一种贝沙罗汀偶合物、其药物组合物及应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及贝沙罗汀偶合物、药物组合物及其在制备预防或治疗皮肤T-细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌抗肿瘤药物和阿尔茨海默病药物中的应用。

背景技术：

贝沙罗汀(Bexarotene)是一种新型的维甲酸类X受体(RXR)选择性激活剂，它可以选择性地与RXR亚单位(RXRα，RXRβ，RXRγ)结合，可以抑制造血系统及鳞细胞恶性肿瘤细胞系的生长，诱导一些恶性肿瘤细胞系的程序化死亡等。贝沙罗汀抑制许多癌细胞的生长，比如前列腺癌、乳腺癌和肺癌细胞等，是一种高效的防癌和治疗癌症的药物，并可降低临床用药的毒性。贝沙罗汀尤其对抑制非小细胞肺癌和治疗皮肤T细胞淋巴瘤和淋巴瘤丘疹病有效。此外，贝沙罗汀在预防或治疗阿尔茨海默病、代谢性疾病方面也有特别效果。但是，贝沙罗汀水溶性很差，口服后生物利用度低，毒副作用明显，限制了该药物在临床上的广泛应用。此外，贝沙罗汀可与血浆蛋白高度结合(99％)，导致在血液循环中的自由药物含量极少，影响药效的发挥。

因此，有必要通过结构修饰，开发新的贝沙罗汀偶合物及其药物组合物，降低与血浆蛋白的结合，提高药效，拓展临床应用。

技术实现要素：

技术问题：本发明提供一种贝沙罗汀偶合物，其药物组合物及应用。通过化学改性的贝沙罗汀偶合物改善贝沙罗汀分子的物化性能，如具有还原敏感降解性，具有更好的水溶性，更低的血浆蛋白结合率，以及在水溶液中组装形成纳米颗粒或脂质体的特性，或者能够与磷脂助剂形成纳米颗粒或脂质体的能力。同时该贝沙罗汀偶合物能有效提高贝沙罗汀的生物利用度以及药效等。

技术方案：本发明的贝沙罗汀偶合物，是具有下列结构式(1)或(2)的化合物或所述化合物药学上可接受的盐：

其中，X是(CH₂)_mOCO(CH₂)_n或(CH₂)_pSS(CH₂)_pOCO(CH₂)_q，m为2～6的正整数，n为1～4的正整数，p为2～4的正整数，q为1～4的正整数。

本发明还提供了一种药物组合物，包括所述的贝沙罗汀偶合物。

进一步的，本发明药物组合物中，还包括药效学上可接受的载体。

进一步的，本发明药物组合物是片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、口服液、悬浮液、乳剂或注射剂、栓剂或贴剂。

进一步的，本发明药物组合物，所述的药物组合物为粒径10-1000纳米的纳米颗粒或脂质体，该药物组合物中还包括助剂。

进一步的，本发明药物组合物中，所述助剂是磷脂或胆固醇。

本发明所述的贝沙罗汀偶合物或与助剂一起在水中自组装成纳米粒，可直接注射或口服，也可经冻干后加入不同的赋形剂，加工成任何一种剂型，包括片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、口服液、悬浮液、乳剂或注射剂、栓剂、贴剂。

本发明还提供了所述贝沙罗汀偶合物在制备治疗皮肤T-细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌抗肿瘤或顽固性手癣药物中的应用。

本发明还提供了所述贝沙罗汀偶合物在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物、代谢性疾病药物中的应用。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本发明的贝沙罗汀偶合物作为一种前药，在水相中溶解度远高于贝沙罗汀。

