本发明涉及来自植物活性物质的提取方法及应用领域，具体涉及圆齿野鸦椿提取物在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术：
圆齿野鸦椿（Euscaphis Konishii Hayata，又名福建野鸦椿）为省沽油科野鸦椿属（Euscaphis）植物，别名鸡肫子、鸡眼睛、狗头椒。根据《中国植物志》的记载，我国有2 种省沽油科野鸦椿属植物，为野鸦椿[Euscaphis japonica (Thunb.) Dippel]和福建野鸦椿（圆齿野鸦椿）。
野鸦椿是我国民间一种传统的中草药，已经有良好的药用基础及悠久的历史，主要治疗胃痛、跌打损伤、风湿疼痛、眩晕、泻疾、痢疾。现代药理研究表明，野鸦椿具有抗炎、抗菌、抗肝纤维化和抗细胞增殖作用。2009年8月《时珍国医国药》发表了李先辉等《野鸦椿提取物抗炎镇痛效应的研究》；2013年15期《当代医学》发表了刘迪栋等《野鸦椿水提物对大鼠慢性肝纤维化的影响》；2007年LEE MK等在《Planta Medica》上发表了《Inhibitory constituents of Euscaphis japonica on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in BV2 microglia》，从野鸦椿地上部分用无水甲醇提取得到的三萜化合物，能够显著抑制肝星形状细胞（HSC）的增殖；2009年LEE MK等又在《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal》上又发表了《Antifibrotic activity of triterpenoids from the aerial parts of Euscaphis japonica on hepatic stellate cells》，发现野鸦椿中的三萜化合物具有抗肝纤维化作用；2008年《癌变• 畸变• 突变》发表了左敏等《野鸦椿对HeLa细胞的抗增殖作用及其机制的初步研究》；2010年《Journal of Natural Products》发表了CHENG J J等《Cytotoxic Hexacyclic Triterpene Acids from Euscaphis japonica》从野鸦椿分离出来的六环三萜化合物有明显的细胞毒作用。圆齿野鸦椿目前主要用于观赏植物，对其药用价值的研究不多。
肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一，严峻的形势对国人的健康和社会经济带来严峻的挑战。流行病学研究表明，肝癌的发生发展多由遗传和环境因素相互作用，是一个多诱因、多基因参与、多步骤调控的复杂过程。目前普遍观点认为肿瘤是慢性炎症消退失败的结果，而肝癌与慢性肝炎密切相关。当前肝癌的治疗主要有根治性切除和药物介入等手段。根治性切除术后，早期肝癌患者5年生存率显著延长，但复发转移仍是肝癌根治术的主要问题。药物介入目前有靶向治疗和抗病毒治疗。靶向治疗主要通过酪氨酸激酶抑制剂（如索拉菲尼Sorafenib等），抑制肝细胞表面表皮生长因子受体EGFR及其下游信号通路蛋白表达，从而抑制肿瘤细胞生长和血管生成，能显著抑制术后肿瘤的复发和转移，然而该类药物价格昂贵且服用一段时期后可引起耐药；而抗病毒治疗多以干扰素及核苷类药物为主，干扰素能够抑制病毒复制，但难以清除病毒，核苷类药物可抑制HBV-DNA逆转录酶活性，但同样容易产生耐药性，停药后易产生“反跳”现象，治疗效果有限。因此，提供圆齿野鸦椿制备抗肝癌药物的用途具有重要意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供圆齿野鸦椿在制药中的新用途。
上述新用途具体是，圆齿野鸦椿提取物在制备抗肝癌药物中的应用。
上述应用中，所述的圆齿野鸦椿提取物是以圆齿野鸦椿为原料的醇提物及其进一步的提取物，可采用本领域常用的方法提取得到。
本发明的技术方案如下：
取圆齿野鸦椿植物体，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。取植物体粉末，加5-20倍体积浓度为10%-95%的乙醇加热至50-95℃回流提取两次，每一次提取1-3小时，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿醇提物。
本发明的有益效果在于：
本发明的圆齿野鸦椿提取物，对人肝癌细胞HepG2和BEL-7404具有明显的抑制作用，并对小鼠肝癌H22移植瘤模型具有显著的肿瘤抑制作用，可用于制备抗肝癌药物。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
下述实验用圆齿野鸦椿（Euscaphis Konishii）来源于福建省邵武市天成岩。
实施例1
