本申请要求2015年11月2日提交的美国临时申请第62/249,520号的优先权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
背景技术：
干细胞罕见，并且难以从成体组织分离可观数量。在2006，shinyeyamanaka所领导的研究队伍出版一篇文章，描述分化的成年细胞如何可以再程序化以显示许多干细胞的特性，包含多能性(takahashi,k.&yamanaka,《干细胞(s.cell)》126:663-676(2006))。这些“诱导多能干细胞”(ipsc)本质上可以无限期复制，并且其可以分化成来源于三种胚胎胚层的任何细胞类型从而可能在人体中形成任何细胞。因此，ipsc方法的研发已经为个人化和再生医学开辟了新的道路。用于产生ipsc的方法明确界定；然而，其效率较低。因此将期望提高ipsc生产效率的方法。
技术实现要素：
在一些方面，本发明涉及用于产生诱导多能干细胞(ipsc)的方法，包括：提供细胞；遏制细胞的细胞周期；以及转化细胞，进而产生诱导多能干细胞。这一方法还可用于产生多种诱导多能干细胞。
在一些方面中，本发明涉及用于产生多种诱导多能干细胞的方法，包括：提供多种细胞；选择多种细胞的亚群，其中细胞的亚群富集在一或多个细胞周期分期的细胞中；以及转化细胞的亚群，进而产生多种诱导多能干细胞。
具体实施方式
引人注目地，我们已发现使细胞群组的细胞周期同步引起在后续转化步骤之后诱导多能干细胞(ipsc)的较高产率。可以例如通过遏制细胞的细胞周期，或通过自多种细胞选择富集在一或多个细胞周期分期的细胞来实现同步。
在一些方面中，本发明涉及用于产生诱导多能干细胞的方法，包括：提供细胞；遏制细胞的细胞周期；以及转化细胞，进而产生诱导多能干细胞。细胞优选地并非干细胞(例如，细胞可以是分化细胞)。这一方法还可用于产生多种诱导多能干细胞。
在一些方面中，本发明涉及用于产生多种诱导多能干细胞的方法，包括：提供多种细胞；选择多种细胞的亚群，其中细胞的亚群富集在一或多个细胞周期分期的细胞中；以及转化细胞的亚群，进而产生多种诱导多能干细胞。在优选实施例中，细胞并非干细胞。多种细胞可包括干细胞，并且这类多种细胞也将包括并非干细胞的细胞(例如，多种细胞也将包括分化细胞)。
i.细胞
细胞可以是真核细胞，如多细胞动物细胞。细胞可以是哺乳动物细胞。细胞可以来自啮齿动物、兔类动物、猫、犬、猪、绵羊、牛、马或灵长类动物。举例来说，细胞可以是人类细胞。在优选实施例中，细胞是体细胞。在优选实施例中，细胞是二倍体细胞。
细胞可以是分化细胞。细胞可以来源于外胚层、内胚层或中胚层。细胞可以来源于上皮、结缔组织、肌肉组织或神经组织。细胞可以是外周血液单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell；pbmc)或成纤维细胞。细胞可以是淋巴细胞。在一些实施例中，细胞是脂肪细胞。
ii.遏制细胞周期
在一些方面中，本发明涉及包括遏制细胞的细胞周期的方法。遏制细胞的细胞周期可以包括抑制有丝分裂的任何已知方法(参见例如班法维(banfalvi),加斯帕(gaspar),《细胞周期同步化(cellcyclesynchronization)》(胡马纳出版社(humanapress),2011)；和pct专利申请公开案第wo2010/118709号(以引用的方式并入本文中))。位于细胞周期的有丝分裂期(m期)的细胞更加易于接受转导及/或转染。因此，在一些优选实施例中，遏制细胞周期包括在m期遏制细胞周期(例如，通过使细胞与试剂(如秋水仙碱、秋水仙胺、雷佐生(razoxane)或诺斯卡品(noscapine))接触)。然而，遏制细胞周期可以包括在间期，如g0期、g1期、s期或g2期遏制细胞周期。举例来说，细胞可以在g1/s期中遏制(例如，使用胸苷，如4mm胸苷，历经16-24小时)，并且方法可以包括在从遏制释放细胞之后，在转化细胞之前将细胞培育一段时间(例如在从胸苷阻滞释放12小时之后，使得细胞当其转化时处于m期)。
方法可以包括遏制多种细胞的细胞周期，并且对于这类实施例，词组“遏制细胞周期”与“使细胞周期同步”同义。
在一些实施例中，遏制细胞周期不在特定分期中断细胞周期，却又抑制细胞周期，使得转化比在不遏制细胞周期的情况下更高效。举例来说，阿非迪霉素(aphidicolin)和诺考达唑(nocodazole)可用于在g2/m期抑制细胞，其适用于提高转化效率。遏制细胞周期可以包括在间期、g0期、g0/g1期、早期g1期、g1期、晚期g1期、g1/s期、s期、g2/m期或m期遏制细胞周期。