本发明的贝沙罗汀偶合物易于降解。

本发明的贝沙罗汀偶合物是两亲性化合物，在水相中自组装为纳米粒子，生物相容性、稳定性好。

本发明的贝沙罗汀偶合物在水相中自组装或与磷脂共组装形成纳米脂质体，贝沙罗汀含量最高达到76％(质量)，生物相容性、稳定性好。

本发明的贝沙罗汀偶合物及其药物组合物具有还原敏感性，在肿瘤细胞内易于被高浓度的谷胱甘肽降解释放出原药，比贝沙罗汀有更强的抗肿瘤活性。

本发明的贝沙罗汀偶合物及其药物组合物比贝沙罗汀有更强的抗肿瘤活性。

本发明的贝沙罗汀偶合物及其药物组合物比贝沙罗汀有更好的治疗和/或预防阿尔茨海默病(老年痴呆症)作用。

本发明的贝沙罗汀偶合物及其自组装或与磷脂共组装形成的纳米脂质体与血浆蛋白的结合率远低于贝沙罗汀。

本发明的贝沙罗汀偶合物自组装或与磷脂共组装形成的纳米脂质体易于被肿瘤细胞摄取。

附图说明

图1为贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱的合成路线图。

图2为贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱的合成路线图。

图3为贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱合成路线图。

图4为贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯二甘醇酰甘油磷脂酰胆碱合成路线图。

图5为贝沙罗汀乙二醇己二酰甘油磷脂酰胆碱合成路线图。

图6为贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱合成路线图。

图7贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒(a)动态光散射测量的粒径分布图和(b)透射电镜照片。

图8为贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱结构图。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

本发明的贝沙罗汀偶合物，是具有下列结构式(1)或(2)的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，X是(CH₂)_mOCO(CH₂)_n或(CH₂)_pSS(CH₂)_pOCO(CH₂)_q，m为2～6的正整数，n为1～4的正整数，p为2～4的正整数，q为1～4的正整数。

本发明的药物组合物，是具有结构式(1)或(2)的贝沙罗汀偶合物与药效学上可接受的载体。本发明的药物组合物是片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、口服液、凝胶剂、悬浮液、乳剂或注射剂、栓剂、贴剂。药物组合物是粒径10-1000纳米的纳米颗粒或脂质体，该药物组合物中还包括助剂，所述的助剂是磷脂。

本发明的药物组合物可以注射给药、口服给药、鼻腔给药、肺部吸入给药。

本发明的贝沙罗汀偶合物在制备治疗皮肤T-细胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、牛皮癣、卡波氏肉瘤、前列腺癌、顽固性手癣药物中的应用。

本发明的贝沙罗汀偶合物在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物中的应用。

本发明的贝沙罗汀偶合物能够组装为纳米颗粒或纳米脂质体，具有优良的生物相容性、储存稳定性及降解性。

本发明中提供合成贝沙罗汀-甘油磷脂酰胆碱化合物的方法，以贝沙罗汀或贝沙罗汀取代酯与甘油磷脂酰胆碱(GPC)为反应原料，在催化剂和缚酸剂作用下，采用非质子溶剂，制得维贝沙罗汀偶合物。

以下为制备过程中使用的部分试剂和方法的代号：

DCC N,N'-二环己基碳二亚胺

DMAP 4-二甲氨基吡啶

CDI N,N'-羰基二咪唑

DMSO 二甲亚砜

GPC 磷甘油酰胆碱

DBU 1,5-二氮杂二环[5.4.0]十一-5-烯

Bex 贝沙罗汀

MS 质谱法

TLC 簿层色谱法

药物血浆蛋白结合率的测量方法(药学学报，2010，45(3):343-346)：

平衡透析法将空白透析液浸泡后的透析袋一端折叠用线结扎，将空白血浆2mL加入透析袋，透析袋内留一小空气泡，将透析袋另一端扎紧,使其悬浮于盛有20mL透析外液的试管中，调整透析袋的高度，使其内外液面保持同一水平，并避免透析袋贴壁。透析外液的药物质量浓度分别为2、5和10μg·mL^-1，将该试管于4℃放置至药物扩散平衡。透析结束后，用10％高氯酸溶液检查透析外液是否有蛋白漏出，有漏出者该样品作废。

蛋白结合率测定分别测定透析袋内药物质量浓度A(总质量浓度)和透析外液药物质量浓度B(游离药物质量浓度)，根据公式F＝(A-B)/A计算血浆蛋白结合率。采用Agilent 1100高效液相色谱仪测量药物浓度：Zorbax SB-C18色谱柱(150mm×4.6mm ID，5μm)，流动相为甲醇/水，97/3，流速为1.0ml min-1，柱温25℃，紫外检测波长254nm，柱温为30℃，检测波长为286nm，进样量为10μL。

