本公开涉及药物组合，包括细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂化合物、(b)丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂化合物，以及可任选的(c)α-同种型特异性磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂化合物，用于治疗或预防癌症。本公开还提供相关药物组合物、应用和治疗或预防癌症的方法。
背景技术：
肿瘤发展与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和其调节因子的遗传变异及失调紧密相关，表明CDK抑制剂可能是有用的抗癌疗法。事实上，早期结果表明转化细胞与正常细胞的差异在于其对例如细胞周期蛋白D/CDK4/6的需求，且可能开发出新型抗肿瘤药，其没有用常规细胞毒性和细胞抑制药物时所观察到一般宿主毒性。
CDK的功能是磷酸化某些蛋白并从而使其活化或失活，包括例如视网膜母细胞瘤蛋白、核纤层蛋白、组蛋白H1和有丝分裂纺锤体组分。CDK介导的催化步骤涉及从ATP到大分子酶底物的磷酸转移反应。已发现数组化合物(综述于例如Fischer,P.M.Curr.Opin.Drug Discovery Dev.2001,4,623-634)通过CDK特异性ATP拮抗作用而具有抗增殖性质。
在分子水平，调节CDK/细胞周期蛋白复合体活性需要一系列刺激性和抑制性的磷酸化或脱磷酸事件。CDK磷酸化通过一组CDK活化激酶(CAK)和/或如wee1、Myt1和Mik1的激酶进行。脱磷酸通过磷酸酶如Cdc25(a&c)、PP2A或KAP进行。
CDK/细胞周期蛋白复合体活性可进一步由2个家族的内源细胞蛋白质类抑制剂调节：Kip/Cip家族或INK家族。INK蛋白特异性结合CDK4和CDK6。p16ink4(也称为MTS1)是在大量原发性癌中突变或缺失的潜在肿瘤抑制基因。Kip/Cip家族包含蛋白如p21Cip1,Waf1、p27Kip1和p57kip2，其中p21由p53诱导且能使CDK2/细胞周期蛋白(E/A)复合体失活。在乳腺、结肠和前列腺癌中观察到非典型的低p27表达水平。相反，实体瘤中的细胞周期蛋白E过表达显示与较差的患者预后相关。细胞周期蛋白D1过表达与食管、乳腺、鳞状和非小细胞肺癌相关。
CDK和其相关蛋白在增殖细胞中协调和驱动细胞周期的关键作用已如上所概括。也已描述CDK在其中发挥关键作用的一些生化通路。因此，可能非常需要开发治疗增殖性疾病如癌症的单一疗法，其使用广泛靶向CDK或靶向特异CDK的疗法。由此，持续需要发现治疗人类疾病的新治疗剂。
通过生长因子受体和蛋白激酶的细胞信号转导是细胞生长、增殖和分化的重要调节物。在正常细胞生长中，生长因子(如PDGF或EGF和其它)通过受体活化来激活MAP激酶通路。参与正常和失控细胞生长的最重要且最了解的MAP激酶通路之一是Ras/Raf激酶通路。活性GTP结合Ras引起Raf激酶的活化和间接磷酸化。Raf随后磷酸化2个丝氨酸残基(就MEK1而言是S218和S222，以及就MEK2而言是S222和S226)上的MEK1和2(Ahn等,Methods in Enzymology 2001,332,417-431)。活化的MEK随后磷酸化其唯一的已知底物，即MAP激酶ERK1和ERK2。通过MEK的ERK磷酸化就ERK1而言发生在Y204和T202，就ERK2而言发生在Y185和T183(Ahn等,Methods in Enzymology 2001,332,417-431)。磷酸化的ERK二聚并接着易位至其积聚的核(Khokhlatchev等,Cell 1998,93,605-615)。在核中，ERK参与数种重要细胞功能，包括但不限于核转运、信号转导、DNA修复、核小体装配和易位以及mRNA加工和翻译(Ahn等,Molecular Cell 2000,6,1343-1354)。总之，用生长因子处理细胞可引起ERK1和2活化，这导致增殖以及一些情况中的分化(Lewis等,Adv.Cancer Res.1998,74,49-139)。
受体酪氨酸激酶(RTK)在多种蛋白(包括其自身)中催化某些酪氨酸氨基酸残基的磷酸化，控制细胞生长、增殖和分化。
数种RTK下游位于数个信号通路，其中有上面讨论的Ras-Raf-MEK-ERK激酶通路。目前了解，响应生长因子、激素、细胞因子等的Ras GTPase蛋白活化可刺激Raf激酶的磷酸化和激活。此信号通路也称为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路或胞质级联，能介导对生长信号的细胞反应。此信号通路的最终功能是将细胞膜处的受体活性与控制细胞增殖、分化和存活的胞质或核靶标修饰进行连接。
此通路的组成型活化足以诱导细胞转化。由异常受体酪氨酸激酶活化、Ras突变或Raf突变引起的MAP激酶通路失调激活经常见于人类癌症，并代表影响异常生长控制的主要因素。在人恶性肿瘤中，Ras突变较常见，在约30％癌症中得到确定。GTPase蛋白的Ras家族(该蛋白使鸟苷三磷酸转变为鸟苷二磷酸)从活化生长因子受体传递信号到下游胞内伴侣。由活性膜结合Ras招募的靶标中最突出的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的Raf家族。Raf家族由担当Ras下游效应的3个相关激酶(A-,B-和C-Raf)构成。上述Ras介导的Raf活化进而引发MEK1和MEK2(MAP/ERK激酶1和2)激活，其进而使酪氨酸-185和苏氨酸-183上的ERK1及ERK2(胞外信号调节激酶1和2)磷酸化。活化的ERK1和ERK2在核中转运和积聚，在该处其能磷酸化多种底物，包括控制细胞生长和存活的转录因子。鉴于Ras/Raf/MEK/ERK通路在人类癌症发展中的重要性，信号级联的激酶组分汇合作为潜在重要靶标以调节癌症和其它增殖性疾病的疾病发展。
已鉴定多种Ras GTPase和B-Raf激酶中的突变，其能引起MAPK通路的持续和组成型激活，最终导致细胞分裂和存活增加。由此，这些突变与广泛人类癌症的建立、发展和进展密切相关。
MEK1和MEK2是双特异性激酶(MEK1-7)大家族的成员，其使多种MAP激酶的苏氨酸和酪氨酸残基磷酸化。MEK1和MEK2由不同基因编码，但在C末端催化激酶结构域和大部分N末端调节区共有高同源性(80％)。在人类癌症中尚未发现MEK1和MEK2的致癌形式，但MEK组成型激活显示引起细胞转化。除了Raf，MEK也能由其它癌基因活化。迄今为止，MEK1和MEK2的唯一已知底物是ERK1和ERK2。除了磷酸化酪氨酸和苏氨酸残基的独特能力外，该不寻常的底物特异性在信号转导级联的关键点取代MEK1和MEK2，这使得其将许多胞外信号整合入MAPK通路。
