本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是导致人类死亡的主要疾病，主要治疗方法有手术、放疗和化疗。生物治疗是近年发展起来的、被称为治疗恶性肿瘤的第四种方法，它包括了肿瘤疫苗疗法、肿瘤非特异性免疫疗法、单抗免疫导向疗法、细胞因子疗法、过继细胞免疫疗法、肿瘤基因疗法等。病毒治疗癌症的方法也属于生物治疗范畴，近二十年来发展相当迅速。目前病毒治疗最大的进展之一是利用肿瘤细胞与正常细胞的差异，对某些病毒结构进行改造，使其能选择性地在肿瘤细胞中复制，最终达到杀死肿瘤细胞的目的。这些被改造后的病毒，根据其功能被统称为溶瘤病毒，其来源自腺病毒，疱疹病毒和痘病毒等。目前发现某些野生型病毒也具有在肿瘤细胞中选择性复制而溶瘤的功能。
在中国上市的一种溶瘤病毒注射液的成分是经基因改造的5型腺病毒h101，从而有利于病毒在肿瘤细胞中的复制。h101主要是删除了人5型腺病毒的e1b区55kd和e3区基因片段，具有在肿瘤细胞中特异性复制而最终导致溶瘤的特性。其机理之一是野生型腺病毒基因中e1b区编码的55kd蛋白可以与p53蛋白相结合，从而抑制p53基因对腺病毒的清除作用。由于病毒不能编码产生e1b-55kd蛋白，使得病毒在p53正常的细胞中不能复制。而在p53基因突变的肿瘤细胞中，因无p53基因的抑制作用，所以病毒可以大量复制。此外，e3区基因片段的删除使得病毒在体内易于被免疫系统(例如nk细胞)识别并清除，增加了临床应用的安全性。目前的观点是，不仅仅p53本身的突变，只要p53通路的缺陷都有利于h101的选择性复制。h101通过瘤内注射给药，在肿瘤细胞中大量复制，最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡。
由美国fda批准的一种溶瘤病毒药t-vec的成分是基因工程修饰过了的1型单纯疱疹病毒hsv-1。在t-vec中删除了icp34.5和icp47基因并插入了人免疫激活蛋白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)基因，它可以在肿瘤细胞内复制并表达gm-csf。将其直接注射到黑色素瘤病灶中可造成肿瘤细胞的溶解，从而使肿瘤细胞破裂，并释放出肿瘤源性抗原和gm-csf，加速抗肿瘤的免疫应答。然而据安进公司称，该作用的确切机制尚不清楚。2015年10月27日，fda批准t-vec作为首次手术后复发的黑色素瘤患者不可切除病灶的局部治疗方案。
痘病毒是一类体积较大的病毒，由野生型痘病毒通过基因修饰得到的溶瘤病毒在肿瘤细胞中复制的特异性大大提高。其中，有的溶瘤痘病毒中删除了痘病毒dna中表达胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase(tk))的基因，从而使得该溶瘤病毒不能在正常细胞内复制增殖。与正常细胞不同，肿瘤细胞会合成胸腺嘧啶激酶提供给溶瘤病毒复制使用，因此痘溶瘤病毒可以在肿瘤细胞中大量复制。此外有的溶瘤痘病毒中删除了表达vgf的基因，增强了病毒在肿瘤细胞内的特异增殖，最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡。还有的溶瘤痘病毒中即删除了tk基因又删除了vgf基因。目前痘溶瘤病毒尚未有上市的产品。与腺病毒和疱疹病毒来源的溶瘤病毒相比，痘溶瘤病毒是具有可通过静脉注射全身给药并且到达肿瘤靶点的给药优势的。此外，痘病毒基因组庞大，便于进行有助于提高肿瘤杀伤性的基因修饰。
然而，用溶瘤病毒单独治疗肿瘤的疗效有时并不十分理想，溶瘤病毒与化疗药物联合使用治疗肿瘤时，由于化疗药物对正常细胞同等杀伤，会带来的强烈副作用。
nk细胞(自然杀伤细胞)是人体内的一种非特异性的先天免疫细胞，来源于骨髓，在体内几乎所有器官中都有存在，是表型为cd3阴性cd56阳性的单一细胞，主要有cd16阴性cd56bright(亮)和cd16阳性cd56dim(暗)两种亚型，分别有免疫调节和肿瘤杀伤的体内功效。nk细胞缺乏mhci的免疫抗原簇(组)，因此不会发生针对宿主正常细胞的免疫应激反应(gvhd)。nk细胞的体外培养具有容易质检和可做异体应用的优点。nk细胞在体内含量较t细胞少，但反应时间短，主要起免疫哨兵作用，可直接杀伤癌细胞，尤其是导致复发转移的微小癌变病灶和循环系统肿瘤细胞。nk细胞也可以抑制病毒，例如抑制乙肝病毒和导致宫颈癌的疱疹病毒，还可清除衰老细胞。然而，nk细胞对癌细胞和病毒的杀伤作用是非特异性的，单一使用nk细胞治疗癌症的疗效仍有待提高，目前使用nk与单抗的联合治疗可达到不错的疗效，但是由于单抗具有脱靶的可能，因此其使用有局限性。
目前在肿瘤和/或癌症的免疫治疗中，仍然需要更加有效的治疗方案和由此开发出的药物。
技术实现要素：
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种药物组合物，其中该药物组合物的活性成分包括溶瘤病毒和nk细胞，所述溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；优选的是，该药物组合物的活性成分由所述溶瘤病毒和nk细胞组成。