通过血清饥饿或营养饥饿遏制细胞周期为所属领域所熟知并且可用于例如在g1期或g期中抑制细胞周期(参见例如美国专利第8,993,328号；以引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，遏制细胞周期包括在包括限制细胞生长的血清浓度和/或氨基酸浓度的培养基中培育细胞。细胞可以在包括限制细胞生长的血清浓度和/或氨基酸浓度的培养基中培育约1小时到约10天，如约1天到约7天，如约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。例如因为不同细胞和不同细胞培养条件导致不同持续时间的细胞周期，所以时段可以取决于不同因素。培养基可具有例如约0％到约10％，如约0.1％到约5％、约0.1％到约2％、或约0.1％到约1.0％的血清浓度。培养基可具有小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、或小于约1％的血清浓度。培养基可具有约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、或约1.0％的血清浓度。培养基可以是无血清培养基(即，培养基不包括血清)。随后可以例如通过使细胞与包括第二血清浓度(即，比限制细胞生长的血清浓度高的血清浓度)的培养基接触重新开始细胞周期。因此，方法可以包括在包括第二血清浓度和/或第二氨基酸浓度的培养基中培育细胞，例如其中第二血清浓度和/或第二氨基酸浓度高于限制细胞生长的血清浓度或氨基酸浓度。第二血清浓度可以是约2％到约35％，如约5％到约30％或约10％到约25％。第二血清浓度可以是约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％。血清可以是例如胎牛血清。
遏制细胞周期可以包括使细胞与试剂接触。使细胞与试剂接触可以包括在包括试剂的培养基中培育细胞。试剂可以是小分子或生物分子。如本文中所使用，术语“小分子”是指分子量低于5,000amu，如约30到约1000amu、约40amu到约800amu或约50amu到约750amu的分子。术语“生物分子”是指包括肽、蛋白质、核酸、糖和/或碳水化合物的分子。生物分子可以是例如细胞因子(例如转化生长因子β)。试剂可以是转录因子的抑制因子、酶(例如激酶或磷酸化酶)或细胞路径。举例来说，试剂可以是细胞周期素依赖性激酶抑制剂、细胞周期素依赖性激酶4抑制剂、细胞周期素依赖性激酶6抑制剂、dna聚合酶抑制剂、hmgcoa还原酶抑制剂、核苷酸生物合成的抑制剂或微管聚合的抑制剂。
在优选实施例中，试剂是细胞周期的可逆抑制剂，例如在从包括试剂的培养基去除试剂之后，细胞可以重新启动其细胞周期。在优选实施例中，试剂无毒，例如对细胞无毒的试剂的浓度足以遏制细胞的细胞周期。在优选实施例中，在包括试剂的培养基中培育细胞包括在包括对细胞无毒的试剂的浓度的培养基中培育细胞。试剂可以是玻玛西林(abemaciclib)、氨基喋呤、阿非迪霉素、布雷他汀(blebbistatin)、丁酸盐、卡西酮、秋水仙胺、秋水仙碱、康帕丁(compactin)、细胞松弛素d、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟脱氧尿苷、羟基脲、洛伐他汀(lovastatin)、甲氨喋呤、梅维诺林(mevinolin)、mg132、含羞草碱、诺考达唑(nocodazole)、诺斯卡品(noscapine)、帕博西林(palbociclib)、鸦片全碱、雷佐生、雷弗霉素a(reveromycina)、ro-3306、罗斯维汀(roscovitine)、瑞博西林(ribociclib)、长春新碱或沃鲁西林(voruciclib)。
在包括试剂的培养基中培育细胞可以包括在包括试剂的培养基中培育细胞约1小时到约10天，如约2小时到约7天、如约1、2、3、4、5、6或7天。例如因为不同细胞和不同细胞培养条件导致不同持续时间的细胞周期，所以时段可以取决于不同因素。
在一些实施例中，方法包括在不包括试剂的培养基培育细胞中，例如在包括试剂的培养基中培育细胞之后，以重新启动细胞周期。举例来说方法可以包括在双胸苷阻滞之后，在不包括试剂的培养基中培育细胞约4小时到约24小时，例如使得细胞在转化期间处于m期。