对照例

贝沙罗汀血浆蛋白结合率的测量

采用如上平衡透析法测量贝沙罗汀的血浆蛋白结合率为98.5％。

实施例1：

贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱的合成(合成路线见图1)

称取2.9mmol贝沙罗汀于50ml单口烧瓶中，量入10ml三氯甲烷搅拌充分溶解。室温下加入1.2mmol CDI混合均匀，反应1～2h，TLC(薄层色谱法)检测跟踪反应进程。加入1.2mmol GPC于反应体系内，滴加2.9mmol DBU，搅拌混合均匀。室温下继续反应48h。TLC显示反应完成后，通过柱层析方法纯化产物，制得贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱，为白色结晶固体，产率80％。

¹H NMR(Bruker DPX 500MHz,CD₃OH)δ7.96(4H,d,J＝0.40Hz),7.35(4H,t,J＝0.40Hz),7.14(4H,m,J＝0.40Hz),5.88(2H,dd,J＝0.40Hz),5.64(1H,m,J＝0.40Hz),5.27(2H,dd,J＝0.40Hz),4.75(1H,dd,J＝0.40Hz),4.62(1H,dd,J＝0.40Hz),4.26(4H,m),3.61(2H,t,J＝0.40Hz),3.20(9H,s),1.92(6H,s),1.74(8H,s),1.30ppm(24H,d,J＝0.40Hz).¹³C NMR(CD₃OD:CDCl₃ 1:1)δ166.37,149.09,146.4,144.35,142.26,137.93,132.54,129.74,128.32,127.96,127.86,126.55,116.71,71.83,66.35,63.70,63.18,59.01,53.89,35.07,33.81,31.60,19.48ppm。MS[M+H]⁺m/z，918.50(计算值918.20)。

采用平衡透析法测量贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱的血浆蛋白结合率为25.2％。

实施例2：

贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱的合成(合成路线见图2)

称取1g(2.9mmol)贝沙罗汀于50ml单口烧瓶中，量入10ml三氯甲烷搅拌充分溶解。室温下加入3mmol DCC混合均匀，反应1～2h。加入2.5mmol己二醇于反应体系内，滴加2.9mmol DMAP，搅拌混合均匀。室温下继续反应48h。通过柱层析方法纯化产物，制得贝沙罗汀己二醇单酯，为白色结晶固体，产率82％。

称取1.6mmol贝沙罗汀己二醇单酯于100mL圆底烧瓶中，加入20mL CH₂Cl₂搅拌使之完全溶解。将充分溶解于10mL CH₂Cl₂中10.0mmol丁二酸酐缓慢加入到贝沙罗汀酰己二醇单酯溶液中，搅拌使反应物混合均匀。室温下反应3～4h，TLC检测跟踪反应进程。TLC显示反应结束后，向圆底烧瓶内加入1.5mmol CDI，室温下反应2h，活化结束。向体系内加入0.4mmol GPC和1.00mmol DBU，继续反应48h。TLC显示反应结束后，通过柱层析方法纯化产物，制得贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱，为白色结晶固体，产率50％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.96(4H,d,J＝0.40Hz),7.35(4H,t,J＝0.40Hz),7.14(4H,m,J＝0.40Hz),5.84(2H,m,J＝0.40Hz),5.35(2H,dd,J＝0.40Hz),5.27(1H,t,J＝0.40),4.73(1H,t,J＝0.40),4.42(2H,t,J＝0.40),4.33(4H,t,J＝0.40Hz),4.13(4H,t,J＝0.40Hz),4.06(1H,t,J＝0.40),3.86(2H,d,J＝0.40),3.51(2H,t,J＝0.40),3.41(9H,s),2.70(8H，dd，J＝0.40)，1.96(6H,s),1.80(4H,t,J＝0.40Hz),1.72(8H,s),1.62(4H,t,J＝0.40Hz)，1.57(8H,s)，1.48(2H，t,J＝0.40),1.30ppm(24H,d,J＝0.40Hz).¹³C NMR(500MHz,CDCl₃)δ172.34,171.90,166.45,149.18,145.50,144.31,142.29,138.02,132.66,129.57,129,23,128.00,126.52,116.67,71.42,66.85,64.74,64.70,63.38,63.30,61.49,59.02,54.36,34.92,33.96,31.90,28.91,28.22,25.69,19.87ppm。MS(ESI-MS,Agilent 1260-6224)[M+H]⁺m/z，1318.70(计算值1317.50)，[M+Na]⁺m/z，1340.68.

