本发明专利属于微生物技术领域。具体涉及一种具有健胃整肠益生作用的复合微生态制剂及其制备方法。
背景技术：
随着时代的进步，社会的发展速度越来越快。面对着各种生活和工作压力，人们不得不适应时代发展的潮流，紧跟社会发展的步伐。这样快节奏的生活方式给人们的身心健康带来了极大的影响，尤其是饮食和起居的不规律导致现代人普遍患有严重的肠胃疾病，在损害了自己的身体健康的同时，也影响了人们正常的生活和工作。胃肠道菌群是维持人体健康的必要因素，生理条件下胃肠道菌群除具有一定的“定植抗力”外，还可提供维生素，合成消化酶，参与蛋白质的代谢，降解胆固醇，形成胆汁酸，并具有免疫刺激作用和生物拮抗作用，是人体内环境平衡与否的标志。如果机体内外环境发生变化，人体胃肠道就会发生紊乱，导致消化吸收功能减弱，发生胃肠道疾病，表现在胃炎、肠炎、腹泻以及便秘等，甚至会导致免疫力下降等，如不及时调整，会增加胃肠道癌变的几率。为了治疗腹泻、便秘等胃肠道紊乱，临床上常用一些抗生素或者通便药来改善症状，但由于这些药物长期使用会产生耐受性，因此不适宜长期持续服用。最近的研究表明，通过摄取一些益生菌来调节菌群平衡，调整胃肠道内环境，能够有效的改善胃肠道紊乱。因此，益生菌成为腹泻、便秘等胃肠道疾病的辅助补充剂得到重视和应用。
现在市场上的微生态制剂大都数是液体或者粉剂、片剂。液体微生态制剂由于细菌的生长，活菌数很快细菌的死亡就会大量降低；粉剂或者片剂的微生态制剂除芽孢菌类以外，由于空气或者辅料中有水分存在，细菌也会死亡，因而活性也会下降。本发明基于肠道菌群平衡理论基础上研发的一种通过多种有益菌辅以益生元来调节胃肠道菌群，达到恢复正常菌群的目的，来调理胃肠道疾病。本发明还将用于菌种保藏的真空冷冻干燥技术应用在微生态制剂产业化生产，使得制得的复合益生菌处在一种休眠状态，能够长期保持微生物的活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种复合的健胃整肠用的微生态制剂，同时提供其相应的制备方法是本发明的另一目的。
基于上述目的，本发明采取如下技术方案：一种复合的微生态健胃整肠制剂，每1g制剂中含嗜酸乳杆菌≥5×107CFU，地衣芽孢杆菌≥5×107CFU，酿酒酵母≥5×107CFU，冻干保护剂0.1-0.2g。
所述冻干保护剂的质量比为：10-20％脱脂奶粉、5-10％蔗糖，5-10％低聚糖。所述低聚糖包括低聚果糖，低聚麦芽糖，低聚木糖。
一种混合型肠道微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)制备复合菌菌液：
将嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和酿酒酵母分别接种到MRS培养基、LB培养基以及YPD培养基中发酵18-36小时，发酵温度30-40℃，所得各菌含量≥5×108CFU/ml，然后进行按比例混合得混合菌液；
(b)将(a)所获得的菌液加入冻干保护剂和低聚寡糖，将准备好的菌液分装到冻干瓶中，然后进行预冷；
(c)真空冷冻干燥，得成品。
所述的一种微生态健胃整肠制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中所用菌株为嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854，地衣芽孢杆菌CGMCC1.105，酿酒酵母CICC1249；混合液中各菌占总体积比例为20-50％V/V。
所述的一种微生态健胃整肠制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，以质量百分比计，所述冻干保护剂的配方包括：10-20％脱脂奶粉、5-10％蔗糖，5-10％低聚糖。
所述的一种微生态健胃整肠制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，在-70～-80℃下预冻2-4小时。
所述的一种微生态健胃整肠制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，真空冷冻干燥36小时。
所述的一种微生态健胃整肠制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，低聚糖包括低聚果糖，低聚麦芽糖，低聚木糖。
本发明的优点是：将具有健胃、整肠功能的益生菌进行体外单独发酵，然后按照一定的比例进行混合，配以冻干保护剂和低聚糖等益生元，然后进行真空冷冻干燥，能提高细菌在自然状态下的存活率。该复合微生态制剂能以休眠状态的菌体进入到胃肠道，在胃肠道里定制并消耗氧气，创造厌氧环境，低聚糖等益生元能促进有益菌的生长，该复合微生态制剂能有效抑制有害菌的定植，减少有害物质的产生，调节胃肠道内正常菌群的平衡，提高机体的免疫力，保证人体健康。
具体实施方式
以下实施例只为进一步说明本发明，不以任何形式限制本发明，本实施例中所涉及的菌株嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854，地衣芽孢杆菌CGMCC1.105购自中国普通微生物菌种保藏中心，酿酒酵母CICC1249购自中国工业微生物菌种保藏中心。
实施例1
将嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854，地衣芽孢杆菌CGMCC1.105，酿酒酵母CICC1249三种菌株按照斜面、液体种子、液体发酵的顺序进行培养，斜面和液体发酵培养基分别为：嗜酸乳杆菌培养基为MRS培养基，其组成为(W/V)：蛋白陈1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐温80 0.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸三铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，pH 6.2左右；酿酒酵母培养基为YPD培养基，其组成为(W/V)：葡萄糖2％,蛋白胨1％,酵母膏0.5％,固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，pH自然；地衣芽孢杆菌培养基为LB培养基，其组成为：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，pH7.4。将种子液按照5％的接种量接种到发酵培养基中，酵母菌在30℃，嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌在37℃，通气培养24-48h，使得每种菌的菌含量≥109cfu/ml。
