本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒变异株灭活疫苗及其应用。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）系冠状病毒科冠状病毒属成员，可引起以呕吐、腹泻和脱水为特征的猪肠道传染性疾病。各种年龄的猪均易感，但哺乳仔猪受害最严重，死亡率可高达100%。近几年我国多省爆发PED，给养猪业造成了严重的经济损失。目前尚无特效药物治疗猪流行性腹泻，该病的防控以疫苗预防接种为主。国外使用的疫苗主要为韩国弱毒株，国内主要是哈尔滨兽医研究所研制的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联灭活苗等，此疫苗中使用的毒株为猪流行性腹泻病毒PEDV CV777株，该毒株分离年代较早，与新变异株相比缺乏广泛的免疫原性，因此筛选新毒株，制备行猪流行腹泻疫苗用于预防猪流行性腹泻是十分必要的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒变异株灭活疫苗的制备方法以及该灭活疫苗免疫怀孕母猪后的保护效果，从而弥补现有疫苗的不足。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术手段：
本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒变异株灭活疫苗，是由腹泻病毒变异株PEDV/CH/BJ/2014株灭活后制备取得。
所述灭活疫苗中病毒含量≥107TCID50/mL。
本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒变异株灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：腹泻病毒经接种Vero细胞（非洲绿猴肾细胞），于37℃ 5% CO2培养箱中培养，细胞病变达到80%以上时收获病毒液、浓缩，经0.2%的β-丙内酯于4℃灭活24至48小时后得到疫苗原液，加入ISA201VG水包油包水双相佐剂乳化即得该病毒疫苗。
本发明的猪流行性腹泻病毒PEDV/CH/BJ/2014株，于2014年12月4日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.10111。
本发明的PEDV/CH/BJ/2014株用于制备预防猪流行性腹泻的疫苗。与现有的病毒比较，本发明所筛选的猪流行性腹泻病毒PEDV/CH/BJ/2014株制备的疫苗免疫原性好，抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长；免疫剂量小，在产前30天前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。
附图说明
图1：PEDV灭活疫苗免疫断奶仔猪中和抗体测定结果柱形图，其中黑色柱形为实验组，灰色柱形为对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。
实施例1：猪流行性腹泻病毒PEDV/CH/BJ/2014株的筛选
1 猪流行性腹泻病毒PEDV/CH/BJ/2014株的分离和鉴定
在流行病学调查时，从北京某猪场送检的腹泻仔猪小肠内容物中分离到1株猪流行性腹泻病毒（命名为PEDV/CH/BJ/2014株），猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测阳性，盲传2代细胞病变，第3代出现规律、稳定的细胞病变，第5代时病毒含量可达到5×105TCID50/mL，能够被抗猪流行性腹泻病毒特异性血清中和，将猪流行性腹泻病毒PEDV/CH/BJ/2014株，于2014年12月4日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.10111。
2 用分离得到的PEDV/CH/BJ/2014株制备疫苗
2.1 病毒液的制备
按照常规方法制备Vero细胞（Vero细胞购自美国ATCC），生长液为含10%新生牛血清的DMEM，培养至细胞长成单层时接种PEDV/CH/BJ/2014病毒；取PEDV/CH/BJ/2014毒株（5×105TCID50/mL）按1%接种长势良好的Vero单层细胞，置37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的 DMEM作为维持液继续培养；接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达80%以上时收获，反复冻融三次，4℃ 8000 rpm离心20分钟去除细胞碎片，收集上清；测定收集的病毒液毒价为2×107TCID50/mL，同时按照《中国兽药典》对收集的病毒液进行无菌检验，结果为阴性。病毒液经超滤浓缩管20倍浓缩后，加入0.2%的β-丙内酯于4℃灭活24至48小时得到疫苗原液，灭活期间需间隔2小时摇匀一次；
病毒灭活检测：吸取灭活后的病毒液接种健康Vero细胞，0.5 mL/T25瓶，共接2瓶，同时设立1瓶阴性细胞对照；37℃ 5% CO2培养3日后将培养物收获，经-80℃冻融3次后，4℃ 8000 rpm离心5分钟取上清进行接种健康Vero细胞，如此传代3次若无病变产生说明灭活彻底，否则不合格。
乳化：分别称取等质量的抗原与ISA201VG双相佐剂，将水相抗原和佐剂均放置到水浴锅中预热至36℃。调整磁力搅拌器温度至32℃，将佐剂加入到无菌玻璃烧杯中，调整转速为350 rpm。在磁力搅拌器热托盘上32℃将水相抗原加入到搅拌的佐剂中，搅拌5分钟。将乳化液转移至20℃冷浴锅中冷却1小时，期间避免移动或搅拌。
3 疫苗检验方法及结果
3.1 性状检验 3批灭活疫苗外观呈淡黄色或乳白色乳胶状，久置后无分层。
3.2 无菌检验 3批灭活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。结果见表1。
3.3 支原体检验 3批灭活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。结果见表1。
3.4 外源病毒检验 3批灭活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒等污染。结果见表1。
3.5 安全检验 取猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的3日龄猪15头，随机分成3组，每组5头，肌注10头份疫苗，临床观察14日，均5/5健活，未见不良反应发生。
表1 3批灭活疫苗检验结果
实施例2 猪流行性腹泻灭活苗的安全试验
1 实验方法
对妊娠母猪的超剂量试验 取产前4-6周猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪12头，随机分成3组，第1、2、3组分别肌肉注射201601、201602、201603批猪流行性腹泻灭活苗各2头份/头，第4组不进行注射作对照组，观察至母猪产仔。
2 结果
超剂量试验结果 3批疫苗免疫组9头妊娠母猪与对照组比较，采食、饮水、妊娠产仔均未见异常，注射部位均未见不良反应。
实施例3 猪流行性腹泻灭活疫苗的效力试验
1 实验方法
取产前5周猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的相同预产期妊娠母猪15头，随机分成5组，每组3头。第1组肌肉注射201601批猪流行性腹泻病毒灭活苗1头份/头；第2组肌肉注射201602批猪流行性腹泻病毒灭活苗1头份/头；第3组肌肉注射201603批猪流行性腹泻病毒灭活苗1头份/头；第4组肌肉注射商品化猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联灭活疫苗1头份/头；第5组肌肉无菌细胞培养液DMEM 4 mL/头作为对照组。
母猪产仔后，每组3日龄仔猪各取15头，均口服猪流行性腹泻强毒PEDV/CH/BJ/2014株 0.5MID/mL(最小感染剂量)2 mL，观察攻毒后仔猪的临床表现，记录7日内发病情况。
2 结果
结果见表2，本发明制备的PEDV变异株灭活疫苗免疫怀孕母猪能有效保护仔猪不受强毒株的感染，保护率可达86.7%~93.3%，显著高于商品化灭活疫苗的保护率（60%）。
表2 免疫母猪所产的仔猪攻毒保护率
实施例4 猪流行性腹泻灭活疫苗的免疫消长规律试验
1 实验方法
选取10头PEDV抗原抗体阴性断奶仔猪，随机分成2组，第1组免疫201601批灭活疫苗；第2组免疫DMEM作为对照。于免疫后7日、14日、21日、35日、49日、84日、112日采集实验猪血清，检测血清中和抗体效价。
2结果
免疫组5头断奶仔猪在免疫后2周均能产生一定水平的中和抗体，随着免疫时间延长抗体水平持续上升，免疫后35日抗体水平可以达到峰值，持续期较长，在免疫后84日抗体水平已经下降，到112日时抗体平均水平仍高于1:32；而对照组仔猪抗体水平始终≤4，结果见附图1。