采用平衡透析法测量贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱的血浆蛋白结合率为20.2％。

实施例3：

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱的合成(合成路线见图3)

称取1g(2.9mmol)贝沙罗汀于50ml单口烧瓶中，量入10ml三氯甲烷搅拌充分溶解。室温下加入3mmol DCC混合均匀，反应1～2h。加入2.5mmol二硫代二乙二醇于反应体系内，滴加2.9mmol DMAP，搅拌混合均匀。室温下继续反应48h。通过柱层析方法纯化产物，制得贝沙罗汀己二醇单酯，为白色结晶固体，产率75％。

称取1.5mmol贝沙罗汀二硫代二乙二醇单酯于100mL圆底烧瓶中，加入20mL CH2Cl2搅拌使之完全溶解。将充分溶解于10mL CH2Cl2中10.0mmol丁二酸酐缓慢加入到贝沙罗汀二硫代二乙二醇单酯溶液中，搅拌使反应物混合均匀。室温下反应3～4h。向圆底烧瓶内加入1.5mmol CDI，室温下反应2h，活化结束。向体系内加入0.35mmol GPC和1.00mmol DBU，继续反应48h。通过柱层析方法纯化产物，制得贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱，为白色结晶固体，产率58％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.96(4H,d,J＝0.40Hz),7.36(4H,t,J＝0.40Hz),7.14(4H,m,J＝0.40Hz),5.85(2H,m,J＝0.40Hz),5.32(2H,dd,J＝0.40Hz),5.28(1H,t,J＝0.40),4.73(1H,t,J＝0.40),4.33(4H,t,J＝0.40Hz),4.13(4H,t,J＝0.40Hz),4.06(1H,t,J＝0.40),3.51(2H,t,J＝0.40),3.41(9H,s),2.71(8H，dd，J＝0.40)，1.96(6H,s),1.80(4H,t,J＝0.40Hz),1.72(8H,s),1.62(4H,t,J＝0.40Hz)，1.57(8H,s)，1.30ppm(24H,d,J＝0.40Hz).¹³C NMR(500MHz,CDCl₃)δ172.34,171.91,166.45,149.18,145.50,142.29,138.02,132.66,129.57,129,23,128.00,126.52,116.67,71.42,66.85,64.70,63.38,63.30,61.49,59.02,54.36,34.92,33.96,31.90,28.91,28.22,25.69,19.75ppm。MS(ESI-MS,Agilent 1260-6224)[M+H]⁺m/z，1391.90。

采用平衡透析法测量贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱的血浆蛋白结合率为18.4％。

实施例4：

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯二甘醇酰甘油磷脂酰胆碱的合成(合成路线见图4)

称取2.0mmol贝沙罗汀二硫代二乙二醇单酯于100mL圆底烧瓶中，加入20mL CH2Cl2搅拌使之完全溶解。将充分溶解于10mL CH2Cl2中10.0mmol二甘醇酐缓慢加入到贝沙罗汀二硫代二乙二醇单酯溶液中，搅拌使反应物混合均匀。室温下反应4h。向圆底烧瓶内加入3mmol CDI，室温下反应2h，活化结束。向体系内加入0.6mmol GPC和2.00mmol DBU，继续反应48h。通过柱层析方法纯化产物，制得贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯二甘醇酰甘油磷脂酰胆碱，为白色结晶固体，产率52％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.97(4H,d,J＝0.40Hz),7.36(4H,t,J＝0.40Hz),7.14(4H,m,J＝0.40Hz),5.82(2H,m,J＝0.40Hz),5.35(2H,dd,J＝0.40Hz),5.27(1H,t,J＝0.40),4.73(1H,t,J＝0.40),4.42(2H,t,J＝0.40),4.33(4H,t,J＝0.40Hz),4.13(4H,t,J＝0.40Hz),3.41(9H,s),2.70(8H，dd，J＝0.40)，1.96(6H,s),1.80(4H,t,J＝0.40Hz),1.72(8H,s),1.62(4H,t,J＝0.40Hz)，1.57(8H,s)，1.48(2H，t,J＝0.40),1.30ppm(24H,d,J＝0.40Hz)。¹³C NMR(500MHz,CDCl₃)δ172.34,171.90,166.45,149.18,145.50,144.31,142.29,138.02,129,23,128.00,126.52,116.67,71.42,66.85,64.74,64.70,63.38,63.30,61.49,59.02,54.36,34.92,33.96,31.90,28.91,28.22,25.80ppm。MS(ESI-MS,Agilent 1260-6224)[M+H]⁺m/z，1423.85。

