方式可以提供根据第1实施方式至第10实施方式中的任一项以上所述的中空多孔微球的制造方法，其中，上述制造的中空多孔微球包含形成在中央的空洞、以及包围上述空洞的包含微细气孔的分隔壁。

第12实施方式可以提供一种皮肤组织再生或皮肤组织体积增大注射用组合物，其中，包含通过第1实施方式至第10实施方式中的任一项以上所述的制造方法制造的中空多孔微球。

上述实施方式只是为了说明本发明而公开的，上述说明并不限定本发明的范围。因此，在不超出本发明的意思和范围的前提下，本领域技术人员可以进行各种修改、变形、以及替换。