(2)根据(1)所述的药物组合物，其中所述溶瘤病毒和所述nk细胞各自独立地存在于所述药物组合物中而互不混合。
(3)根据(1)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含临床施用剂量的所述溶瘤病毒，并且所述药物组合物包含1×109至3×109个细胞/天剂量的所述nk细胞。
(4)根据(1)所述的药物组合物，其中所述溶瘤病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；优选地，所述溶瘤病毒选自具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
(5)根据(1)所述的药物组合物，其中所述nk细胞选自自体nk细胞和异体nk细胞；优选地，所述nk细胞为经体外扩增得到的自体nk细胞或经体外扩增得到的异体nk细胞。
(6)根据(1)所述的药物组合物，其中所述溶瘤病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述nk细胞通过静脉给药。
(7)根据(1)所述的药物组合物，其中该药物组合物的活性成分包括溶瘤病毒h101和1×109至3×109个细胞/天剂量的所述nk细胞；优选的是，该药物组合物的活性成分由溶瘤病毒h101和1×109至3×109个细胞/天剂量的所述nk细胞组成。
(8)根据(1)-(7)所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
(9)根据(8)所述的应用，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
(10)一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括分别独立地装有溶瘤病毒和nk细胞的独立容器，以及载明给药时机和给药方式的说明书；所述溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。
(11)根据(10)所述的药盒，其中所述装有溶瘤病毒的独立容器包含临床施用剂量的所述溶瘤病毒，并且所述装有nk细胞的独立容器包含1×109至3×109个细胞/天剂量的所述nk细胞。
(12)根据(10)所述的药盒，其中所述溶瘤病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；优选地，所述溶瘤病毒选自具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
(13)根据(10)所述的药盒，其中所述nk细胞选自自体nk细胞和异体nk细胞；优选地，所述nk细胞为经体外扩增得到的自体nk细胞或经体外扩增得到的异体nk细胞。
(14)根据(10)所述的药盒，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
(15)根据(10)所述的药盒，其中所述溶瘤病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述nk细胞通过静脉给药。
(16)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：
1)对肿瘤和/或癌症患者施用溶瘤病毒，该溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；
2)在施用所述溶瘤病毒之后的第24小时至48小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用nk细胞。
(17)根据(16)所述的方法，其中所述溶瘤病毒选自具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；优选地，所述溶瘤病毒选自具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
(18)根据(16)所述的方法，其中所述nk细胞选自自体nk细胞和异体nk细胞；优选地，所述nk细胞为经体外扩增得到的自体nk细胞或经体外扩增得到的异体nk细胞。
(19)根据(16)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病。
(20)根据(16)所述的方法，其中所述溶瘤病毒的施用剂量为临床施用剂量，每天1次，连续施用1-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1×109至3×109个细胞/天剂量，每天1次，连续施用1-6天。
(21)根据(16)所述的方法，其中所述溶瘤病毒的施用剂量为临床施用剂量，每2天1次，连续施用2-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1×109至3×109个细胞/天剂量，每2天1次，连续施用2-6天。