采用平衡透析法测量贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯二甘醇酰甘油磷脂酰胆碱的血浆蛋白结合率为16.4％。

实施例5：

贝沙罗汀乙二醇己二酰甘油磷脂酰胆碱的合成(合成路线见图5)

称取1g(2.9mmol)贝沙罗汀于50ml单口烧瓶中，量入10ml三氯甲烷搅拌充分溶解。室温下加入3mmol DCC混合均匀，反应1～2h。加入2.5mmol乙二醇于反应体系内，滴加2.9mmol DMAP，搅拌混合均匀。室温下继续反应48h。通过柱层析方法纯化产物，制得贝沙罗汀乙二醇单酯，为白色结晶固体，产率65％。

称取1.2mmol贝沙罗汀乙二醇单酯于100mL圆底烧瓶中，加入20mL CH2Cl2搅拌使之完全溶解。将充分溶解于10mL CH2Cl2中10.0mmol己二酸酐缓慢加入到贝沙罗汀酰乙二醇单酯溶液中，搅拌使反应物混合均匀。室温下反应3～4h，TLC检测跟踪反应进程。TLC显示反应结束后，向圆底烧瓶内加入1.5mmol CDI，室温下反应3h，活化结束。向体系内加入0.5mmol GPC和1.00mmol DBU，继续反应48h。TLC显示反应结束后，通过柱层析方法纯化产物，制得贝沙罗汀乙二醇己二酰甘油磷脂酰胆碱，为白色结晶固体，产率46％。[M+H]⁺m/z，1264.75。

采用平衡透析法测量贝沙罗汀乙二醇己二酰甘油磷脂酰胆碱的血浆蛋白结合率为12.6％。

实施例6：

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱的合成(合成路线见图6)

称取1.5mmol贝沙罗汀二硫代二乙二醇单酯于100mL圆底烧瓶中，加入20mL CH2Cl2搅拌使之完全溶解。将充分溶解于10mL CH2Cl2中10.0mmol己二酸酐缓慢加入到贝沙罗汀二硫代二乙二醇单酯溶液中，搅拌使反应物混合均匀。室温下反应3～4h。向圆底烧瓶内加入1mmol CDI，室温下反应2h，活化结束。向体系内加入0.4mmol GPC和1.00mmol DBU，继续反应48h。通过柱层析方法纯化产物，制得贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱，为白色结晶固体，产率60％。[M+H]⁺m/z，1447.92。

采用平衡透析法测量贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱的血浆蛋白结合率为16.8％。

实施例7：

贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的制备

取实施例1的贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm滤膜过滤，得贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液。动态光散射法测量粒径138nm。采用平衡透析法测量纳米颗粒的血浆蛋白结合率为8.5％。

实施例8：

贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的制备

取实施例2的贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm滤膜过滤，得贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液。纳米颗粒平均粒径156nm。采用平衡透析法测量纳米颗粒的血浆蛋白结合率为7.2％。

实施例9：

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的制备

取实施例3的贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm滤膜过滤，得贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液。粒径分析结果如下图7(a)，平均粒径140nm，透射电镜测量纳米颗粒的形态如图7(b)

采用平衡透析法测量纳米颗粒的血浆蛋白结合率为5.3％。

实施例10：

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的制备

取实施例6的贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm滤膜过滤，得贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液。纳米颗粒平均粒径162nm。采用平衡透析法测量纳米颗粒的血浆蛋白结合率为5.6％。