因此，认识到MAPK激酶通路蛋白(如MEK)的抑制剂应具有抗增殖、促细胞凋亡和抗侵袭剂的价值，以用于控制和/或治疗增殖性或侵袭性疾病。此外，也已知具有MEK抑制活性的化合物能有效诱导ERK1/2活性抑制和细胞增殖抑制(The Journal of Biological Chemistry,第276卷,第4期第2686-2692页,2001)，预期化合物对由不需要的细胞增殖所导致的疾病显示效果，如肿瘤发生和/或癌症。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)包括脂质激酶家族，其催化磷酸转移至肌醇脂质的D-3'位以生成磷脂酰肌醇-3-磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，其通过使含普列克底物蛋白同源区、FYVE、Phox和其它磷脂结合域的蛋白停靠到通常位于质膜上的多种信号转导复合体内从而担当信号级联的第二信使(Vanhaesebroeck等,Annu.Rev.Biochem70:535(2001)；Katso等,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17:615(2001))。在2个1类PI3K中，1A类PI3K是由催化p110亚基(α,β,δ同种型)构成的异二聚体，该亚基组成型连接调节亚基，所述调节亚基可以是p85α、p55α、p50α、p85β或p55γ。1B类亚类有一个家族成员，即由催化p110γ亚基构成的异二聚体，该亚基与2个调节亚基p101或p84之一相连(Fruman等,Annu Rev.Biochem.67:481(1998)；Suire等,Curr.Biol.15:566(2005))。p85/55/50亚基的模块结构域包括Src同源(SH2)结构域，其使磷酸酪氨酸残基以特定顺序结合于活化的受体酪氨酸激酶和胞质酪氨酸激酶上，引起1A类PI3K的活化和定位。1B类PI3K通过G蛋白偶联受体直接活化，该受体结合肽与非肽配体的多样性库(Stephens等,Cell 89:105(1997)；Katso等,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17:615-675(2001))。因此，I类PI3K的所得磷脂产物连接具有下游细胞活性的上游受体，包括增殖、存活、趋化性、细胞运输、运动性、代谢、炎症和过敏反应、转录和翻译(Cantley等,Cell 64:281(1991)；Escobedo和Williams,Nature 335:85(1988)；Fantl等,Cell 69:413(1992))。
许多情况下，PIP2和PIP3招募Akt(病毒癌基因v-Akt的人同源物产物)至质膜，在该处其担当对生长和存活而言重要的许多胞内信号通路的节点(Fantl等,Cell 69:413-423(1992)；Bader等,Nature Rev.Cancer 5:921(2005)；Vivanco和Sawyer,Nature Rev.Cancer 2:489(2002))。PI3K异常调节通常经Akt活化增加存活，是人类癌症的最普遍事件之一，并显示在多个水平出现。使磷酸肌醇在肌醇环3'位脱磷酸并因而拮抗PI3K活性的肿瘤抑制基因PTEN，在很多肿瘤中功能性缺失。其它肿瘤中，扩增p110α同种型PIK3CA和Akt的基因，并已在数个人类癌症中证明其基因产物的蛋白表达增加。
此外，已在人类癌症中描述用于上调p85-p110复合体的p85α的突变和易位。最终，在多种人类癌症中以显著频率描述了激活下游信号通路的PIK3CA的体细胞错义突变(Kang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:802(2005)；Samuels等,Science 304:554(2004)；Samuels等,Cancer Cell 7:561-573(2005))。这些观察显示磷脂酰肌醇3-激酶失调以及该信号通路的上游和下游组分是与人类癌症和增殖性疾病相关的最常见失调之一(Parsons等,Nature 436:792(2005)；Hennessey等,Nature Rev.Drug Disc.4:988-1004(2005))。
已发现下面给出的式(III)的2-甲酰胺环氨基脲衍生物具有有利的药理性质，并抑制例如PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)。具体地，相对于β和/或δ和/或γ亚型，这些化合物优选显示对PI3Kα的选择性提高。由此，式(III)化合物适合例如用于治疗依赖于PI3激酶的疾病(尤其是PI3Kα，如显示PI3Kα过表达或PI3Kα扩增或PIK3CA体细胞突变的那些)，特别是增殖性疾病如肿瘤疾病和白血病。
此外，这些化合物优选显示提高代谢稳定性并因而降低清除率，产生改善的药代动力学分布。
就癌症患者而言，尽管有许多治疗选择，但仍需要有效和安全的治疗剂以及需要其优先用于联合疗法。具体地，需要有效的治疗癌症方法，特别是对当前疗法而言有耐药性和/或难治的那些癌症。
发明概述
在第一方面，本文提供含以下的药物组合：
(a)具有式(I)结构的第一化合物：
或其药学上可接受盐或溶剂合物，和
(b)具有式(II)结构的第二化合物：
或其药学上可接受盐或溶剂合物。
在一个实施方式中，所述具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物，以及具有式(II)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物在同一制剂中。
在一个实施方式中，所述具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物，以及具有式(II)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物在分开的制剂中。
在一个实施方式中，所述第一方面的组合用于同时或依序施用。
在第一方面的一个实施方式中，所述药物组合还包括具有式(III)结构的第三化合物：
或其药学上可接受盐或溶剂合物。