(22)根据(16)所述的方法，其中所述溶瘤病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述nk细胞通过静脉给药。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明首次提出将溶瘤病毒与nk细胞联用以治疗肿瘤和/或癌症的构思，基于该构思而提供的药物组合物和方法能够充分发挥溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥nk细胞杀伤肿瘤细胞的功能，并且巧妙地利用了溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制的特点，使得含有溶瘤病毒的肿瘤细胞成为了nk细胞的特异性靶标，从而进一步增强了nk细胞的肿瘤杀伤作用。本发明发现仅将溶瘤病毒与nk细胞联用产生协同效果。此外，溶瘤病毒与nk细胞均有识别肿瘤细胞的特性，对正常细胞基本不会造成杀伤，两者的联合使用在安全性和疗效性上都有显著的优势。
进一步地，本发明通过理论探索和实验研究，使得溶瘤病毒和nk细胞各自的施用剂量、施用顺序和施用间隔能够使两者的联合施用达到最大效率的协同作用，同时避免了两者之间的相互制约，从而达到有效地治疗肿瘤和/或癌症的效果。
附图说明
图1示出本申请试验例1中nk细胞对a549细胞杀伤剂量试验的结果。
图2示出本申请试验例2中h101对a549细胞杀伤剂量试验的结果。
图3示出本申请实施例1中h101/nk细胞联合杀伤实验的结果。
图4示出本申请对比例1中h101与nk细胞同时联合给药的结果。
图5示出本申请实施例1中h101/nk细胞联合杀伤实验与对比例1中h101与nk细胞同时联合给药的结果的比对图。
图6示出本申请对比例2中h101与nk细胞反向联合给药的结果。
图7示出本申请对比例3中h101/nk细胞联合给药对正常细胞杀伤作用的结果。
图8示出本申请实施例2中联合给药实验的剂量爬坡实验的结果，其中连接方块的曲线代表先h101后nk给药杀伤a549细胞的结果；连接三角形的曲线代表h101和nk同时给药杀伤a549细胞的结果；连接圆形的曲线代表先nk后h101给药杀伤a549细胞的结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤细胞”、“癌细胞”涵盖本领域通常认为的含义。
人体是一个复杂的系统，它是由呼吸、循环、消化等十大系统组成，这些系统协调配合，使人体内各种复杂的生命活动能够正常进行。系统化思考就是从整体观出发，把药物作用、疾病、系统和人体的相互联系、相互作用进行综合考察。
当前很多非细胞毒性抗肿瘤药物，在联合化疗治疗肿瘤时，患者的长期生存结果都不甚理想，其原因是缺少了系统思维的考虑。例如，当肿瘤发生后，机体可通过多种免疫效应机制发挥抗肿瘤作用，机体的抗肿瘤机制包括细胞免疫和体液免疫两个方面。它们联系密切，相互影响，涉及多种免疫效应分子和效应细胞。一般认为，细胞免疫在抗肿瘤过程中起到主导作用，体液免疫在某些情况下起协同作用。然而传统化疗主要是干扰rna或dna合成以及有丝分裂等，主要针对生长快速的细胞，在清除肿瘤细胞的同时也打击了人体正常的免疫系统，随着机体免疫力被摧跨，肿瘤细胞势必“抬头”。所以，很多靶向类非细胞毒性抗肿瘤药物，在联合化疗放疗时，应特别注意如何合理安排放化疗的顺序和强度，最大限度的保存机体免疫功能，这是提高疗效的关键。
在上述系统化思维的基础上，本发明认为可以采用其它提高机体免疫的方法，通过系统组合各种治疗手段，以最大可能地提高综合疗效。因此，本发明首次提出了将溶瘤病毒与nk细胞联用以治疗肿瘤和/或癌症的方案。特别是，本发明仅将溶瘤病毒与nk细胞联用就能够产生协同效果。
因此，本发明提供了一种药物组合物，其中该药物组合物的活性成分包括溶瘤病毒和nk细胞，所述溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。优选的是，该药物组合物的活性成分由所述溶瘤病毒和nk细胞组成。
优选地，所述溶瘤病毒和所述nk细胞各自独立地存在于所述药物组合物中而互不混合。
所有溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞的机制都大体相似，通过瘤内注射或静脉给药的方式，溶瘤病毒与肿瘤细胞接触，感染进入肿瘤细胞内，由于溶瘤病毒的特性是，其主要在肿瘤细胞内复制增殖，而在正常细胞内低复制低表达或不复制，因此被感染的肿瘤细胞中会出现大量的溶瘤病毒，造成肿瘤细胞的溶解和死亡。肿瘤细胞的溶解会释放出大量的肿瘤抗原和增殖的溶瘤病毒，抗原会进一步激活体内的免疫系统，刺激体内的nk细胞和t细胞继续攻击尚未死亡的肿瘤细胞，同时新的溶瘤病毒会继续感染尚未被感染的肿瘤细胞。
nk细胞是广谱型杀伤肿瘤细胞的免疫细胞，nk细胞可以辨别肿瘤细胞与正常细胞的区别。nk通过与肿瘤细胞接触，识别确认其为非正常细胞，然后通过受体识别、抗体靶向识别(adcc)、颗粒酶分泌、穿孔素分泌和分泌干扰素间接杀伤等多种协同手段，达到杀死肿瘤细胞的效果。体外实验显示，一个健康的nk细胞在生命期内可以连续杀死27个肿瘤细胞。
nk细胞还具有抗病毒的功能。当正常细胞感染了病毒后，随着病毒的大量复制，细胞体现出衰老病变，体现在细胞膜上的蛋白簇的组成发生变化，在这个过程中，nk细胞就可以敏锐而高效地识别被感染的细胞，通过类似于杀伤肿瘤细胞的上述手段，杀死被感染的细胞，从而达到抑制病毒复制增殖的目的。随后在抗原刺激和干扰素等因子的作用下，其它免疫细胞会持续作用，抵抗病毒。