实施例11：

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒B的制备

取实施例6的贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱化合物0.1mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 0.4mmol溶于10mL三氯甲烷，60℃旋蒸干溶剂；加入10ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm滤膜过滤，得贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液B。采用平衡透析法测量纳米颗粒B的血浆蛋白结合率为4.2％。

实施例12：

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒C的制备

取实施例6的贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱化合物0.1mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 0.3mmol，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG-叶酸(聚乙二醇分子量2000)0.1mmol，溶于10mL三氯甲烷，60℃旋蒸干溶剂；加入10ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm滤膜过滤，得贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液C。采用平衡透析法测量纳米颗粒C的血浆蛋白结合率为2.2％。

实施例13：

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的制备

取实施例6的贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm滤膜过滤，得贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液。纳米颗粒平均粒径163nm。采用平衡透析法测量纳米颗粒的血浆蛋白结合率为6.5％。

实施例14：

贝沙罗汀偶合物纳米颗粒的还原敏感降解释药性能

将1ml浓度为0.1mg/mL的贝沙罗汀偶合物纳米颗粒溶液(实施例9的贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液、实施例8的贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液、实施例7的贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液)分别加入到10ml的PBS(pH 7.4)溶液、PBS(pH 5.0)溶液、含有3％谷胱甘肽的PBS(pH 7.4)溶液中。放置于37℃的摇床中孵育，72h后用HPLC检测剩余的贝沙罗汀偶合物(贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱、贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱、贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱)的含量和释放出的贝沙罗汀的含量，结果如下表1所示。(采用Agilent 1100高效液相色谱仪测量偶合物或原药浓度：Zorbax SB-C18色谱柱(150mm×4.6mm ID,5μm)，流动相为甲醇/水，97/3，流速为1.0ml min-1，柱温25℃，紫外检测波长254nm，柱温为30℃，检测波长为286nm，进样量为10μL。)

显然，贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液在中性条件下偶合物降解很少，剩余偶合物为90.3％，释放出的原药贝沙罗汀仅为7.5％，只有在弱酸性条件下明显降解，剩余偶合物为30.2％，释放出的原药达到65.2％。

贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液在中性条件偶合物降解比贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱降解快，剩余偶合物为87％，释放出的原药贝沙罗汀达到10.3％；在pH 5弱酸性条件下快速降解，剩余的偶合物仅为15％，释放出的原药达到81.2％。所以，贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱比贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱更易于降解，更有利于在弱酸性的肿瘤细胞内释放原药。

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液具有非常好的还原敏感性，在谷胱甘肽存在下囊泡解体，偶合物快速降解释放出原药，达到97.5％；在pH 5.0的PBS溶液中，该偶合物降解也很快，72小时后仅剩6.5％。在中性条件下，该偶合物比较稳定。所以，贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱具有还原敏感性，更有利于谷胱甘肽浓度较高的肿瘤细胞内降解释放原药。

表1.贝沙罗汀偶合物纳米颗粒体外释药后剩余贝沙罗汀偶合物、释放出的原药含量与时间的关系

实施例15：

贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的细胞摄取

MCF-7细胞分为两组，分别和负载荧光染料Cy 5.5(10μg/ml)的实施例9的贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒溶液和游离的Cy 5.5饱和水溶液共培养3h。然后，用PBS溶液洗涤细胞两次，用4％的多聚甲醛溶液固定细胞，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚在37℃染色15min。用激光共聚焦对细胞进行拍摄。

结果表明，与对照组相比，包裹Cy5.5的贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒实验组具有明显的红色荧光。这说明包裹Cy 5.5的纳米颗粒能很好地被MCF-7细胞摄取。

实施例16：

贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的细胞毒性实验：MTT法人癌细胞杀伤试验

药品及试剂：小牛血清为南京生兴生物技术有限公司产品；DMSO分析纯；RPMI1640为GIBCO产品。

仪器：BIORAD 680型酶标仪。

收集生长良好的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养基配制成1×104/mL细胞悬液，将MCF-7和A549细胞以2×103细胞/孔的密度铺在96孔板中，孵育24h后，加入贝沙罗汀和各种贝沙罗汀偶合物纳米颗粒溶液(见下表)，浓度按等量贝沙罗汀计算分别为1.25,6.25,12.5,18.75和25μM(n＝6)。培养36h和72h后，每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL，RPMI1640配制)，37℃放置4h。然后弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，15min后用酶标仪进行检测(570nm)OD值。同时，以PBS组为空白对照。数据表示为平均数±SD(n＝6)。