在一个实施方式中，所述具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物、具有式(II)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物以及具有式(III)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物在同一制剂中。
在一个实施方式中，所述具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物、具有式(II)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物以及具有式(III)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物在2种或更多种分开的制剂中。
在一个实施方式中，所述具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物、具有式(II)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物以及具有式(III)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物在2或3种分开的制剂中。
在一个实施方式中，所述药物组合用于同时或依序施用，该组合包括具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物、具有式(II)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物以及具有式(III)结构的化合物或其药学上可接受盐或溶剂合物。
在上述药物组合的一个特定实施方式中，所述第一化合物是具有式(I)结构化合物的琥珀酸盐。
在第二方面，本文提供在需要的对象中治疗或预防癌症的方法，包括向对象施用治疗有效量的上述实施方式中任一项所述药物组合。
在一个实施方式中，所述癌症选自下组：胰腺癌、乳腺癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤、结直肠癌、食管癌、脂肪肉瘤、多发性骨髓瘤、T细胞白血病、胃癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、肺癌和横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是胰腺癌、乳腺癌或套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是结直肠癌。
在第二方面的某些特定实施方式中，所述癌症表征为PIK3CA突变和/或PIK3CA过表达。
在第三方面，本文提供上述药物组合，用于治疗或预防癌症。
在第四方面，本文提供上述药物组合，用于制造治疗或预防癌症的药物。
在第三和第四方面的某些实施方式中，所述癌症选自下组：胰腺癌、乳腺癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤、结直肠癌、食管癌、脂肪肉瘤、多发性骨髓瘤、T细胞白血病、肾细胞癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、肺癌和横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是胰腺癌、乳腺癌或套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是结直肠癌。
在第三和第四方面的某些特定实施方式中，所述癌症表征为PIK3CA突变和/或PIK3CA过表达。
在第五方面，本文提供上述药物组合在制造治疗或预防癌症药物中的应用。
在第六方面，本文提供上述药物组合在治疗或预防癌症中的应用。
在第五和第六方面的特定实施方式中，所述癌症选自下组：胰腺癌、乳腺癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤、结直肠癌、食管癌、脂肪肉瘤、多发性骨髓瘤、T细胞白血病、肾细胞癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、肺癌和横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是胰腺癌、乳腺癌或套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是结直肠癌。
在第五和第六方面的某些特定实施方式中，所述癌症表征为PIK3CA突变和/或PIK3CA过表达。
在第七方面，本文提供含以下的药物组合物：
(a)具有式(I)结构的第一化合物：
或其药学上可接受盐或溶剂合物，和
(b)具有式(II)结构的第二化合物：
或其药学上可接受盐或溶剂合物。
在第七方面的一个实施方式中，所述药物组合物还包括具有式(III)结构的第三化合物：
或其药学上可接受盐或溶剂合物。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种赋形剂。
附图简要说明
图1显示LEE011、曲美替尼、BYL719和其组合在15个结直肠癌细胞系中的剂量-反应曲线。x轴表示治疗稀释的log10；y轴表示治疗后相对于DMSO的细胞计数。强虚线表示治疗开始前的细胞数(‘基线’)。
图2显示LEE011、曲美替尼、BYL719和其组合在15个结直肠癌细胞系中24小时、48小时和72小时后的最大半胱天冬酶3/7诱导(不同灰度)。x轴表示治疗；y轴表示各治疗所见的最大半胱天冬酶3/7诱导(％细胞)。
图3显示LEE011、曲美替尼和LEE011与曲美替尼的组合在15个结直肠癌细胞系中的剂量-反应曲线。x轴表示治疗稀释的log10；y轴表示治疗后相对于DMSO的细胞计数。强虚线表示治疗开始前的细胞数(‘基线’)。
图4显示LEE011、曲美替尼和LEE011与曲美替尼的组合在15个结直肠癌细胞系中24小时、48小时和72小时后的最大半胱天冬酶3/7诱导(不同灰度)。x轴表示治疗；y轴表示各治疗所见的最大半胱天冬酶3/7诱导(％细胞)。
图5a显示对于单药和LEE011与曲美替尼的组合，长期菌落形成试验后结晶紫染色后的代表性细胞图像。对于所有细胞系，LEE011在3μM剂量使用；对于DLD-1和SW-480，曲美替尼在33nM剂量使用，对于HT-29，在1.2nM剂量使用。
图5b显示用于一式三份测量/条件(RFU＝相对荧光单位)的来自图5a结晶紫信号的定量，其表明对于所有细胞系，联合疗法具有显著低于各单药治疗(**p<0.01,***p<0.001；单尾t检验)的信号。