本发明考虑了溶瘤病毒和nk细胞各自的特点，巧妙地将其联用，在联用时，nk细胞的抗病毒机制对于被溶瘤病毒感染的肿瘤细胞同样适用，并且与其抗肿瘤机制互补。此外，联用还使得含有溶瘤病毒的肿瘤细胞成为了nk细胞的特异性靶标，从而增强了nk细胞的肿瘤杀伤作用。溶瘤病毒选择性地在癌细胞内增殖，在胞内起作用杀伤癌细胞，同时能够导致癌细胞膜上的蛋白受体簇发生变化，增强nk细胞对癌细胞的识别，nk细胞在癌细胞外攻击，两者联合起来协同杀伤癌细胞，具有更好的治疗效果。
单独的野生型病毒与nk细胞之间具有互相制约的作用。一方面，病毒会通过刺激nk表面的kir类受体，抑制nk的活性，从而逃脱nk的抗病毒杀伤；另一方面，nk除了识别并杀死被病毒感染的细胞，从而抑制病毒的增殖外，还可以直接分泌干扰素，抑制病毒活性。然而，由于很多溶瘤病毒都经过基因修饰，一方面可增强感染肿瘤细胞的特异性，另一方面减少了对包括nk细胞在内的免疫细胞的抑制。
本发明所述的溶瘤病毒包括具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。所述具有溶瘤作用的经基因突变的病毒包括(但不限于)：腺病毒(adenovirus)、痘病毒(也称痘苗病毒(vacciniavirus))、单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus(hsv))、麻疹病毒(measlesvirus)、塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)、水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)和逆转录病毒(retrovirus)；所述具有溶瘤作用的野生型病毒包括(但不限于)：呼肠孤病毒(reovirus)、水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)、脊髓灰质炎病毒、塞内卡谷病毒(senecavalleyvirus)、埃可型肠道病毒(echoenterovirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、新城疫病毒(newcastlediseasevirus)和马拉巴病毒(marabavirus)。
所述腺病毒包括(但不限于)：人5型腺病毒或人嵌合型腺病毒；具体包括(例如)：onyx-015(可得自onyxpharmaceuticals公司)、h101(可得自上海三维生物技术有限公司)、ad5-ycd/muttksr39rep-hil12(可得自henryfordhealthsystem公司)、cg0070(可得自coldgenesys公司)、dnx-2401(可得自dnatrix公司)、obp-301(可得自oncolysbiopharma公司)、oncos-102(可得自targovaxoy公司/oncostherapeutics公司)、coload1(可得自psioxustherapeutics公司)、vcn-01(可得自vcnbiosciences公司)、prostataktm(可得自advantagene公司)等。
所述痘病毒包括(但不限于)：pexa-vac(可得自jennerexbiotherapeutics公司)、jx-963(可得自jennerexbiotherapeutics公司)、jx-929(可得自jennerexbiotherapeutics公司)、vsc20(制备方法可参见科技文献：“mccart,ja,etal.systemiccancertherapywithatumor-selectivevacciniavirusmutantlackingthymidinekinaseandvacciniagrowthfactorgenes.cancerres(2001)61:8751–8757.”)、gl-onc1(可得自genelux公司)等。
所述单纯疱疹病毒包括(但不限于)：hsv-1、hsv-2型单纯疱疹病毒；具体包括(例如)：
上述病毒的具体例子如下表1所示。
表1本发明所述的溶瘤病毒列表
本发明所述的nk细胞包括自体nk细胞和异体nk细胞。所述nk细胞可以为经体外扩增得到的nk细胞。nk细胞的大规模体外扩增培养技术是已知的，并且已经基本成熟(参见(例如)以下科技文献：“somanchiss,leeda.exvivoexpansionofhumannkcellsusingk562engineeredtoexpressmembraneboundil21.methodsmolbiol.2016；1441:175-93.”或“phanmt,leesh,kimsk,chod.expansionofnkcellsusinggeneticallyengineeredk562feedercells.methodsmolbiol.2016；1441:167-74.”)。临床数据证实自体nk细胞、半相合异体nk细胞(属于异体nk细胞)、以及脐血制备nk细胞回输人体后均无毒副作用，无长期依赖性，安全有效。