细胞抑制率＝(1-实验组吸光度值/空白组吸光度值)×100％

结果计算：以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度(IC50)。

本发明贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒对人肿瘤细胞株的抗肿瘤活性结果如下表2所示。显然，贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒对肿瘤细胞MCF-7细胞和A549细胞具有杀伤性，优于原药贝沙罗汀。贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的IC50值小于贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒，显示更好的杀伤肿瘤细胞作用。贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的IC值远低于前者，更好的细胞毒性主要是由于贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒的二硫键在整理细胞内快速断裂，释放出高浓度的贝沙罗汀，增强了杀伤肿瘤细胞的作用。

表2.本发明化合物对人肿瘤细胞株的抗肿瘤活性结果

MCF-7：人乳腺癌细胞；A2780：人卵巢癌细胞；HCT-8：人结肠癌细胞；A549：人肺腺癌细胞。

实施例17

贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒对β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的大鼠老年痴呆的抵抗作用

材料：雄性Wistar大鼠28只，体重～500g，由东南大学动物实验中心提供，Aβ25-35，美国SIGMA公司。

方法：将28只大鼠随机分为七组：正常组、模型组、假手术组、给药组1(贝沙罗汀)、给药组2(实施例7的贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒)、给药组3(实施例8的贝沙罗汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒)、给药组4(实施例9的贝沙罗汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒)，给药组的剂量相当于等量贝沙罗汀1mg/kg)，5只/组。

Aβ诱导的大鼠老年痴呆模型的建立：将1mg的Aβ25-35干粉溶于500μL无菌生理盐水中，稀释成2μg/μL溶液，置于CO2培养箱在37℃孵育72h，使其充分纤维化并聚集为聚集状态的Aβ25-35，贮存于4℃备用。用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉Wistar大鼠，用剃毛剪剃去大鼠头顶的毛。固定头部，常规消毒后剪开头皮，暴露顶骨，参照大鼠脑立体定位图谱，在顶骨上钻两个小孔以供注射。用微量注射器刺破硬膜，向双侧海马区内5min内各缓慢注射5μL Aβ25-35(2μg/μL)，之后留针5min。注射结束后，缓慢将针拔出，封闭注射孔，最后缝合切口。假手术组注射等量的生理盐水。术后连续肌肉注射青霉素三天，防止感染。

造模手术后第4天开始给药，两天一次，连续35天。给药组按照上述剂量以静脉注射注射方式给药；正常组、假手术组和模型组给予等量的生理盐水。

水迷宫试验：采用Morris水迷宫试验评价大鼠的学习记忆能力。从给药后第31天开始，每天上午10点开始进行Morris水迷宫试验，共计4天，进行定位航行试验。

定位航行试验：定位航行试验持续四次。将平台置于第二象限中心，大鼠依次从四个象限面向池壁入水，记录大鼠在120s内找到平台所用的时间，即逃避潜伏期(EL)。所有登上平台的大鼠应在平台上停留15s，使其认知水下平台为逃生点，并记忆平台的空间位置。计算每组大鼠每天在四个象限的逃避潜伏期平均值，即平均逃避潜伏期。平均逃避潜伏期(AEL)的长短反映了大鼠的学习记忆能力，AEL越短说明大鼠水下平台的空间位置学习认知的越快。

实验结果：水迷宫结果如下表3。正常组与假手术组无明显差别。与正常组相比，模型组第2天至第4天的逃避潜伏期显著延长。

与模型组相比，给药组1的第3天和第4天的平均逃避潜伏期缩短，显示贝沙罗汀有一定药效；给药组4的第3天和第4天的平均逃避潜伏期显著缩短，与正常组相近，显示最好的药效。

表3贝沙罗汀甘油磷脂酰胆碱纳米颗粒对Aβ25-35诱导的老年痴呆大鼠逃避潜伏期的影响

上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。