发明详述
抑制剂化合物
CDK 4/6抑制剂7-环戊基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲酰胺(也称为“LEE011”或“ribociclib”)在本文中指具有式(I)结构的化合物或化合物(I)：
化合物(I)以及其药学上可接受盐和溶剂合物描述于国际公开号WO2010/020675(例如实施例74)，其全部内容通过引用纳入本文。
MEK抑制剂N-{3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘-苯氨基)6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基}乙酰胺(也称为“曲美替尼”)在本文中指具有式(II)结构的化合物或化合物(II)：
化合物(II)以及其药学上可接受盐和溶剂合物描述于国际公开号WO2005/121142(例如实施例4-1)，其全部内容通过引用纳入本文。
α-同种型特异性PI3K抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(也称为“BYL719”或“alpelisib”)在本文中指具有式(III)结构的化合物或化合物(III)：
化合物(III)以及其药学上可接受盐和溶剂合物描述于国际公开号WO2010/029082(例如实施例15)。此公开通过引用全文纳入本文。
盐和溶剂合物
本文所述抑制剂化合物的盐能单独存在或与游离碱形式混合，且优选是药学上可接受盐。除非另有说明，本文所用的“药学上可接受盐”包括本发明化合物中可存在的酸性和碱性基团的盐。例如，这类盐可作为酸加成盐形成，优选用有机或无机酸与碱性氮原子反应后形成。合适的无机酸是例如氢卤酸如盐酸，硫酸或磷酸。合适的有机酸是例如羧酸或磺酸，如富马酸或甲磺酸。出于分离或纯化目的，还能使用药学上不可接受盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐。
在本文所述药物组合的一个优选实施方式中，所述具有式(I)结构的化合物采用琥珀酸盐形式。
在本文所述药物组合的一个优选实施方式中，所述具有式(II)结构的化合物采用二甲亚砜溶剂合物形式。在某些实施方式中，所述具有式(II)结构的化合物采用选自以下的溶剂合物形式：水合物、乙酸、乙醇、硝基甲烷、氯苯、1-戊醇、异丙醇、乙二醇和3-甲基-1-丁醇。这些溶剂合物能由本领域技术人员根据国际公开号WO 2005/121142或美国专利公开号US 2006/0014768的描述来制备。
在本文所述药物组合的一个优选实施方式中，所述具有式(III)结构的化合物采用其游离碱形式。
出于治疗目的仅采用药学上可接受盐、溶剂合物或游离化合物(适用时采用药物制剂形式)，因而优选这些。鉴于游离形式与采用其盐形式(包括能用做中间体的那些盐，例如在纯化或鉴定新化合物期间)的化合物之间的密切关系，在适当且可取时，上下文任何提及游离化合物也应理解为指对应盐。本文考虑的盐优选是药学上可接受盐；本领域已知合适的反离子形成的药学上可接受盐。
药物组合和组合物
所述组合和组合物能施用于含细胞或组织的系统以及人类对象(如患者)或动物对象。
本发明的组合和组合物能以多种剂型和规格采用药物有效量或临床有效量施用。
用于分开施用2种组合成分或以固定组合(如含该组合的单个盖仑组合物)施用的药物组合物，可以本领域已知的任何方式制备，且是适合肠部(如口服或直肠)和胃肠外施用于包括人在内的哺乳动物(温血动物)的那些。
本文所述药物组合物可包含约0.1％-约99.9％、优选约1％-约60％的治疗剂。就肠部或胃肠外施用而言，用于联合疗法的合适药物组合物是例如采用单位剂型的那些，如包糖衣片剂、片剂、胶囊或栓剂或安瓿。除非另有说明，这些以本身已知的方式制备，例如通过本领域技术人员显而易见的多种常规混合、粉碎、直接压片、制粒、包糖衣、溶解、冻干工艺或加工技术。应理解各剂型单个剂量所含组合伴侣的单位内容物本身不需构成有效量，因为必要的有效量可通过施用多个剂量单位来实现。
含药剂组合或药剂组合中单独药剂的单位剂型可采用包封于胶囊如明胶胶囊内的微片剂形式。为此，能使用药物制剂所用的明胶胶囊，如获自辉瑞(Pfizer)的称为CAPSUGEL的明胶胶囊。
本发明的单位剂型可任选还包括用于药物的其他常规载体或赋形剂。这类载体的示例包括但不限于：崩解剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂、稀释剂、着色剂、调味剂和防腐剂。本领域普通技术人员可通过常规实验根据剂型的特定所需性质选择一种或多种上述载体，而无需任何过度负担。所用各载体的量在本领域常规范围内。通过引用纳入本文的下列参考文献公开了用于配制口服剂型的技术和赋形剂。参见《药物赋形剂手册》(The Handbook of Pharmaceutical Excipients),第4版,Rowe等编,美国医药协会(American Pharmaceuticals Association)(2003)；和《雷明顿：药学科学与实践》(Remington:the Science and Practice of Pharmacy),第20版,Gennaro编,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams & Wilkins)(2003)。
本文所用的术语“药学上可接受赋形剂”或“药学上可接受载体”包括，如本领域技术人员已知的任何及所有溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等，和其组合(参见例如《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences),第18版,麦克出版公司(Mack Printing Company),1990,第1289-1329页)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则就考虑其在治疗或药物组合物中的应用。
通过在造粒前或造粒期间将一或多种常规载体纳入初始混合物，或者通过在口服剂型中将一或多种常规载体与含药剂组合或药剂组合中单独药剂的颗粒组合，这些可任选的其他常规载体可纳入口服剂型。在后一个实施方式中，所述组合的混合物可进一步混和，如经V型混合机，随后压片或模塑成片剂(例如单层片剂)、由胶囊包封或填入小袋。