在本发明的所述联用治疗方案中，本发明进一步探索优化了溶瘤病毒和nk细胞各自的施用剂量、施用顺序和施用间隔，这几点是至关重要的，其决定了溶瘤病毒的抗肿瘤疗效、nk细胞的抗肿瘤疗效、以及两者对肿瘤细胞的最佳协同杀伤。
因此，优选地，所述药物组合物包含临床施用剂量的所述溶瘤病毒，并且所述药物组合物包含1×109-3×109个细胞/天剂量的所述nk细胞。对于不同的溶瘤病毒，可以采用不同的优选临床剂量范围，例如表1所述的那样。
所述溶瘤病毒可采用其各自的本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
nk细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物的活性成分包括溶瘤病毒h101和1×109至3×109个细胞/天剂量的所述nk细胞；优选的是，该药物组合物的活性成分由溶瘤病毒h101和1×109至3×109个细胞/天剂量的所述nk细胞组成。
本领域的技术人员可以理解，本发明的药物组合物还可包含合适的可药用的辅料。
本发明的药物组合物还可以包含本领域已知的其它活性成分，例如白细胞介素-2(il-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、干扰素-γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)等。
优选的是，本发明的药物组合物不包含硼替佐米。
本发明的药物组合物可以用于治疗多种肿瘤和/或癌症，包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。
本发明的药物组合物的施用方法为，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述溶瘤病毒，然后，在施用所述溶瘤病毒之后的第24-48小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述nk细胞。在本发明的一个优选实施方案中，所述溶瘤病毒的施用剂量为临床施用剂量，每天1次，连续施用1-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1×109至3×109个细胞/天剂量，每天1次，连续施用1-6天。在本发明的另一个优选实施方案中，所述溶瘤病毒的施用剂量为临床施用剂量，每2天1次，连续施用2-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1×109至3×109个细胞/天剂量，每2天1次，连续施用2-6天。无论本发明采用上述何种实施方案或其它实施方案，只要满足在施用所述溶瘤病毒之后的第24小时至48小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用nk细胞的条件即可。其中之后溶瘤病毒的施用和nk细胞的施用可以是间隔给药方式(例如，第1天施用溶瘤病毒，第2天施用nk细胞，第3天施用溶瘤病毒，第4天施用nk细胞…以此类推)；或依次给药方式(例如，第1天施用溶瘤病毒，第2天依次施用溶瘤病毒和nk细胞，第3天依次施用溶瘤病毒和nk细胞，第4天依次施用溶瘤病毒和nk细胞…以此类推)；或其它给药方式(例如首先施用溶瘤病毒，每天1次，连续施用1-6天，之后间隔24-48小时再施用nk细胞，每天1次，连续施用1-6天)。在本发明的一个优选实施方案中，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述溶瘤病毒，所述溶瘤病毒的施用剂量为临床施用剂量，施用1次；并且在施用所述溶瘤病毒之后的第24小时至48小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述nk细胞，所述nk细胞的施用剂量为1×109至3×109个细胞/天剂量，施用1次。对于不同的溶瘤病毒，可以采用不同的优选临床剂量范围，例如表1所述的那样。
溶瘤病毒能够在肿瘤细胞中选择性复制，经过一定时间达到峰值。本发明的发明人发现，在经过一段时间的复制之后，肿瘤细胞里的溶瘤病毒会促进nk细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此，本发明提出的溶瘤病毒和nk细胞的施用间隔实现了两者作用峰值的双峰重叠。
本发明还提供了本发明所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。
本发明还提供了一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括分别独立地装有本发明所述的溶瘤病毒和本发明所述的nk细胞的独立容器，以及载明给药时机和给药方式的说明书，所述溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制。优选的是，该药盒由分别独立地装有本发明所述的溶瘤病毒和本发明所述的nk细胞的独立容器组成，以及载明给药时机和给药方式的说明书。