在一些实施例中，遏制所述细胞周期包括调节cek相互作用蛋白(cekinteractingprotein；cip)路径、激酶抑制蛋白(kinaseinhibitoryprotein；kip)路径、激酶4的抑制剂(inhibitorofkinase4；ink4a)路径或替代阅读框架(arf)路径。举例来说，cip/kip家族成员p21、p27和p57在g1期遏制细胞周期。转化生长因子β(tgfβ)可用于活化p27。类似地，ink4a/arf家族包含p16ink4a，所述p16ink4a结合于细胞周期素依赖性激酶4(cyclindependentkinase4；cdk4)以在g1期遏制细胞周期。在一些实施例中，遏制细胞周期包括活化p14arf、p16ink4a、p18、p19、p21、p27、p53或p57(参见例如美国专利第6,033,847号；以引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，遏制细胞周期包括调节细胞周期素d路径。遏制细胞周期可以包括抑制细胞周期素依赖性激酶4(cdk4)或细胞周期素依赖性激酶6(cdk6)。遏制细胞周期可以包括使细胞与细胞周期素依赖性激酶抑制剂接触。细胞周期素依赖性激酶抑制剂可以是例如细胞周期素依赖性激酶4抑制剂或细胞周期素依赖性激酶6抑制剂。帕博西林是cdk4和cdk6两者的选择性抑制剂。在一些实施例中，细胞周期素依赖性激酶抑制剂是帕博西林、瑞博西林、沃鲁西林或玻玛西林(也参见pct专利申请公开案第wo2014/109858号；以引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，遏制细胞周期包括抑制细胞中的核苷酸生物合成。抑制细胞中的核苷酸生物合成包括使细胞与核苷酸生物合成的抑制剂接触。
在一些实施例中，遏制细胞周期包括在包括羟基脲或胸苷的培养基中培育细胞。羟基脲和胸苷造成作为dna的主要结构单元的游离脱氧核糖核苷酸三磷酸盐(dntp)的减少。dna复制的抑制遏制细胞在g1期与s期之间的转变。这一方法的优势包含可能通过重复暴露于复制抑制剂而获得均相同步的细胞群以及复制抑制剂便宜的事实。
在一些实施例中，遏制细胞周期包括抑制细胞中的微管聚合。抑制微管聚合可以包括使细胞与微管聚合的抑制剂(如诺考达唑)接触。
在一些实施例中，遏制细胞周期包括抑制细胞中的hmgcoa还原酶。抑制hmgcoa还原酶可以包括使细胞与hmgcoa还原酶抑制剂(如洛伐他汀)接触。
在一些实施例中，遏制细胞周期包括抑制细胞中的dna聚合酶。抑制dna聚合酶可以包括使细胞与dna聚合酶抑制剂(如阿非迪霉素)接触。
在一些实施例中，遏制细胞周期包括使细胞与以下各者接触：玻玛西林、氨基喋呤、阿非迪霉素、布雷他汀、丁酸盐、卡西酮、秋水仙胺、秋水仙碱、康帕丁、细胞松弛素d、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟脱氧尿苷、羟基脲、洛伐他汀、甲氨喋呤、梅维诺林、mg132、含羞草碱、诺考达唑、诺斯卡品、帕博西林、鸦片全碱、雷佐生、雷弗霉素a、ro-3306、罗斯维汀、瑞博西林、长春新碱或沃鲁西林。
在一些实施例中，遏制细胞周期包括在低温下培育细胞。低温可以是例如低于约35℃、低于34℃、低于33℃、低于32℃、低于31℃、或低于30℃。低温可以是约20℃到约35℃，如约27℃到约33℃。低温可以是约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃或约33℃。细胞可以在低温下培育约1小时到约10天，如约1天到约7天，如约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。例如因为不同细胞和不同细胞培养条件导致不同持续时间的细胞周期，所以时段可以取决于不同因素。
在某些实施例中，方法包括使用超过一种本文所描述的方法遏制细胞周期，所述方法包含血清饥饿或营养不足；使细胞与试剂接触；使细胞与超过一种试剂接触；调节细胞路径和在低温下培育细胞。
iii.在细胞周期的阶段选择细胞
在一些方面中，本发明涉及包括选择多种细胞的亚群的方法，其中细胞的亚群富集在一或多个细胞周期分期的细胞中。方法可进一步包括例如在选择亚群之前，使用本文所描述的任何方法遏制多种细胞的细胞周期。类似地，方法可进一步包括例如在选择亚群之后，使用本文所描述的任何方法遏制细胞亚群的细胞周期。