药学上可接受崩解剂的示例包括但不限于：淀粉；粘土；纤维素；藻酸盐；树胶；交联聚合物如交联聚乙烯吡咯烷酮或交聚维酮，例如来自ISP(International Specialty Products)(新泽西州韦恩)的POLYPLASDONE XL；交联羧甲基纤维素钠或可斯卡麦勒斯钠，例如来自FMC的AC-DI-SOL；和交联羧甲基纤维素钙；大豆多糖；和瓜尔豆胶。崩解剂可以约0％-约10％重量的组合物含量存在。在一个实施方式中，所述崩解剂以约0.1％-约5％重量的组合物含量存在。
药学上可接受粘合剂的示例包括但不限于：淀粉；纤维素和其衍生物，例如微晶纤维素，如来自FMC(宾夕法尼亚州费城)的AVICEL PH,来自陶氏化学公司(Dow Chemical Corp.)(密歇根州米德兰)的羟丙基纤维素羟乙基纤维素和羟丙甲纤维素METHOCEL；蔗糖；右旋糖；玉米糖浆；多糖；和明胶。粘合剂可以约0％-约50％(如约2-20％)重量的组合物含量存在。
药学上可接受润滑剂和药学上可接受助流剂的示例包括但不限于：硅胶、三硅酸镁、淀粉、滑石、磷酸三钙、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、碳酸镁、氧化镁、聚乙二醇、粉状纤维素和微晶纤维素。润滑剂可以约0％-约10％重量的组合物含量存在。在一个实施方式中，所述润滑剂可以约0.1％-约1.5％重量的组合物含量存在。助流剂可以约0.1％-约10％重量的组合物含量存在。
药学上可接受填充剂和药学上可接受稀释剂的示例包括但不限于：糖粉、可压缩糖、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、粉状纤维素、山梨醇、蔗糖和滑石。例如，填充剂和/或稀释剂可以约0％-约80％重量的组合物含量存在。
用于治疗癌症的最优剂量的各组合伴侣能用已知方法就各个体凭经验确定，并取决于多种因素，包括但不限于：疾病进展程度；个体的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间和途径；和个体正在服用的其它药物。最优剂量可用本领域已熟知的常规测试和程序确立。
可与载体材料联用以产生单一剂型的各组合伴侣量会根据所治疗个体和特定施用模式而变化。在一些实施方式中，含本文所述药剂组合的单位剂型包含一定量的组合各药剂，其通常在药剂单独施用时施用。
本发明组合所用各组合伴侣的有效剂量可根据所用特定化合物或药物组合物、施用模式、所治疗病症和所治疗病症严重度而变化。因此，本文所述组合的剂量方案根据多种因素选择，包括施用途径以及患者的肾和肝功能。
各组合伴侣的有效剂量可能需要相较组合中的一种化合物，更频繁施用另一种化合物。因此，为能适当给药，包装的药物产品能包括含化合物组合的一种或多种剂型，和含化合物组合之一但不含组合中其它化合物的一种或多种剂型。
一般地，化合物(I)(“LEE011”或“ribociclib”)(基于无盐/未溶剂化的化合物重量)以在人中每天10mg-2000mg的剂量范围施用。在一个实施方式中，LEE011以600mg QD施用。在另一个实施方式中，LEE011以300mg QD施用。在另一个实施方式中，LEE011以900mg QD施用。
一般地，化合物(II)(曲美替尼)(基于无盐/未溶剂化的化合物重量)作为本发明所述组合的一部分在人中施用，施用量选自每天约0.125mg-约10mg；适当地，所述量选自每天约0.25mg-约9mg；适当地，所述量选自每天约0.25mg-约8mg；适当地，所述量选自每天约0.5mg-约8mg；适当地，所述量选自每天约0.5mg-约7mg；适当地，所述量选自每天约1mg-约5mg；适当地，所述量是每天约2mg。
化合物(III)(“BYL719”或“alpelisib”)可以约1-6.5mg/kg有效日剂量在成年人或儿童中口服施用。化合物(III)可以约70mg-455mg日剂量口服施用于70kg体重的成年人，如约200-400mg，或约240mg-400mg，或约300mg-400mg，或约350mg-400mg，采用单一剂量或多至每日4次的分开的剂量。优选地，化合物(III)以约350mg-约400mg日剂量施用于70kg体重的成年人。
产生功效而无毒性的本发明组合(即化合物(I)、化合物(II)和可任选的化合物(III))的最优比例、个体和组合剂量，以及组合伴侣浓度基于治疗剂对靶位点可及性的动力学，并用本领域技术人员已知的方法测定。
剂量频率可根据所用化合物和待治疗或预防的特定病症而变化。一般地，优选足以提供有效治疗的最小剂量。一般可使用本领域普通技术人员熟悉的适合所治疗或预防病症的试验来监测患者的疗效。
在某些方面，本文所述药物组合用于治疗或预防癌症，或用于制备治疗或预防癌症的药物。在一个特定实施方式中，本文所述药物组合用于治疗癌症，或用于制备治疗癌症的药物。
在某些方面，提供治疗或预防癌症(如治疗癌症)的方法，包括向需要的患者施用药物有效量的本文所述药物组合。癌的性质是多因子的。某些情况下，作用机制不同的药物可组合。然而，仅考虑具有不同作用模式的任何治疗剂组合并不必然产生具有利效果的组合。
在一个实施方式中，所述癌症选自下组：胰腺癌、乳腺癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤、结直肠癌、食管癌、脂肪肉瘤、多发性骨髓瘤、T细胞白血病、胃癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、肺癌和横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是胰腺癌、乳腺癌或套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是结直肠癌。
在第二方面的某些特定实施方式中，所述癌症表征为PIK3CA突变和/或PIK3CA过表达。
在第三方面，本文提供上述药物组合，用于治疗或预防癌症。
在第四方面，本文提供上述药物组合，用于制造治疗或预防癌症的药物。
在第三和第四方面的某些实施方式中，所述癌症选自下组：胰腺癌、乳腺癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤、结直肠癌、食管癌、脂肪肉瘤、多发性骨髓瘤、T细胞白血病、肾细胞癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、肺癌和横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是胰腺癌、乳腺癌或套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是套细胞淋巴瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是横纹肌样瘤。