所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。
优选地，所述装有溶瘤病毒的独立容器包含临床施用剂量的所述溶瘤病毒，并且装有nk细胞的独立容器包含1×109-3×109个细胞/天剂量的所述nk细胞。对于不同的溶瘤病毒，可以采用不同的优选临床剂量范围，例如表1所述的那样。
所述溶瘤病毒可采用其各自的本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
所述nk细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。
本发明还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：
1)对肿瘤和/或癌症患者施用本发明所述的溶瘤病毒，该溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；
2)在施用所述溶瘤病毒之后的第24-48小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用本发明所述的nk细胞。
所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。
在本发明的一个优选实施方案中，所述溶瘤病毒的施用剂量为临床施用剂量，每天1次，连续施用1-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1×109至3×109个细胞/天剂量，每天1次，连续施用1-6天。在本发明的另一个优选实施方案中，所述溶瘤病毒的施用剂量为临床施用剂量，每2天1次，连续施用2-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1×109至3×109个细胞/天剂量，每2天1次，连续施用2-6天。无论本发明采用上述何种实施方案或其它实施方案，只要满足在施用所述溶瘤病毒之后的第24小时至48小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用nk细胞的条件即可。其中之后溶瘤病毒的施用和nk细胞的施用可以是间隔给药方式(例如，第1天施用溶瘤病毒，第2天施用nk细胞，第3天施用溶瘤病毒，第4天施用nk细胞…以此类推)；或依次给药方式(例如，第1天施用溶瘤病毒，第2天依次施用溶瘤病毒和nk细胞，第3天依次施用溶瘤病毒和nk细胞，第4天依次施用溶瘤病毒和nk细胞…以此类推)；或其它给药方式(例如首先施用溶瘤病毒，每天1次，连续施用1-6天，之后间隔24-48小时再施用nk细胞，每天1次，连续施用1-6天)。在本发明的一个优选实施方案中，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述溶瘤病毒，所述溶瘤病毒的施用剂量为临床施用剂量，施用1次；并且在施用所述溶瘤病毒之后的第24小时至48小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述nk细胞，所述nk细胞的施用剂量为1×109至3×109个细胞/天剂量，施用1次。对于不同的溶瘤病毒，可以采用不同的优选临床剂量范围，例如表1所述的那样。
可以根据实际情况和需要对患者进行一次或多次本发明的治疗肿瘤和/或癌症的方法。
所述溶瘤病毒可采用其各自的本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
所述nk细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
例子
以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。
以下例子中所用的材料如下：
1.肿瘤细胞
a549人非小细胞肺癌细胞、hepg-2人肝癌细胞、u251人脑胶质瘤细胞等来源于中国国家实验细胞资源共享平台。细胞培养为正常培养环境dmem+10％fbs，胎牛血清fbs购自gibco公司。huvec人原代脐静脉内皮细胞及其培养体系均来源于德国allcells公司。
2.nk细胞
采用本领域常规的方法，用采血针穿刺肘部静脉，取健康人的外周静脉血，提取全免疫细胞pbmc。使用体外培养体系(培养试剂盒)，扩增nk细胞，最终nk细胞纯度达到90％，nk细胞存活活性达到90％，nk细胞体外杀伤率达到85％。培养试剂盒购自杭州鼎云技术有限公司。
3.溶瘤病毒(ov)
溶瘤腺病毒h101来源于上海三维生物技术有限公司。
以下例子中所用的细胞计数方法如下：
台盼蓝染色法计数：将细胞用pbs洗后，用胰蛋白酶消化，细胞悬浮在pbs中，加入终浓度为0.04％(w/v)的台盼蓝染液，显微镜下计数，死细胞会染成蓝色，活细胞为透明无色。取活细胞数为最终数据。
试验例1：nk对a549细胞杀伤剂量试验