将三种菌发酵液按体积百分比20％:30％:50％混合，得复合菌液，加入冻干保护剂该冻干保护剂的配方包括：脱脂乳、蔗糖和低聚果糖，其中，在冻干保护剂中，脱脂乳为10％，蔗糖5％、低聚果糖10％，分装，接下来以-80℃进行预冻4小时，最后冷冻干燥36小时即可。
实施例2
将嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854，地衣芽孢杆菌CGMCC1.105，酿酒酵母CICC1249三种菌株按照斜面、液体种子、液体发酵的顺序进行培养，斜面和液体发酵培养基分别为：嗜酸乳杆菌培养基为MRS培养基，其组成为(W/V)：蛋白陈1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐温80 0.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸三铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，pH 6.2左右；酿酒酵母培养基为YPD培养基，其组成为(W/V)：葡萄糖2％,蛋白胨1％,酵母膏0.5％,固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，pH自然；地衣芽孢杆菌培养基为LB培养基，其组成为：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，pH7.4。将种子液按照5％的接种量接种到发酵培养基中，酵母菌在30℃，嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌在37℃，通气培养24-48h，使得每种菌的菌含量≥109cfu/ml。
将三种菌发酵液按体积百分比30％:30％:40％混合，得复合菌液，加入冻干保护剂该冻干保护剂的配方包括：脱脂乳、蔗糖和低聚果糖，其中，在冻干保护剂中，脱脂乳为10％，蔗糖5％、低聚果糖10％，分装，接下来以-80℃进行预冻4小时，最后冷冻干燥36小时即可。
实施例3
将嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854，地衣芽孢杆菌CGMCC1.105，酿酒酵母CICC1249三种菌株按照斜面、液体种子、液体发酵的顺序进行培养，斜面和液体发酵培养基分别为：嗜酸乳杆菌培养基为MRS培养基，其组成为(W/V)：蛋白陈1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐温80 0.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸三铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，pH 6.2左右；酿酒酵母培养基为YPD培养基，其组成为(W/V)：葡萄糖2％,蛋白胨1％,酵母膏0.5％,固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，pH自然；地衣芽孢杆菌培养基为LB培养基，其组成为：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，pH7.4。将种子液按照5％的接种量接种到发酵培养基中，酵母菌在30℃，嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌在37℃，通气培养24-48h，使得每种菌的菌含量≥109cfu/ml。
将三种菌发酵液按体积百分比50％:30％:20％混合，得复合菌液，加入冻干保护剂该冻干保护剂的配方包括：脱脂乳、蔗糖和低聚果糖，其中，在冻干保护剂中，脱脂乳为10％，蔗糖5％、低聚果糖10％，分装，接下来以-80℃进行预冻4小时，最后冷冻干燥36小时即可。
实施例4按照实施例1制备的复合益生菌制剂与市场上所售益生菌产品保存稳定性比较。市场产品分别选三株口服液，市售高浓缩益生菌菌粉。按常规加速试验法，若将产品置37～40℃、相对湿度75％条件下放置3个月、12个月后,测定菌含量。结果显示本发明所制得的真空冷冻干燥的复合益生菌经过长期保存后，活菌含量仍然很高，结果见表1。
表1益生菌保存性实验
实施例5
复合益生菌制剂对临床急性感染性腹泻的治疗及对肠道菌群的恢复效果。该实验在浙江省丽水人民医院完成，选取2015年6月-2016年3月在医院诊治的急性感染性腹泻患者60例，纳入标准：(1)均有腹泻、腹痛等临床症状，感染性腹泻诊断依据中华人民共和国卫生部颁布的《感染性腹泻诊断标准》(WS271-2007)(2)在患病后48h之内就诊。(3)纳入研究前未服用抗菌药物及微生态调节剂进行治疗。(4)年龄＞18岁，＜60岁。排除标准：(1)慢性腹泻，非感染性腹泻。(2)合并其他感染性疾病。(3)合并免疫系统疾病、恶性肿瘤、严重心肝肾等其他脏器功能障碍性疾病。将患者随机分为复合益生菌组(本发明制剂)、市售金双歧片(双歧杆菌乳杆菌三联活菌片)为对照组1与不使用益生菌组为对照组2，每组20例，结果发现使用复合益生菌组能有效改善腹泻状况(表2)，并能快速恢复肠道菌群(表3)。
表2使用益生菌一天后三组病人的腹泻情况
表3复合益生菌对肠道主要菌含量的影响(1g CFU/g湿便，x±s,n＝5)