在一个特定实施方式中，所述癌症是结直肠癌。
施用本文所述药物组合可能不仅产生有益效果如协同治疗效果，例如涉及缓解、延迟症状发展或抑制症状；而且也产生更意外的有益效果，例如相较仅应用本发明组合所用药物治疗剂之一的单一疗法，副作用更少、反应更持久、生活质量改善或发病率降低。
另一益处是能使用更低剂量的本文所述药物组合治疗剂，例如从而剂量不仅通常更小，而且可较不频繁施用，或能用于减少单独用组合伴侣之一时观察到的副作用发生率。这符合待治疗患者的期望和需求。
通过已建立的测试模型显示出本文所述药物组合产生本文之前所述的有益效果。本领域技术人员完全能选择相关测试模型以证明这类有益效果。例如，本发明组合的药理活性可在临床研究或动物模型中证明。
在确定一种或多种组分之间的协同相互作用时，效果的最优范围和就效果而言的各组分绝对剂量范围可如下明确测量：以不同的w/w比例范围和剂量向需要治疗的患者施用组分。对于人，进行患者临床研究的复杂性和成本可使得应用这种测试形式作为协同作用初级模型不切实际。然而，在某些实验中(参见例如实施例1和2)观察到协同作用能预测在现有其它物种和动物模型内的效果以进一步测量协同效应。这些研究的结果也能用于预测有效剂量比范围以及绝对剂量和血浆浓度。
在一个实施方式中，本文提供的组合和/或组合物展示出协同效应。
在一个实施方式中，本文提供施用于人的协同组合，所述组合包括本文所述抑制剂，其中各抑制剂的剂量范围对应于合适肿瘤模型或临床研究中表明的协同范围。
用于本发明组合的组合伴侣以市售单一药物形式施用时，其剂量和施用模式可与各市售药物包装说明书提供的信息一致，除非本文另有提及。
定义
本文所用的某些术语如下所述。化合物用标准命名法描述。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域技术人员通常理解相同的意义。
本文定义的术语“药物组合物”指含至少一种治疗剂的混合物或溶液，所述治疗剂待施用于对象如哺乳动物或人，以预防或治疗影响哺乳动物或人的特定疾病或病症。
本文定义的术语“药学上可接受”指在合理医学判断范围内，适于接触对象如哺乳动物或人组织的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，而没有过度毒性、刺激、过敏反应和其它问题并发症，并具有合理的效益/风险比。
本文所用的术语“治疗”或“处理”包括减缓、减轻或缓解对象中至少一种症状或者实现疾病发展延迟的治疗。例如，治疗可以是减少一种或多种疾病症状或者完全消除疾病，如癌症。在本发明意义内，术语“治疗”也指阻滞、延迟疾病发生(即疾病临床表征前的阶段)和/或降低疾病发展或恶化的风险。本文所用的术语“预防”、“防止”或“阻止”包括预防至少一种症状，该症状与所预防状态、疾病或紊乱相关或由其导致。
术语“药学有效量”或“治疗有效量”的治疗剂组合是相比用所述组合治疗疾病的基线临床可观察征兆和症状，足以提供可观察改善的量。
本文所用的术语“组合”、“治疗组合”或“药物组合”指采用一个剂量单位形式的固定组合或非固定组合，或联合施用的成套药盒；其中2种或更多治疗剂可同时独立地施用或在一定时间间隔内分开地施用，尤其是当这些时间间隔允许组合伴侣显示协作如协同效应。
术语“联合疗法”指施用2种或更多治疗剂以治疗本公开所述的治疗病症或疾病。这类施用涵盖以基本同时的方式共施用这些治疗剂，如在活性成分比例固定的单一制剂或各活性成分的分开制剂中(如胶囊和/或静脉内制剂)。另外，这类施用也涵盖在大致同时或不同时间以依序或分开方式使用各类治疗剂。无论活性成分是作为单一制剂还是分开制剂施用，所述治疗剂作为同一治疗进程的一部分施用于相同患者。任何情况下，治疗方案会提供治疗本文所述病症或疾病的有益效果。
本文所用的术语“协同效应”指2种治疗剂，如CDK抑制剂化合物(I)、MEK抑制剂化合物(II)和可任选的PI3K抑制剂化合物(III)作用以产生效果，例如减缓增殖性疾病尤其是癌症或其症状的症状进展，其大于单独施用各治疗剂效果的简单叠加。例如，协同效应能用合适方法计算，如Sigmoid-Emax方程(Holford,N.H.G.和Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.6:429-453(1981))、Loewe相加性方程(Loewe,S.和Muischnek,H.,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114:313-326(1926))和中效方程(Chou,T.C.和Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul.22:27-55(1984))。上面所提及的各方程能应用于实验数据以产生对应图线，从而协助评价药物组合效果。与上面所提及方程相关的对应图线分别是浓度-效应曲线、等效应图曲线和联合指数曲线。
本文所用的术语“对象”或“患者”包括动物，其能患有癌症或直接或间接涉及癌症的任何疾病，或者受其影响。对象示例包括哺乳动物，如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠以及转基因非人动物。在一个优选实施方式中，所述对象是人，如患有、有风险患有、或潜在能患有癌症的人。
本文所用的术语“固定组合”、“固定剂量”和“单一制剂”指配制成以一定量递送2种或更多治疗剂给患者的单一载体或载剂或剂型，所述量对癌症治疗在治疗上共同有效。单一载剂设计成递送一定量的各药剂以及任何药学上可接受载体或赋形剂。在一些实施方式中，所述载剂是片剂、胶囊、药丸或贴片。在其它实施方式中，所述载剂是溶液或悬液。
术语“非固定组合”、“成套药盒”和“分开的制剂”指活性成分如LEE011和曲美替尼作为单独实体同时、同步或无特定时间限制地依序施用于患者，其中这类施用在需要其的温血动物体内提供治疗有效水平的2种化合物。后者也应用于鸡尾酒疗法，如施用3种或更多活性成分。
本文所用的术语“单位剂量”指向所治疗患者同时一起施用在一个剂型中的2种或3种药剂。在一些实施方式中，所述单位剂量是单一制剂。在某些实施方式中，所述单位剂量包括一个或多个载剂，从而各载剂包括有效量的至少一种药剂以及药学上可接受载体和赋形剂。在一些实施方式中，所述单位剂量是同时施用于患者的一个或多个片剂、胶囊、药丸、注射剂、输液、贴片等。
“口服剂型”包括处方或预期用于口服施用的单位剂型。
术语“包含”和“包括”在本文中以其开放和非限制性意义使用，除非另有说明。