取a549细胞种入培养板，铺满30％，在dmem+10％fbs环境中，在37℃、5％co2下孵育48小时后，换新鲜dmem+10％fbs，加入nk细胞，效靶比(e:t，细胞个数比)分别为nk:a549＝20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1。各效靶比的杀伤时间分别为24小时、48小时、72小时，在37℃、5％co2下进行。此后对存活的a549细胞进行台盼蓝染色计数，与不加nk细胞的对照组对比统计nk对a549的杀伤率。杀伤剂量曲线x轴为效靶比，y轴为抑制率(inhibitionrate(ir))的百分比数值。取拐点处的效靶比为联合杀伤实验中nk的使用剂量。杀伤时间为48小时的结果如图1所示，拐点处的效靶比为5:1，抑制率为20％左右，剂量合适。杀伤24小时的结果远较48小时弱，72小时的效果与48小时的相仿。因此，nk细胞杀伤最佳时间为约48小时。
试验例2：h101对a549细胞杀伤剂量测试
取a549细胞种入培养板，铺满30％，在dmem+10％fbs环境中，在37℃、5％co2下孵育24小时后，换新鲜无血清dmem，加入h101，剂量分别为moi＝20、10、5、2.5、1.25。感染时间为6小时，在37℃、5％co2下进行，然后弃去培养基，用pbs清洗后换入dmem+10％fbs，继续培养72小时。此后对存活的a549细胞进行台盼蓝染色计数，与不加h101的对照组对比统计h101对a549的杀伤率。杀伤剂量曲线x轴为moi(multiplicityofinfection(感染复数，也即，病毒与细胞个数比))，y轴为抑制率的百分比数值。取拐点处的moi为联合杀伤实验中h101的使用剂量(moi＝5，抑制率为50％左右)。
由图2可知，h101对a549细胞的杀伤剂量最佳为约moi＝5。
试验例3：h101对a549细胞感染时间测试
测试了h101对a549的感染时间，以得到最佳感染效果。取a549细胞种入培养板，铺满30％，在dmem+10％fbs环境中，在37℃、5％co2下孵育24小时后，在dmem无血清环境下加入h101(moi＝5)，分别感染2小时、6小时、或在dmem+10％fbs血清环境下感染24小时，感染在37℃、5％co2下进行。洗去病毒，加入新鲜dmem+10％fbs，在37℃、5％co2下分别培养24小时、48小时、72小时，此后对存活的a549细胞进行台盼蓝染色计数，比较对a549的抑制率。
由结果可知，h101对a549细胞的感染时间最佳为无血清环境下约6小时，h101在细胞内的增值时间最佳为约24小时。
实施例1：h101/nk联合杀伤实验
由上述试验例确定，h101对a549细胞的杀伤剂量最佳为约moi＝5；h101对a549细胞的感染时间最佳为约6小时；h101在细胞内的增值时间最佳为约24小时；nk细胞对a549细胞的杀伤剂量最佳为效靶比nk:a549为约5:1；nk细胞对a549细胞的杀伤时间最佳为约48小时。
取a549细胞种入培养板，铺满30％，在dmem+10％fbs环境中，在37℃、5％co2下孵育24小时，在dmem的无血清环境下加入moi＝5的h101，感染6小时，在dmem+10％fbs环境中，在37℃、5％co2下培养24小时。之后换新鲜dmem+10％fbs，加入nk细胞(效靶比nk:a549＝5:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活a549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组a549细胞，不加病毒，不加nk，作为对照组；一组在相应时间点加h101，但不加nk，作为h101组；一组在相应时间点加nk，但不加h101，作为nk组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图3所示(其中x轴为不同组别，y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用h101和nk细胞(溶瘤病毒在先施用，nk细胞在后施用)对a549杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约78％。而本实验中单用h101的抑制率为约41％，单用nk细胞的抑制率为约20％。
与上述实验方法类似，只是加入h101并感染6小时后的培养时间为48小时而不是24小时，最后得到的结果也显示联合使用h101和nk细胞(溶瘤病毒在先施用，nk细胞在后施用)对a549杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约80％。
对比例1：同时联合给药
取a549细胞种入培养板，铺满30％，在dmem+10％fbs环境中，在37℃、5％co2下孵育24小时，同时加入h101(moi＝5)和nk细胞(效靶比nk:a549＝5:1)，继续孵育72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活a549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组a549细胞，不加病毒，不加nk，作为对照组；一组在相应时间点加h101，但不加nk，作为h101组；一组在相应时间点加nk，但不加h101，作为nk组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图4所示(其中x轴为不同组别，y轴为相应的抑制率的百分比数值)，本实验中单用h101的抑制率为约47％，单用nk细胞的抑制率为约16％，与单独施用一种药的抑制率相比，nk与h101同时施用的抑制率提高，抑制率约为55％，但是与实施例1相比，并没有显示出显著的协同效果，两者的对比图见图5(其中x轴为不同组别，y轴为相应的抑制率的百分比数值)。