方法可以包括选择富集在g0期、g0/g1期、早期g1期、g1期、晚期g1期、g1/s期、s期、g2/m期或m期细胞中的多种细胞的亚群。在某些优选实施例中，方法包括选择富集在m期细胞中的细胞亚群。
方法可以包括使细胞群体与染料接触，其中选择细胞亚群包括选择包括类似量的染料的细胞。如本文所用，术语“染料”是指可以在红外光、可见光或紫外光波长下吸光或发光的分子或粒子，如发色团或荧光团。举例来说，染料可以包括荧光素、alexa
在一些实施例中，方法包括荧光激活细胞分选术(fluorescenceactivatedcellsorting；facs)(参见例如pct专利申请公开第wo2014/109713号和第wo2010/118709号，各自以引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，方法不包括使细胞群体与染料接触。举例来说，facs系统的前向散射和侧向散射可用于分化细胞周期的不同阶段的细胞(例如，“荧光激活细胞分选术”可以依赖于前向散射和侧向散射而非荧光)。类似地，如离心淘析和有丝分裂振荡分离的方法并不依赖于染料。
选择多种细胞的亚群可以包括离心淘析(参见例如pct专利申请公开第wo2013/067038号和第wo2003/093469号；各自以引用的方式并入本文中)。离心淘析系统由专用的离心机转子组成，其中离心力和反向的整体介质流产生梯度，较小细胞处于顶部并且较大细胞处于底部。操控转子速度或介质流量使得尺寸分离的细胞梯度朝向顶部推动并且将梯度顶部处的较小细胞最终推出淘析腔室并且进入收集容器。在进一步操控转子速度和介质流量的情况下，逐渐地将较大细胞推出淘析腔室。因为g1细胞大致为有丝分裂或晚期g2细胞尺寸的一半，所以可以根据其在细胞周期中的位置使用离心淘析选择细胞。
选择多种细胞的亚群可以包括有丝分裂振荡分离(参见例如pct专利申请公开第wo2010/118709号；美国专利第5,710,022号；以及美国专利申请公开案第2005/0273870号；各自以引用的方式并入本文中)。有丝分裂振荡分离允许选择球形有丝分裂(m)期细胞，所述细胞粘附至表面的稳定性低于g0期、g1期、s期和g2期细胞。因此，振荡粘附细胞的培养物允许使m期细胞与其它阶段的细胞分离。
iv.转化细胞
方法优选地包括转化(一或多种)细胞以产生诱导多能干细胞。转化(一或多种)细胞可以包括用一或多种蛋白质、一或多种核酸、一或多种载体和/或一或多种小分子转化细胞。
产生诱导多能干细胞可以包括用至少一种选自由以下组成的群组的基因转导细胞：oct家族基因、klf家族基因、sox家族基因、myc家族基因、lin家族基因和nanog基因(参见例如美国专利申请公开案第2009/0227032号；以引用的方式并入本文中)。举例来说，产生诱导多能干细胞可以包括用oct家族基因、klf家族基因、sox家族基因、myc家族基因、lin家族基因和nanog基因转导细胞。方法可以包括用kruppel样因子4(kruppel-likefactor4；klf4)、八聚物结合转录因子3/4(octamer-bindingtranscriptionfactor3/4；oct-3/4)、八聚物结合转录因子4(octamer-bindingtranscriptionfactor4；oct-4)、性别决定区y(sexdeterminingregiony；sry)-盒2(sox2)和/或c-myc。产生多能干细胞可以包括用以下的基因转导细胞：oct3/4、oct4、klf4、klf1、klf2、klf5、sox2、sox1、sox3、sox15、sox17、sox18、c-myc、l-myc、n-myc、tert、sv40大t抗原、hpv16e6、hpv16e7、bmil、lin28、lin28b、nanog、glis1、esrrb和/或esrrg。在某些优选实施例中，产生多能干细胞包括用以下的基因转导细胞：klf4、oct-3/4、oct-4、sox2和c-myc。
转导细胞可以包括用至少一种载体转导细胞，例如其中所述至少一种载体包括klf4、oct-3/4、oct-4、sox2和/或c-myc的基因。载体可以包括质粒、病毒、转座因子或纳米粒子。载体可以是例如质粒载体或病毒载体，如仙台(sendai)病毒载体或腺病毒载体。转导细胞可以包括用至少一种仙台病毒载体转导细胞，例如其中至少一种仙台病毒载体包括klf4、oct-3/4、oct-4、sox2和/或c-myc的基因。