术语“一个”和“一种”和“所述”以及描述本发明上下文中的类似提及(特别是下列权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。复数用于化合物、盐等时，也指单一化合物、盐等。
术语“约”或“大致”应具有在给定值或范围的10％以内、更优选5％以内的含义。
实施例
材料与方法
化合物以20mM浓度溶于100％DMSO(西格玛(Sigma)，产品目录号D2650)，并在-20℃保存待用。化合物排列在药物主模板(葛莱娜(Greiner)，产品目录号788876)中并以2000X浓度连续稀释3倍(7步)。
从商业供应商ATCC、CellBank澳大利亚、DMSZ、ECACC和HSRRB获得用于此研究的结直肠癌细胞系，培养并处理(表1)。所有细胞系培养基补充有10％FBS(海克隆(HyClone),产品目录号SH30071.03)。LIM2551的培养基额外补充有0.6μg/mL胰岛素(西格玛，产品目录号I9278)、1μg/mL氢化可的松(西格玛，产品目录号H0135)和10μM 1-硫代甘油(西格玛，产品目录号M6145)。
表1.细胞系信息
细胞系在37℃和5％CO2培养箱中培养，在T-75培养瓶中扩增。所有情形下，细胞从冷冻储液中解冻，用1:3稀释通过≥1次传代来扩增，用ViCell计数器(贝克曼库尔特(Beckman-Coulter))计数并评价活力，然后接种。为分离并扩增细胞系，细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO，产品目录号25200)从培养瓶中移出。通过Idexx Radil(美国密苏里州哥伦比亚)进行的PCR检测方法确定并通过检测SNP组来正确鉴定，确定所有细胞系没有支原体污染。
配合前述方法(Horn,Sandmann等.2011)和使用R中的Bioconductor包EBImage(Pau,Fuchs等.2010)后，分析图像。2个通道中的对象即DAPI(用于Hoechst/DNA)和FITC(用于半胱天冬酶3/7)通过自适应阈值化单独分段并计数。比较负对照(DMSO)和正对照(星形孢菌素)后，手动确定每细胞系的半胱天冬酶3/7阳性对象阈值。通过分析DNA通道中的17个额外对象/核特征(形状和强度特征)，鉴定碎片/片段化核。为此，手动比较正对照(星孢菌素)与负对照(DMSO)之间的额外特征分布/细胞系。能在条件之间区分的特征(如比较DMSO与星形孢菌素的特征测量分布的位移)用于确定‘碎片’群与‘活’核群。从原始核计数中减去碎片计数。所得核数目用作细胞增殖的量度(‘细胞计数’)。
化合物对细胞增殖的作用计算自相对于负对照(DMSO)的细胞计数的治疗的细胞计数，在图1和图3中表示为y轴上的‘标准化细胞计数’(＝‘xnorm’)。协同组合用最高单药模型(HSA)作为零假设(Berenbaum 1989)鉴定。超过HAS模型则预测受抑制靶标之间的功能联系(Lehar,Zimmermann等.2007,Lehar,Krueger等.2009)。模型输入是抑制值/药物剂量：
I＝1-xnorm
I:抑制
xnorm:标准化细胞计数(3次重复的中值)
在组合治疗的每一剂量点，计算组合抑制与2种单药中较强的抑制之间的区别(＝模型残差)。为有利于高抑制下的组合效果，残差用在同一剂量点观察到的抑制加权。药物组合的总体组合得分C是所有浓度中加权残差的总和：
C＝Σ浓度(I数据*(I数据–I模型))
I数据:测量的抑制
I模型:根据HSA零假设的抑制
稳健组合z计分(zC)计算为治疗的组合得分C与非相互作用组合的绝对中位差(mad)之比：
zC＝C/mad(C零)
C零:非相互作用组合的组合得分
zC是组合强度指示物:
zC≥3:协同作用
3>zC≥2:弱协同作用
zC<2:无协同作用
IC50是相对于DMSO产生50％细胞计数的化合物浓度。使用R中的DRC包(Ritz和Streibig 2005)并拟合四参数log-逻辑函数与数据，完成IC50计算(见表2和表3)。
化合物对细胞凋亡的作用如下确定：相对于(减去碎片前的)原始细胞计数，计算每治疗和时间点有活化半胱天冬酶3/7的细胞百分数(图2和图4的y轴)。未经实验测量的各时间点细胞计数如下通过回归分析获得：对第0天和治疗结束时(假设细胞指数生长)对数变换的细胞计数拟合线性模型。
对于菌落形成试验(图5a)，细胞接种于12孔组织培养处理板(Costar,产品目录号3513)的1mL培养基：就DLD-1而言为1000细胞/孔，就SW-480而言为1500细胞/孔，且就HT-29而言为2,500细胞/孔。细胞在加入化合物前生长24小时，使用HP D300数字分配器(帝肯(Tecan))每72小时(在新鲜培养基中)更新处理，持续多至14天。处理结束时，细胞在PBS中洗一次，使用含4％PFA(EMS(Electron Microscopy Sciences)，产品目录号15714)和2mg/mL结晶紫(EMD，产品目录号192-12)的溶液室温固定并染色30分钟，并用水洗3次。板干燥过夜，用Odyssee成像仪(Licor)扫描。ImageStudio软件(Licor)用于定量图5a的结晶紫信号。
实施例1：在结直肠癌细胞(CRC)系中联合CDK4/6抑制剂LEE011(也称为“ribociclib”)与MEK抑制剂曲美替尼以及PIK3CA抑制剂BYL719(也称为“alpelisib”)对增殖的体外效果。
为测试LEE011、曲美替尼与BYL719组合对细胞增殖的效果，细胞接种于有清底的黑色384孔微量板(Matrix/赛默科技(Thermo Scientific)，产品目录号4332)中的50μL培养基/每孔，细胞密度为500-1250细胞/孔(表1)，并在37度、5％CO2孵育24小时。24小时后，制备384孔板/细胞系以通过显微镜检查(见下)进行细胞计数，而不接受处理(＝‘基线)。其它细胞板如下处理：用ATS声学液体分配器(ECD生物系统公司(ECD Biosystems))从药物主模板转移25nL 2000X化合物并获得最终1X浓度。BYL719在13nM-10μM的终浓度范围中使用，LEE011在13nM-10μM的终浓度范围中使用，曲美替尼在0.4nM-0.3μM的终浓度范围中使用(7个1:3稀释步骤)。为评价三重组合的效果，在同一实验中测试所有个体化合物、所有3个成对组合和三重组合。成对组合和三重组合在各稀释度以1:1(用于药物对)和1:1:1(用于三联药物)固定比例测试，产生7种组合/处理。