由上述结果可知，1)h101和nk细胞联合施用的治疗效果比单独施用h101或nk细胞的效果好；2)h101和nk细胞联合给药的时间点不同会对治疗效果带来显著差异，当h101和nk细胞同时给药时，联合治疗的效果并没有起到协同效果，而当先施用h101，约24小时-48小时后再施用nk细胞时，治疗显示出显著的协同效果。
对比例2：联合给药顺序对比
取a549细胞种入培养板，铺满30％，在dmem+10％fbs环境中，在37℃、5％co2下孵育24小时，在新鲜dmem+10％fbs环境中加入nk细胞(效靶比nk:a549＝5:1)，在37℃、5％co2下孵育24小时。之后加入moi＝5的h101，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活a549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组a549细胞，不加病毒，不加nk，作为对照组；一组在相应时间点加h101，但不加nk，作为h101组；一组在相应时间点加nk，但不加h101，作为nk组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图6所示(其中x轴为不同组别，y轴为相应的抑制率的百分比数值)，先施用nk细胞再施用h101的反向联合给药的抑制率约为38％，单用h101的抑制率为约35％，单用nk细胞的抑制率为约6％，反向联合给药的杀伤效果并没有出现协同效果。
对比例3：对正常细胞联合给药
取huvec细胞(脐静脉内皮细胞)种入铺有明胶的培养板，铺满30％，在其适宜的完全培养基中(huvec细胞及完全培养基购自allcells公司，货号h-003)，在37℃、5％co2下孵育24小时，加入moi＝5的h101，感染6小时，在其完全培养基环境中，在37℃、5％co2下培养24小时。之后换新鲜完全培养基，加入nk细胞(效靶比nk:huvec＝5:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活huvec细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组huvec细胞，不加病毒，不加nk，作为对照组；一组在相应时间点加h101，但不加nk，作为h101组；一组在相应时间点加nk，但不加h101，作为nk组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图7所示(其中x轴为不同组别，y轴为相应的抑制率的百分比数值)，nk和h101联用对人正常原代细胞huvec无杀伤作用。单用h101或单用nk对人正常原代细胞huvec也无杀伤作用。
实施例2：联合给药实验的剂量爬坡实验
取a549细胞种入培养板，铺满30％，在dmem+10％fbs环境中，在37℃、5％co2下孵育24小时，第一组在dmem的无血清环境下加入h101(moi＝5)感染6小时，换新鲜dmem+10％fbs后，孵育24小时后，分别加入不同剂量的nk细胞(e:t＝1:1、5:1、10:1、15:1、或20:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活a549细胞进行台盼蓝染色计数；第二组同时加入h101(moi＝5)和nk细胞，nk细胞剂量分别为e:t＝1:1、5:1、10:1、15:1、或20:1，继续孵育72小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活a549细胞进行台盼蓝染色计数；第三组先加入不同剂量的nk细胞(e:t＝1:1、5:1、10:1、15:1、或20:1)，孵育24小时后，加入同样剂量的h101(moi＝5)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活a549细胞进行台盼蓝染色计数。实验中保留一组a549细胞，不加病毒，不加nk，作为对照组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
结果如图8所示(其中x轴为不同组别，y轴为相应的抑制率的百分比数值)，联合治疗中nk剂量和杀伤效果是正相关的，在h101和nk施用剂量一致的情况下，先施用h101后施用nk的治疗方案的杀伤效果远大于同时施用h101和nk或先施用nk后施用h101的治疗方案。
实施例3：h101与nk细胞联用对其它肿瘤细胞的效果
h101与nk细胞联用，对于除了a549以外的其它肿瘤细胞也显示出显著的协同抑制效果。
实施例4：其它溶瘤病毒与nk细胞联用的效果
用除了h101以外的其它溶瘤病毒与nk细胞联用，对于a549和其它肿瘤细胞也显示出显著的协同抑制效果。