取干燥的圆齿野鸦椿果皮，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加10倍体积浓度为95%的乙醇加热至80℃回流提取两次，每一次提取2小时，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿果皮醇提物。
实施例2
取干燥的圆齿野鸦椿枝条，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加10倍体积浓度为95%的乙醇加热至80℃回流提取两次，每一次提取2小时，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿枝条醇提物。
实施例3
取干燥的圆齿野鸦椿叶片，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加10倍体积浓度为95%的乙醇加热至80℃回流提取两次，每一次提取2小时，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿叶片醇提物。
实施例4
取干燥的圆齿野鸦椿种子，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加10倍体积浓度为95%的乙醇加热至80℃回流提取两次，每一次提取2小时，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿种子醇提物。
采用人肝癌细胞HepG2和BEL-7404，研究圆齿野鸦椿提取物的体外抗肝癌效果。具体实验方法如下：
人肝癌细胞HepG2和BEL-7404培养条件为含有胎牛血清（GIBOCO,体积分数为10%）、青霉素（Thermo Fisher,1×105 IU•L-1）和链霉素（Thermo Fisher,100 mg•L-1）的DMEM培养液(Thermo Fisher)，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱(Thermo Fisher)中培养，取对数生长期细胞用于试验。在96孔培养板上接种细胞，接种量为5×103个细胞/孔，每孔180μL，实验组分别加入不同浓度的药物，对照组不加药，另设空白孔组（只加培养基，无细胞），每组设3个平行孔，37℃培养至所需的时间，加入5 g•L-1的MTT溶液20 µL/孔，继续培养4 h后，弃去上清，加入150µL DMSO溶解，培养箱孵育20 min后，用酶标仪（Thermo公司）在570 nm波长下测吸光度值（OD值）。根据吸光度计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（OD对照-OD实验）/(OD对照-OD空白)×100%。
以同一药物的不同浓度对细胞生长抑制率作图，可得到剂量反应曲线，根据线性回归方程求出该药的半数抑制浓度IC50，即细胞存活率减少50%时的药物浓度。实验数据以 ±S（均数 ± 标准差）表示，统计分析采用SPSS16.0统计软件，以P<0.05时，判断组间差异具有统计学意义。
实验结果如下表所示。
上述实验结果表明本发明所述圆齿野鸦椿各提取物对肝癌细胞HepG2和BEL7404均有明显的增殖抑制作用，其中果皮提取物的抑制作用最为明显。
采用H22小鼠肝癌移植瘤模型来考察圆齿野鸦椿提取物的体内抗肿瘤效果。具体实验方法如下所述。
普通级昆明种小鼠，体重18-22g,，均为雄性小鼠，由福建医科大学实验动物中心提供。H22细胞培养条件为含有胎牛血清（GIBOCO，体积分数为10%）、青霉素（Thermo Fisher,1×105 IU•L-1）和链霉素（Thermo Fisher,100 mg•L-1）的1640培养液(Thermo Fisher)，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱(Thermo Fisher)中培养，取对数生长期细胞用于试验。取2-3只小鼠腹腔注射H22细胞1×107个•mL-1，在腹腔传代6~8d。取生长良好的乳白色腹水，用生理盐水稀释至1×107个•mL-1。将其余小白鼠随机分组，每组6只，以0.2ml接种于小鼠右腋皮下，构建小鼠肝癌H22移植瘤模型，于接种24h后开始灌胃给药。圆齿野鸦椿各提取物浓度为200mg•Kg-1, 用生理盐水配成混悬液进行给药，对照组给予生理盐水，阳性对照组给予5-氟尿嘧啶（5-Fu）20 mg•Kg-1，每天一次，连续14d，于第15d称体重，颈椎脱臼处死动物。剥离肿瘤组织，用滤纸吸干后称重。计算肿瘤抑瘤率。
抑瘤率=（1-实验组瘤重/对照组瘤重）×100%
实验数据以±s（均数 ± 标准差）表示，统计分析采用SPSS16.0统计软件，以P<0.05时，判断组间差异具有统计学意义。
实验结果如下表所示。
上述实验结果表明本发明所述各提取物对H22小鼠肝癌移植瘤模型有明显的抑制作用，且果皮提取物对H22小鼠肝癌移植瘤模型的抑制效果最为明显。各提取物均可用于制备抗肝癌的治疗和预防药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。