用于从细胞产生多能干细胞的方法为本领域中所熟知，并且包含美国专利申请公开第2011/0223669号和第2013/0065311号中所描述的那些方法；所述公开各自以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，方法包括用以下中的至少一种转化细胞：肝糖合成酶激酶抑制剂、tgfp受体抑制剂、环状amp促效剂、s-腺苷高半胱氨酸水解酶抑制剂和促进组蛋白乙酰化的试剂。
在一些实施例中，方法包括用小分子转化细胞，所述小分子如丙戊酸、bix-01294、sb431412或pd0325901。方法可以包括用丙戊酸、bix-01294、sb431412和pd0325901转化细胞。使用小分子而非核酸从体细胞产生多能干细胞的方法在本领域中也为已知的(参见例如pct专利申请公开第wo2015/003643号()通过引用并入；以及hou,p.等人,《科学(science)》341:651-54(2013))。可以使用一或多种小分子代替或与本文所描述的一或多种基因或其基因产物组合。
在一些实施例中，方法包括用一或多种微rna转化细胞(参见例如美国专利第8,852,941号；以引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，方法包括分化诱导多能干细胞。方法可以包括将ipsc分化为成纤维细胞、b细胞、t细胞、造血细胞、巨噬细胞、单核细胞(monocyte)、单核细胞(mononuclearcell)、树突状细胞、肌细胞、角化细胞、黑色素细胞、脂肪细胞、上皮细胞、表皮细胞、软骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、心肌细胞(cardiaccell)、心肌细胞(cardiomyocyte)、食道细胞、胃细胞、胰脏细胞、肝细胞、卵丘细胞或配子母细胞。用于分化干细胞，如ipsc的方法为本领域所熟知(参见例如美国专利申请公开案第2009/0227032号；以引用的方式并入本文中)。
示例
实例1.收获外周血单核细胞。
用3mlleucoseptm分离培养基(葛莱娜第一生化有限公司(greinerbioone))填充12mlleucoseptm试管。试管在室温下，在1000rcf下离心30秒以使试管中的分离培养基位于多孔障壁下方。
向15ml锥形试管中添加4ml磷酸盐缓冲生理食盐水(pbs；不含钙和镁)。将4ml真空采血系统(vacutainer)中的人类血液颠倒10次以混合血液。接着将血液添加到含有pbs的锥形试管中，并且混合血液和pbs。接着将血液和pbs混合物倒入leucoseptm试管。
leucoseptm试管在labnet离心机中在1250rcf下(或在beckman摇摆斗离心机中在2100rpm下)，在室温下离心30分钟。通过将多孔障壁上方的血浆上清液和富含细胞的部分倒入新的15ml离心管中来收集富含细胞的部分，其含有淋巴细胞和外周血单核细胞。细胞在labnet离心机中，在500rcf下粒化10分钟(或在beckman离心机中，在1100rpm下粒化10分钟)，并且丢弃上清液。
离心块再悬浮于1ml冷冻培养基(含10％dmso的热失活胎牛血清)中。将1ml样品分成两份0.5ml等分试样并且在-80℃冷冻器中冷冻。每份0.5ml等分试样含有约1,000,000个外周血单核细胞。
实例2.转导外周血单核细胞。
用0.5ml扩增培养基洗涤外周血液单核细胞的0.5ml等分试样并放置于15ml锥形小瓶中的。细胞在250rcf下粒化7分钟，并且倾析上清液，在试管中留下约100μl培养基。
制备转导培养基，其含有0.4mlstempro-34lancemedia；5μlhkos；5μlhc-myc；3μlh-klf4；含2μl聚凝胺(polybrene)的水(1mg/ml稀释度)；以及聚凝胺试剂(10mg/ml)。
冷冻的cytotune病毒小瓶放置于37℃浴液中8秒，引起试剂熔融，并且接着放置于4℃冷阻断物中。将病毒混合到pbmc扩增培养基中。
接着，将转导培养基放置于15ml锥形小瓶中以使细胞小球再悬浮。将转导培养基和细胞放置于24孔板的一个孔中并且在5％co2的潮湿氛围中，在37℃下培育过夜。
通过引用的并入
本文中引用的每篇专利、公开的专利申请和非专利参考文献的全部内容都以引用的方式并入本文中。
等效物
所属领域的技术人员顶多使用常规实验即可识别或能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。这类等效物意图由以下权利要求书涵盖。