另外，负对照(DMSO＝‘载剂’)和正对照(星形孢菌素＝杀死细胞,7点1:2稀释系列用于16nM-1μM的剂量范围)作为治疗对照转移，在所测试细胞系中无功效的化合物与BYL719和LEE011的组合作为组合对照(不超过更有效单药功效的组合＝‘非相互作用’组合)。化合物添加后，用HP D300数字分配器(帝肯)将50nL 2mM CellEvent半胱天冬酶-3/7绿色检测试剂(赛默飞世尔(ThermoFisher)，产品目录号C10423)加入三个重复之一。半胱天冬酶3/7诱导作为治疗诱导的细胞凋亡替代物测量。细胞根据其倍增时间处理72小时-96小时(表1)，且使用装有4X物镜和FITC激发/发射滤光片的InCell分析仪2000(通用电气医疗集团(GE Healthcare))每24小时通过显微镜检查测量半胱天冬酶3/7活化。治疗结束时，制备细胞以通过显微镜检查进行细胞计数。细胞在溶于PBS(波士顿生物产品公司(Boston Bioproducts)，产品目录号BM-220)的4％PFA(EMS，产品目录号15714)、0.12％TX-100(EMS，产品目录号22140)中固定并透化45分钟。细胞用PBS洗3次后，其DNA用Hoechst 33342(赛默飞世尔，产品目录号H3570)染色30分钟，终浓度为4μg/ml。细胞用PBS洗3次，然后板用带铝密封件(安捷伦科技(Agilent Technologies)，产品目录号06644-001)的PlateLoc(安捷伦科技)热密封，4℃保存直至成像。使用装有4X物镜和DAPI激发/发射滤光片的InCell分析仪2000(通用电气医疗集团)，通过荧光显微镜在单一图像中捕获每孔所有细胞/治疗。
在总共15个结直肠癌细胞系中对PIK3CA抑制剂BYL719、CDK4/6抑制剂LEE011与MEK抑制剂曲美替尼的功效进行单独以及联合评价。细胞系是KRAS、BRAF和/或PIK3CA突变型，或就所有3种基因而言是野生型(表1)。BYL719和LEE011主要显示微摩尔IC50值，LEE011在所测试细胞系更有效。BYL719仅在7/15个细胞系中达到IC50，而LEE011在13/15个细胞系中达到IC50。曲美替尼在除了三个(GP2d、COLO-320和OUMS-23)以外的细胞系中具有纳摩尔到亚微摩尔IC50(图1和表2)。三重组合(LEE011+曲美替尼+BYL719)相比药物对在10/15个细胞系中引起协同抑制(根据HSA模型)以及在3/15个细胞系中引起弱协同抑制(表2)。相较成对的组合，三重组合并不更强地诱导细胞调亡(通过测量半胱天冬酶3/7诱导来评价)(图2)。共同地，在CRC中联合抑制PIK3CA、CDK4/6和MEK可提供相较各单药能够改善反应的有效治疗模式，并产生临床更持久的反应。
表2.各化合物的单药IC50值以及LEE011、曲美替尼与BYL719组合的协同作用z计分测量。
实施例2：在结直肠癌细胞(CRC)系中联合CDK4/6抑制剂LEE011和MEK抑制剂曲美替尼对增殖的体外效果。
为测试LEE011与曲美替尼组合对细胞增殖的效果，细胞接种于有清底的黑色384孔微量板(Matrix/赛默科技，产品目录号4332)中的50μL培养基/每孔，细胞密度为500-1250细胞/孔(表1)，并在37度、5％CO2孵育24小时。24小时后，制备384孔板/细胞系以通过显微镜检查(见下)进行细胞计数，而不接受治疗(＝‘基线)。其它细胞板如下处理：用ATS声学液体分配器(ECD生物系统公司)从药物主模板转移25nL 2000X化合物，获得最终1X浓度。LEE011在13nM-10μM的终浓度范围中使用，曲美替尼在0.4nM-0.3μM的终浓度范围中使用(7个1:3稀释步骤)。对于LEE011与曲美替尼组合，单个药剂在各稀释度以1:1固定比例合并，产生7种组合/治疗。另外，负对照(DMSO＝‘载剂’)和正对照(星形孢菌素＝杀死细胞,7点1:2稀释系列用于16nM-1μM剂量范围)作为治疗对照转移，在所测试细胞系中无功效的化合物与LEE011和曲美替尼联用作为组合对照(不超过更有效单药功效的组合＝‘非相互作用’组合)。化合物添加后，用HP D300数字分配器(帝肯)将50nL 2mM CellEvent半胱天冬酶-3/7绿色检测试剂(赛默飞世尔，产品目录号C10423)加入三个重复之一。半胱天冬酶3/7诱导作为治疗诱导的细胞凋亡替代物测量。细胞根据其倍增时间处理72小时-96小时(表1)，使用装有4X物镜和FITC激发/发射滤光片的InCell分析仪2000(通用电气医疗集团)每24小时通过显微镜检查测量半胱天冬酶3/7活化。治疗结束时，制备细胞以通过显微镜检查进行细胞计数。细胞在溶于PBS(波士顿生物产品公司，产品目录号BM-220)的4％PFA(EMS，产品目录号15714)、0.12％TX-100(EMS，产品目录号22140)中固定并透化45分钟。细胞用PBS洗3次后，其DNA用Hoechst 33342(赛默飞世尔，产品目录号H3570)染色30分钟，终浓度为4μg/ml。细胞用PBS洗3次，然后板用带铝密封件(安捷伦科技(Agilent Technologies)，产品目录号06644-001)的PlateLoc(安捷伦科技)热密封，4℃保存直至成像。使用装有4X物镜和DAPI激发/发射滤光片的InCell分析仪2000(通用电气医疗集团)通过荧光显微镜在单一图像中捕获每孔所有细胞/治疗。
在总共15个结直肠癌细胞系中对CDK4/6抑制剂LEE011与MEK抑制剂曲美替尼的功效进行单独以及联合评价。细胞系是KRAS、BRAF和/或PIK3CA突变型，或就所有3种基因而言是野生型(表1)。作为单药的LEE011抑制除了两个(SW837和OUMS-23)以外的细胞系生长，具有亚微摩尔到微摩尔IC50值(图3和表3)。作为单药的曲美替尼强烈抑制除了三个(GP2d、COLO-320和OUMS-23)以外的细胞系生长，具有纳摩尔到亚微摩尔IC50值(图3和表3)。联合治疗在13/15个所测试细胞系中引起不同强度的协同抑制(根据HSA模型)(表3)。KRAS和PIK3CA突变型或KRAS突变型细胞系从组合受益最大(表3)。相较单药，组合并不更强地诱导细胞调亡(通过测量半胱天冬酶3/7诱导来评价)，这可能是CDK4/6抑制后细胞周期阻滞诱导的结果(图4)。2种KRAS突变细胞系(DLD-1和SW480)和1种BRAF突变细胞系(HT-29)的长期菌落形成试验显示，组合相较各单药提供显著更好的功效(图5a和图5b)。共同地，在CRC中联合抑制CDK4/6和MEK可提供相较各单药能够改善反应的有效治疗方法，并产生临床更持久的反应。
表3.各化合物的单药IC50值以及LEE011与曲美替尼组合的协同作用z计分测量。